对城市环境进行拭子采样——从环境储存库中采样与检测 SARS-CoV-2 的流程

本研究提出了一种新工作流程，用于检测城市环境中很少清洁的表面（如加油泵手柄、游乐场设施和自动取款机）上的严重急性呼吸综合征冠状病毒2（SARS-CoV-2）。在大流行期间，物资供应稀缺。我们采用易于获取的材料、试剂以及基础实验室配备的设备。

我们采用一种无需冷链即可保存RNA的提取方法，以及一种抗抑制剂的检测方法。该方案具有公共卫生意义，为评估当前新冠肺炎大流行及其他传染性病原体在未来全球暴发期间的环境病毒储存库提供了一个框架。

通过本地媒体和社交媒体发布明确直接的行动号召，招募公民科学家。创建社交媒体账号，以统一关联各社交媒体平台上的相关内容。创建通往SMP的链接，并提供多语言插件，使参与者可通过在线表格回答生物安全相关问题，以多种语言申请参与环境采样工作。

在采样部分包含英文和西班牙文的图形及音视频方案。利用由云服务提供商支持的地理空间应用程序编程接口（API）可视化地理空间数据。通过采样管理平台（SMP）将提交至实验室信息管理系统（LIMS）的数据进行存储，以实现数据的集中存储、处理流程的追踪以及物流管理。

预先加载样本试剂盒编号、样本编号、日期、时间以及全球定位系统坐标等信息，以确保数据类型的合规性并最大限度减少误差。为参与者提供样本收取请求链接，以便他们在收集完所有样本后使用。构建一个包含所有采样用品的试剂盒，包括必要的个人防护装备（如口罩和手套）、采样操作规程以及与生物安全相关的信息。

用含有洗涤剂的湿润聚酯吸收拭子（1平方厘米）擦拭10平方厘米的家庭或城市环境中很少消毒的表面。借助牙签，将每个采样拭子浸入预先标记的含有200 µL硫氰酸胍的离心管中。每次采集样本时，佩戴提供的口罩和一副新手套，以避免交叉污染。

采样结束后，使用提供的洗手液进行手部消毒。将采样管置于4°C保存，直至转运至实验室。样本到达实验室后，应于-80°C保存。

为了提高筛查速度，将样本以混合池的方式进行处理。如果某个样本池结果为阳性，则对池中每个样本单独提取RNA。将每个采样套件中的8个样本各取50微升混合至一个微量离心管中，组成两个样本池，其余样本保存于负80摄氏度环境中。

加入 80 µL 氯仿，涡旋振荡 15 秒。然后在 4 °C 下孵育 20 分钟。在 4 °C 下以 13,000 ×g 离心 20 分钟。

将水相转移至新的微量离心管中。将剩余的界面层和粉红色液体保存在负80摄氏度的冰箱中。这些组分含有DNA和蛋白质。

使用基于硫氰酸胍的RNA粗提取方法从回收的水相层中提取RNA。在室温下配制RT-LAMP反应体系，总体积增加10%以补偿移液过程中的损失。向样本反应中加入5 µL RNA，向加标反应中加入5 µL RNA和2.5 µL合成的SARS-CoV-2 RNA。

向阳性对照中加入 2.5 µL 合成的 SARS-CoV-2 RNA，向阴性对照中加入 5 µL 水。充分混匀并离心收集反应液。进行比色观察时，阴性结果呈粉红色，阳性结果呈黄色。

RT-LAMP反应后，进行凝胶电泳。样本采集位点的分布情况如图所示。大多数试剂盒是完整的，相应数据已上传至实验室信息管理系统（LIMS）。

在100%频率下的检测限为每25微升反应体系中500个拷贝。在比色RT-LAMP中，由于pH值从8降至5.5，阳性样本的颜色由粉红色变为黄色。在拷贝数较低时，需将样本进行琼脂糖凝胶电泳，以确认阳性结果并观察到梯状条带模式。

采用环境样品对实时定量PCR方法进行了测试。所有预混液在阳性对照低拷贝数浓度下均对抑制剂敏感。在模板浓度较低时，传统的实时PCR方法出现了假阳性与假阴性结果。

最后，一种称为滚环扩增的技术可检测到少量的目标序列。然而，该方法在无RNA模板的情况下也出现了探针的扩增。至关重要的是要发布一项呼吁行动，覆盖社区的所有部门，以确保采样能够真正代表该社区所有成员的暴露风险。

该框架可检测 SARS-CoV-2 的遗传物质。下一步将是开展测试病毒活性的研究。