神经节苷脂提取、纯化和分析
2021年3月12日
神经节苷脂是含唾液酸的鞘糖脂，在大脑中特别丰富。它们的两性性质需要有机/水提取和纯化技术，以确保最佳的回收率和准确的分析。本文概述了分析和制备规模的神经节苷脂提取，纯化和薄层色谱分析。
神经节苷脂在所有脊椎动物细胞表面表达，在神经细胞上特别丰富。它们调节细胞信号传导和细胞间识别。该方案引入了神经节苷脂分离和分析。
选择这些技术是为了最大限度地提高大尺度和小尺度的神经节苷脂产量，同时简化纯化。我们还描述了相对快速地进行定性和半定量性神经节苷脂分析的方法。对脂质的研究，特别是像神经节苷脂这样的极性脂质，需要与处理蛋白质或核酸不同的工具和技术。
本视频将让您熟悉如何使用这些分子。由于氯仿和四氢呋喃等溶剂可溶解普通塑料，因此我们在整个过程中使用带有特氟龙衬盖的玻璃瓶和小瓶，玻璃移液器，玻璃，不锈钢微量注射器和特氟龙玻璃均质机。如果不这样做，产品中的塑料聚合物可能会干扰分析。
首先，每克组织湿重加入4.1毫升水，并用10次笔触使其均质化。每克组织加入13毫升甲醇。将其转移到22摄氏度的环境温度，然后混合。
将组织转移到带有PTFE衬里螺旋盖的厚壁，玻璃，螺旋盖的管中，并彻底混合。每克组织加入6.5毫升氯仿，盖上盖子，然后充分混合。以450次g离心15分钟。
然后将透明上清液转移到新的螺旋盖管中，并将体积测量为恢复的提取物体积。对于分区，向清清液中加入0.173倍于回收的提取物体积的水。然后盖上盖子。
剧烈涡旋。以450次g离心15分钟。将含有神经节苷脂的上相转移到带有PTFE衬里螺旋盖的新鲜玻璃管中。
要进行反相墨盒色谱分析，请使用5毫升玻璃注射器洗涤带有3毫升甲醇的tC18固相萃取盒。然后以2~43~55的比例加入三毫升氯仿-甲醇-水。通过相同的玻璃注射器将上一步的上相加载到tC18墨盒上。
收集流出物，并将其重新加载到色谱柱上以优化吸附。用三毫升氯仿 - 甲醇 - 水洗涤墨盒，然后用三毫升甲醇水清洗。用三毫升甲醇洗脱神经节苷脂到一个新鲜的螺旋盖管中。
在温度小于或等于45摄氏度的温和氮气流下蒸发至干。以每克原始组织湿重一毫升溶解在甲醇中。将100克脑灰质放入搅拌机中，每克脑湿重加入一毫升，冷却后，10毫摩尔磷酸钾缓冲液pH值为6.8。
然后在低位均质20秒。每克脑湿重加入8毫升四氢呋喃，并在低浓度下匀浆10秒。倒入玻璃离心机瓶中，以5， 000 g离心15分钟。
收集上清液，测量其体积，然后将其转移到玻璃分离漏斗中。每毫升上清液加入0.3毫升乙醚。用力摇晃。
然后让它不受干扰地静置30分钟，在此期间，两个相，一个上以太相和一个下水相，分开。将含有神经节苷脂的下相收集到带有PTFE衬里盖的玻璃瓶中。向分离漏斗中剩余的上醚相，每毫升原始上清液加入0.1毫升水。
用力摇晃。允许阶段分开。然后收集下层水相，并将其与先前收集的下相混合。
将组合的下相蒸发成干粉，然后称重。要进行反相色谱，每次洗涤时使用真空或压力将50毫升溶剂通过柱中少于一分钟，从而预洗大型tC18固相萃取盒。通过真空或压力将皂化后相分离的上相加载到色谱柱上。
然后收集流出，重新加载，并再次收集流出以进行后续分析。用氯仿 - 甲醇 - 水各30毫升洗涤色谱柱，然后用甲醇水洗涤。然后用50毫升甲醇洗脱神经节苷脂，然后再次用10毫升甲醇洗脱。
分别收集每个洗涤物和洗脱液。使用薄层色谱法或TLC来确认流出中没有神经节苷脂，并在甲醇的第一次洗脱中洗涤和洗脱。将洗脱的神经节苷脂蒸发成干粉，并称量它们。
要进行TLC，请将运行溶剂倒入带有不锈钢盖的10×10厘米玻璃TLC室中，使溶剂深度为0.5厘米。盖上腔室，让它平衡约10分钟。用甲醇用斜针清洗10微升汉密尔顿注射器。
将一微升甲醇吸入玻璃注射器中以填充针头死体积，然后填充一微升样品或标准品。将样品均匀地点在五毫米的预标记线上，直到注射器中残留不到一微升的甲醇溶剂。发现所有样品后，让板在22摄氏度下干燥。
将斑点和干燥的板放在预平衡的TLC室中，底部边缘浸入运行溶剂中。让运行的溶剂通过毛细管作用向上推进板，直到溶剂前端到达板顶部一厘米以内。取下并用铅笔标记板边缘的溶剂前部。
让溶剂完全不受干扰地蒸发或在温和的气流下蒸发。在化学通风橱中，将具有已解决的神经节苷脂起源端的TLC板倒置在一个切开的纸板箱中，以保护烟罩壁免受酸性喷雾。将间苯二酚喷雾试剂置于玻璃TLC喷雾器中。
将其连接到加压氮气源上，并在垂直和水平方向上对角线轻轻喷洒板。立即用相同尺寸的干净、干燥的玻璃盖板，并用活页夹将盖板固定到位。将盖板在125摄氏度下加热20分钟。
神经节苷脂在白色背景上呈现深紫色。要进行脂质染色，将具有解析的神经节苷脂来源的TLC板面向下浸入含有茴香醛染色剂的烧杯中。浸入跑步前方两秒钟多一点。
然后让它排出。在低温下加热热板上的TLC板以显影。该方案提供足够数量和纯度的神经节苷脂，用于定性和定量测定。
一微升的TLC分辨率为间苯二酚检测提供了充足的材料，并解决了野生型和转基因小鼠的所有主要脑神经节苷脂。虽然制备的混合神经节苷脂并非不含其他主要脂质，但它们具有足够的纯度，可以作为阴性模式下的天然纯化神经节苷脂或在阳性模式下预甲基化后进行质谱测定。大规模纯化包括提取、皂化和HPLC分辨，以提供纯化的主要脑神经节苷脂，适用于生物实验以及进一步的化学和酶促修饰。
显示了示例性的HPLC曲线和随后的TLC分析。碱处理或皂化对于水解和去除污染性磷脂是必要的，但也将水解神经节苷脂的自然修饰，如O-乙酰化唾液酸，这在某些情况下可能很重要。用于萃取、溶剂分配和 TLC 分辨的精确溶剂比率对于提高回收率、纯度和分析至关重要。
从癌症到新陈代谢再到脑功能，神经节苷脂是生理修饰剂和治疗靶点。神经节苷脂分离、纯化和分析是生物医学发现和治疗开发的基石。
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概述
神经节苷脂是大脑中丰富的糖鞘脂，对细胞信号传导和识别至关重要。本文介绍了提取、纯化和分析神经节苷脂的方法。
关键研究组成部分
科学领域
- 神经科学
- 生物化学
- 细胞生物学
背景
- 神经节苷脂存在于脊椎动物细胞表面，尤其是神经细胞。
- 它们在调节细胞信号传导中起着重要作用。
- 神经节苷脂的分离和分析需要专门的技术。
- 脂质研究与蛋白质或核酸相比需要不同的方法。
研究目的
- 介绍有效的神经节苷脂分离和分析协议。
- 在不同规模上最大化神经节苷脂的产量。
- 简化纯化过程以提高效率。
使用的方法
- 有机/水性提取技术。
- 针对神经节苷脂定制的纯化方法。
- 用于分析的薄层色谱法。
- 定性和半定量分析方法。
主要结果
- 使用所描述的方法有效回收神经节苷脂。
- 简化的纯化技术产生更高质量的样品。
- 分析方法提供可靠的定性和定量数据。
- 对神经节苷脂在细胞信号传导中的作用有深入了解。
结论
- 这些协议提高了神经节苷脂研究的效率。
- 理解神经节苷脂有助于更广泛的神经科学研究。
- 未来的研究可以在这些方法的基础上进行进一步探索。
常见问题
Executive Industry Relevance
Ganglioside isolation and analysis enable mechanistic de-risking in neuroscience target validation by providing purified bioactive lipids for functional assays. These methods support preclinical model development and biomarker discovery in neurodegenerative and oncological indications. Reliable ganglioside profiling enhances predictive confidence in lead identification and pathway modulation studies.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of ganglioside-mediated signaling pathways in target hypothesis testing.
- Operational Value: Provides purified lipid fractions for receptor-ligand interaction studies and pathway deconvolution.
- Predictive Value: Supports functional validation of ganglioside-associated targets in disease-relevant cellular contexts.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Delivers quantitatively resolvable ganglioside species for assay standardization and cross-lot consistency.
- Operational Value: Enables scalable preparation of lipid extracts for high-throughput screening ganglioside-dependent phenotypes.
- Assay Readiness: Generates purified material suitable for TLC, MS, and functional readouts in lipid-focused screening campaigns.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Supports biomarker alignment by linking ganglioside expression profiles to disease models.
- Preclinical Model Relevance: Provides purified gangliosides for dosing and challenge studies in genetically modified systems.
- Mechanistic De-risking: Enables structure-activity analysis of ganglioside variants in target engagement and toxicity profiling.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within early discovery workflows, supplying purified gangliosides for target engagement assays and phenotypic screening downstream of target identification.
- Discovery Biology: Supports lipid-mediated pathway clarification and target validation in neurovascular and oncological models.
- Screening: Enables reproducible ganglioside extraction for assay development in lipid-dependent signaling pathways.
- Analytics: Provides qualitative and semiquantitative outputs for comparing ganglioside abundance across experimental conditions.
- Translational Research: Connects ganglioside profiles to preclinical disease models for biomarker-guided advancement.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable lipid preparation platform for cross-project ganglioside analysis in neuroscience and cancer programs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Reduces mechanistic ambiguity in lipid-target interactions and signaling cascade validation.
- Operational Value: Standardizes extraction and purification across scales, improving batch-to-batch consistency.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by de-risking lipid-dependent targets early in discovery.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of ganglioside-modulating compounds based on purified lipid activity.
Implementation Considerations
- Requires expertise in lipid handling and organic solvent safety due to chloroform and THF use.
- Necessitates glass and Teflon-lined instrumentation to prevent polymer contamination.
- Demands standardized solvent ratios and centrifugation protocols for reproducible ganglioside recovery.
- Requires adaptation of TLC and MS protocols for ganglioside detection and quantification.
- Limited by solvent compatibility constraints, necessitating glassware throughout extraction and purification.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:04
Introduction
1:36
Small Scale Ganglioside Extraction and Partial Purification
3:35
Large Scale Ganglioside Extraction and Purification
5:52
Ganglioside Resolution and Staining
8:02
Results: Small and Large Scale Ganglioside Extraction and Partial Purification
9:18
Conclusion
