Name: 超快力钳谱分析合成性肌球蛋白的机械酶学特性 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-07-01T13:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 38 s
Description: 了解超快力钳光谱技术用于研究肌球蛋白机械酶学特性。该方法利用激光光镊在单分子水平精确控制力的大小和方向，实时观测马达蛋白与肌动蛋白的相互作用动态。

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本工作得到了欧盟“地平线2020”研究与创新计划（资助协议号：871124 Laserlab-Europe）、意大利大学与研究部（FIRB“未来研究”2013年项目，资助号：RBFR13V4M2）以及佛罗伦萨储蓄银行基金会的资助。A.V. Kashchuk 获得了人类前沿科学计划跨学科博士后奖学金（LT008/2020-C）的支持。

1. 光学装置
注意：实验装置由具有纳米级指向稳定性的双光镊组成， &lt; 1% 的激光强度波动。在这些条件下，哑铃形样品在典型的捕获刚度（0.1 pN/nm）和张力（1 pN 至数十 pN）下，可保证达到纳米级的稳定性。 图2 展示了光学装置的详细示意图。
<ol>
	<li>光镊的设计与构建 9,10,11.
	<ol>
		<li>根据示意图将装置的所有组件放置于光学平台上 图2请注意，光学平台配有主动隔振器，以最大限度减少机械振动。此外，显微镜结构安装在弹性隔振器上，以吸收声学噪声和机械共振。</li>
		<li>在激光源附近插入一个光学隔离器（“OI”在 图2），以避免因光学反馈导致的随机振幅波动。</li>
		<li>将整个光路密封在封闭箱体内，以减少气流和湍流对激光指向稳定性的影响。</li>
		<li>通过将主激光源（Nd:YAG激光器，1,064 nm波长）分束，构建双光镊系统 图2) 利用偏振分束器（PBS）将其分为两束具有正交偏振的光路。应避免使用时分复用光阱，因为它们会在张力下引起哑铃形微粒的振荡12.</li>
		<li>使用两个声光偏转器（AOD） 图2) 由直接数字频率合成器（DDS）驱动，以实现对两个光镊的精细且快速的移动，并通过现场可编程门阵列（FPGA）板的数字输出直接控制DDS，从而精确调节肌动蛋白张力（见 图2). 
		注意：整体反馈响应时间必须 &lt;10 µs 在测量过程中（包括无结合状态、肌球蛋白相互作用及运动状态），快速校正并保持两个光镊上受力恒定。为此，位置探测器必须具备 &gt;= 100 kHz 带宽，且数据必须以 &gt;= 200 kHz 采样率。对每个采集的数据点（5 µs 采集时间），FPGA 会计算针对两个陷阱的比例校正，并将其发送至驱动声光偏转器（AOD）的两个直接数字频率合成器（DDS）。AOD 的响应时间必须低于 5 µs 以满足所需的反馈响应时间。</li>
		<li>为检测被捕获微珠位置的纳米级位移，放置两个四象限光电二极管探测器（QPD）在 图2) 位于聚光镜的后焦平面。将四象限光电探测器（QPDs）精确对准与聚光镜后焦平面共轭的平面，以及将声光偏转器（AODs）对准与物镜后焦平面共轭的平面，可确保QPDs信号不受AODs频率的影响。</li>
		<li>将AOD安装在带有千分尺驱动的线性位移台上，并移动位移台，直至晶体边缘接近激光光束。然后，用安装在螺纹物镜筒中心位置的可调光阑替换物镜，并调节其孔径，使其与物镜后孔径尺寸相匹配。</li>
		<li>将平移台向激光束方向移动，直至在光阑后方可观察到压电晶体遮挡的光束部分，然后将平移台略微向后转动，使光束重新完全充满光阑孔径。</li>
		<li>对第二个AOD重复步骤1.1.7-1.1.8。通过在盖玻片表面固定微球上快速移动光束，并测量QPDs的响应延迟，来检测反馈回路的响应时间13. 
		注意：上述三个步骤（1.1.7–1.1.9）可实现AOD晶体的精确对准。这些步骤对于优化光束偏转及反馈系统的时间响应至关重要。13.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>使用光电二极管测量显微镜入口处捕获激光的光强波动，其波动幅度必须低于1%。注意，光电二极管的带宽必须大于成像速率。</li>
	<li>检查两个光阱的指向稳定性。
	<ol>
		<li>在磷酸盐缓冲液（PB）中稀释二氧化硅珠以进行制备 20 µL 二氧化硅珠1.2 µm，10% 固形物）加入 1 mL 丙酮中，超声处理 30 秒，短暂涡旋，然后在 19,000 x g.</li>
		<li>去除上清液，加入1 mL丙酮重悬，重复洗涤一次。用1 mL 50 mM PB重悬，洗涤2次。最后用 100 µL 50 mM PB 溶液</li>
		<li>使用双面胶带将盖玻片粘附到显微镜载玻片上，利用二氧化硅微珠进行光镊校准（约 60 µm 厚）以构建流室。向室中加入1 mg/mL BSA（牛血清白蛋白）并静置3分钟。</li>
		<li>将1:1000稀释的二氧化硅微珠悬浮液通入PB缓冲液中的样品室。用装有硅脂的注射器小心密封样品室。在每个光镊中捕获单个微珠，并应用功率谱方法。14 进行校准。</li>
		<li>在室温下，将二氧化硅微珠溶于乙酸戊酯中进行制备 20 µL 二氧化硅珠1.2 µm 直径，10% 固体）加入 1–1.5 mL 丙酮中，涡旋并超声处理 30 秒。</li>
		<li>在 18,500 x g 条件下离心 g 2 分钟。弃去上清液，加入 1 mL 丙酮重悬，然后重复洗涤一次。用 1 mL 戊酸酯重悬，再用戊酸酯重复洗涤（离心和重悬）2 次。将沉淀物重悬于 100 µL 1% 硝酸纤维素 900 µL 戊酸乙酯。储存于 4 °C 2个月。</li>
		<li>取一块 24 x 24 mm 的玻璃盖玻片，用浸有纯乙醇的纸小心擦拭清洁。然后用洁净的镊子夹住盖玻片，再用纯乙醇直接冲洗一次。在氮气 gentle 气流下使其干燥。如有需要，可重复此操作以去除玻璃表面所有可见残留物。</li>
		<li>取二氧化硅珠原液，涡旋混匀后短暂超声处理约30秒。</li>
		<li>清洁第二块盖玻片（24 × 60 mm）后，用其进行涂布 2 µL 在盖玻片的一侧表面加入二氧化硅微珠溶液，并等待其干燥。</li>
		<li>仔细清洁将用于构建流动室的载玻片（26 × 76 mm）。</li>
		<li>裁剪两条双面胶带（约3 mm宽，60-100 µm 厚）并将其附着在载玻片的一侧，如图所示 图3.</li>
		<li>使用洁净的镊子合上腔室（约 20 µL 最终体积）：将包被的盖玻片（1.3.9）与粘性胶带线条接触，使硝酸纤维素+微珠层朝向腔室内部，如图所示 图3a用50 mM磷酸缓冲液填充流式室，并用硅脂密封。</li>
		<li>在明场显微镜下观察单个二氧化硅微球 &gt;使用电荷耦合器件（CCD）或互补金属氧化物半导体（CMOS）相机进行200倍放大 &gt;1.4 兆像素。使用反馈软件移动压电平台（精度达到或优于纳米级），以补偿热漂移10.</li>
		<li>将左侧光阱的中心与微珠的中心重合（QPD的x-y信号水平应与校准值一致）。然后测量该光阱的位置噪声及位置信号的标准差。</li>
		<li>对右侧捕获装置重复上一步骤15.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>陷阱位置校准：兆赫兹到纳米
	<ol>
		<li>制备一个流动腔，其中盖玻片表面附着有二氧化硅微珠（1.3.5-1.3.12），并加入悬浮的聚苯乙烯微珠（使用如下第2.1节中制备的α-辅肌动蛋白偶联微珠）。</li>
		<li>将石英珠略微偏离中心地聚焦在盖玻片表面（约~5 µm) 从视野（FOV）中心开始，获取该视野的图像。移动微珠以 10 µm 使用压电载物台将视野移向视场中心，并采集第二幅图像。利用质心算法或类似方法计算两幅图像中微珠的中心位置，计算两个微珠之间的像素距离，从而获得明场相机的纳米/像素校准值。</li>
		<li>使用一个光阱捕获单个悬浮微粒。然后，通过声光偏转器（AOD）以小步长（0.2 MHz）移动光阱，并在每一步采集微粒的图像及对应的AOD频率。采用之前使用的质心算法计算微粒在视场中的位置，并利用上一步获得的nm/像素校准系数将其转换为纳米单位。</li>
		<li>对频率-位置数据进行线性拟合，并计算校准常数，单位为 nm/MHz。</li>
		<li>对第二个捕获区域重复校准</li>
	</ol>
	</li>
	<li>陷阱功率与刚度校准（MHz 对 W），QPD（MHz 对 pN/nm）
	<ol>
		<li>制备一个流动腔，其中盖玻片表面固定有二氧化硅微珠（1.3.5–1.3.12），并加入悬浮的聚苯乙烯微珠（使用如下第2.1节中制备的α-辅肌动蛋白偶联微珠），用光镊捕获单个微粒，并将其固定在一个捕获点。随后通过声光偏转器（AOD）以小步长（0.2 MHz）移动两个捕获点，利用四象限光电探测器（QPD）记录该微粒在两个捕获点中的布朗运动，同时记录对应的AOD频率。</li>
		<li>在每个位置计算探测器上的平均功率，并通过对记录的布朗运动功率谱拟合洛伦兹函数，获得捕获刚度和QPD校准常数β13.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 样品制备
<ol>
	<li>制备α-肌动蛋白结合荧光微球
	<ol>
		<li>进行偶联16：取氨基功能化的聚苯乙烯微球（直径1 µm，固含量2.5%），用500 μL蒸馏水洗涤两次，重悬于500 μL PBS（pH 7.0）中。加入1 mM HaloTag 琥珀酰亚胺酯O2配体，室温孵育1 h。用500 μL PBS洗涤三次，重悬于100–200 µM HaloTag α-肌动蛋白溶液中。37 °C孵育1 h，再用500 μL PBS洗涤三次（微球可在1.5周内使用，或在液氮中速冻后于−80 °C保存）。</li>
		<li>标记：将200 µL微球溶液与罗丹明-BSA在终浓度5 µg/mL条件下孵育10 min。用50 mM PB洗涤三次，重悬于500 µL 50 mM PB中（可分装后于−80 °C保存数月）。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>按照先前描述的方法表达并纯化生物素化的肌球蛋白-5B4,17。</li>
	<li>聚合并标记F-肌动蛋白13：
	<ol>
		<li>F-肌动蛋白聚合：混合69 µL超纯水、10 µL 10倍肌动蛋白聚合缓冲液（100 mM Tris HCl，20 mM MgCl2，500 mM KCl，10 mM ATP，50 mM 瓜氨酸碳酸盐，pH 7.5）、20 µL 10 mg/mL G-肌动蛋白和1 µL 1 M 二硫苏糖醇（DTT）。冰上静置超过1 h。</li>
		<li>用罗丹明标记F-肌动蛋白（激发/发射波长：546/575 nm）：取25 µL聚合后的F-肌动蛋白，加入19.5 µL超纯水、2.5 µL 10倍肌动蛋白聚合缓冲液（100 mM Tris HCl，20 mM MgCl2，500 mM KCl，10 mM ATP，50 mM 瓜氨酸碳酸盐，pH 7.5）、1 µL 1 M DTT和2 µL 250 µM 罗丹明鬼笔环肽。冰上过夜孵育。用于捕获实验时，罗丹明标记的F-肌动蛋白可在冰上保存并在一周内使用。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>样品组装
	<ol>
		<li>取流动池（1.3.5–1.3.12），加入1 mg/mL生物素化BSA孵育5 min。用AB缓冲液（25 mM MOPS，25 mM KCl，4 mM MgCl2，1 mM EGTA，1 mM DTT，pH 7.2）洗涤后，加入1 mg/mL链霉亲和素孵育5 min，再次用AB缓冲液洗涤。在M5B缓冲液（10 mM MOPS pH 7.3，0.5 M NaCl，0.1 mM EGTA，3 mM NaN3）中加入3 nM生物素化的肌球蛋白-5B重酶解肌球蛋白和2 µM钙调蛋白（CaM），孵育5 min。用含2 µM CaM的1 mg/mL生物素化BSA AB缓冲液洗涤三倍体积，孵育3 min。</li>
		<li>在孵育期间配制反应混合液（RM）：在成像缓冲液（IB：AB缓冲液含1.2 µM葡萄糖氧化酶、0.2 µM过氧化氢酶、17 mM葡萄糖、20 mM DTT、2 µM CaM，以及实验所需浓度的ATP）中加入0.005% α-肌动蛋白功能化微球（第2.1节）和1 nM罗丹明F-肌动蛋白（第2.3节）。</li>
		<li>用RM洗涤流动池，并用硅脂密封。样品现已准备好可在显微镜下观察。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. 测量
<ol>
	<li>组装哑铃。
	<ol>
		<li>使用长距离平移装置移动样品，寻找悬浮的 α-actinin 微珠，开启一个光镊并捕获其中一个微珠。</li>
		<li>第一个捕获位点被捕获后，移动移液器使被捕获的微球靠近盖玻片表面，以避免多个微球被捕获，随后在第二个捕获位点捕获另一微球。</li>
		<li>通过调节声光偏转器（AOD）声波的功率，将两个光镊调整至相等的刚度。刚度通常设定在0.03至0.14 pN/nm之间。刚度越小，力噪声越低，特别是在低力条件下。</li>
		<li>然后翻转电动镜 M（图 2) 切换至荧光显微镜，通过长距离平移样品，在溶液中寻找游离的肌动蛋白纤维13. 优选长丝状结构（&gt;5 µm因为具有持续运动性的肌球蛋白会在解离前将其置换并移动数微米。</li>
		<li>移动样品，使其中一个被捕获的微珠接近丝状结构的一端，直至两者相互结合。然后，调节微珠间的距离至接近丝状结构的长度，并通过将载物台向未结合的第二个微珠方向移动，从而在其方向上产生流动。该丝状结构将被流动拉伸，并最终与微珠结合。13珠-肌动蛋白-珠复合物称为“哑铃状结构”。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>建立肌动蛋白-肌球蛋白接触。
	<ol>
		<li>轻轻将两个光镊分开，以对细丝施加约3 pN的预张力，并通过改变两个声光偏转器（AOD）之一的频率，使其中一个光镊以三角波形式振荡，从而探测哑铃状结构的刚性，同时通过尾随微珠的位置信号验证运动是否成功传递。</li>
		<li>将载物台移动，使哑铃形结构靠近固定在基底上的二氧化硅微珠，并通过略微调节被捕获微珠中心的高度至略低于二氧化硅微珠直径的位置，使细丝与附着在微珠表面的蛋白质发生接触。然后将二氧化硅微珠的中心定位在两个被捕获微珠之间。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>力钳与纳米级稳定性反馈控制：
	<ol>
		<li>打开超快力钳，设置力为2-3 pN，振荡幅度为200 nm，以约20-30 nm的离散步长沿垂直于肌动蛋白丝的方向扫描基座微珠。在每个位置等待相互作用发生（数秒），若未观察到相互作用，则前进至下一步。当蛋白-丝状结构相互作用建立后，寻找相互作用更频繁的位置。</li>
		<li>确保当行进性肌球蛋白向肌动蛋白丝的一端（通常为+端）移动时，连接在+端的捕获小球朝向二氧化硅小球移动。将载物台向肌动蛋白丝的-端移动，使得在肌球蛋白未结合时，二氧化硅小球尽可能靠近连接在肌动蛋白丝-端的捕获小球，并启动纳米级稳定性反馈系统。通过这种方式，可最大程度降低连接在肌动蛋白丝+端的捕获小球与二氧化硅小球发生碰撞的概率。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>记录数据。</li>
</ol>
4. 数据分析4
注意：所描述的分析方法可根据哑铃速度的变化（由肌球蛋白步进行为引起）来检测和测量持续性运行及快速步进事件。对持续性运行的分析是基于文献3,4,13中所述的非持续性分子马达的数据分析方法进行的。
<ol>
	<li>设置速度变化的阈值，以实现步进事件的检测。由于在此情况下预期存在正向和反向步进，因此两个方向上跨越阈值均被接受。</li>
	<li>将每个步进分配到相应的运行中：如果两个连续步进之间的时间间隔短于 3 ms，且步进的幅度为 &lt; 90 nm，将步骤分配到同一次运行中，否则将步骤分配到不同的运行中4.</li>
	<li>辅助力的正确运行长度4.
	<ol>
		<li>通过测量得到的平均运行长度值计算真实运行长度值 RL，以获得辅助力作用下的正确运行长度 &lt;RLm&gt; 由以下公式，其中 D 是振荡范围： 
		<img alt="用于说明概率密度与期望值计算的数学方程。" src="/files/ftp_upload/62388/62388eq1v3.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="公式 1"> 
		注：该方程的推导细节可参见参考文献4.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

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</ol>

作者声明无竞争利益。

尽管单分子技术（如三珠检测法）在技术上具有挑战性且通量较低，但UFFCS得益于数据的高信噪比，显著提升了分子相互作用的检测能力。UFFCS可用于研究马达蛋白的载荷依赖性，其主要优势在于：当马达与丝状结构结合时，能够迅速施加力，从而探测力产生过程中的早期及极快速事件，以及在受控力条件下的弱结合状态；在整个运动过程中保持力的恒定，并能够完全控制力的方向性，以探究马达蛋白对力的依赖性。关于最后一点，我们在此使用的三珠几何构型在沿丝状结构方向施加和测量力方面非常高效，可最大限度地减少横向或垂直方向分量的干扰。然而，当马达蛋白预期会主动产生横向或垂直方向的力，甚至扭矩时，其他构型（如单珠几何构型）则更为合适2,7,18。此外，得益于其出色的空间和&#160;时间分辨率，UFFCS成为理解分子相互作用基本机制的独特工具，而这些机制在传统单分子技术中往往难以揭示。事实上，UFFCS使研究人员得以探究辅助力和阻力如何调控myosin-5B的机械响应，从而为理解其在细胞...

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Dissecting Mechanoenzymatic Properties of Processive Myosins with Ultrafast Force-Clamp Spectroscopy

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Erratum: Dissecting Mechanoenzymatic Properties of Processive Myosins with Ultra Force-Clamp Spectroscopy

近几十年来，由于光镊能够同时操控并测量单个分子的构象变化和酶促动力学，这一技术已成为阐明蛋白质相互作用的力化学机制的有力工具1,2。特别是，光镊能够施加并测量细胞内分子马达所作用范围内的力，同时具备测量亚纳米级构象变化的能力，使其成为揭示马达蛋白的化学机械特性及其机械调控机制的独特单分子工具。
超快力钳光谱法（UFFCS）是一种基于光镊的单分子力谱技术，采用三珠几何构型（图1a）开发，用于研究分子马达在负载条件下的快速动力学过程3,4。UFFCS将施加力至马达蛋白的时间延迟减少到光镊的物理极限，即系统的机械弛豫时间，从而可在肌球蛋白运动开始后迅速施加力（几十微秒内）3。该技术已被用于研究快速骨骼肌3和心肌肌球蛋白5中的早期机械事件，揭示了动力冲程、弱结合态与强结合态的负载依赖性，以及生化事件（Pi释放）与机械事件（动力冲程）发生的顺序。
三珠几何结构通常用于研究非过程性马达分子，而单珠几何结构结合力钳技术则常用于研究如肌球蛋白Va等过程性非常规肌球蛋白6。然而，对于过程性肌球蛋白，也有若干理由更倾向于采用三珠UFFCS检测方法。首先，在肌动蛋白与肌球蛋白结合后立即施加负载，可实现对力生成早期事件的测量，这一点与非过程性马达分子类似。此外，在过程性马达分子的情况下，该方法还能在恒定负载条件下精确测量马达在整个运动过程中的运行长度和持续时间（图1b）。再者，由于力反馈速率较高，系统可在位置快速变化期间（例如肌球蛋白的工作冲程）保持力的恒定，从而确保马达步进过程中负载的稳定性。系统的高时间分辨率使得亚毫秒级相互作用得以检测，为研究肌球蛋白与肌动蛋白之间的弱结合提供了可能。最后，该检测构型可确保力沿肌动蛋白丝方向施加，力的横向和垂直分量可忽略不计。这一点尤为重要，因为已有研究表明，垂直方向的力分量会显著影响马达动力学的负载依赖性7,8。通过使用该技术，我们能够对过程性肌球蛋白-5B施加一系列辅助性和抵抗性负载，并直接测量其在广泛力范围内的过程性负载依赖性4。
如图1a所示，在该系统中，一条肌动蛋白丝被悬挂在双光镊捕获的两个聚苯乙烯小球之间（即&#34;哑铃&#34;结构）。通过快速反馈系统，对肌动蛋白丝施加一个不平衡的净力 F = F1 - F2，使肌动蛋白丝以恒定速度单向移动，直至到达用户定义的反转点，此时净力方向反转。当马达蛋白未与肌动蛋白丝相互作用时，哑铃结构可在底座小球（其上附着单个马达蛋白）范围内自由地以三角波形式来回移动（图1b，底部图示）。一旦马达蛋白与肌动蛋白丝发生相互作用，哑铃所承受的力便迅速传递至马达蛋白，马达随即在相互作用时刻反馈系统所施加的力的大小和方向下，通过步进行动推动肌动蛋白丝移动，直至肌球蛋白从肌动蛋白上解离。由于马达步进所产生的位移依赖于被捕获肌动蛋白丝的极性，根据所施加力的方向，负载可表现为辅助性（即与马达位移方向一致，推动马达前进，见图1b上部图示中的“push”），或表现为抵抗性（即与马达位移方向相反，阻碍马达前进，见图1b上部图示中的“pull”），从而可研究施加负载的强度和方向性对马达过程性化学机械调控的影响。
在接下来的章节中，将全面描述使用超快力钳光谱技术在不同负载条件下测量肌动蛋白-肌球蛋白-5B 相互作用的所有步骤，包括：1）光学装置的搭建、光阱的对准与校准程序；2）所有组分的制备及其在样品腔中的组装；3）测量过程；4）代表性数据及数据分析，以提取重要的物理参数，例如马达蛋白的运行长度、步长和速度。

<table><tbody><tr><td>&amp;nbsp;脂肪族胺乳胶微球</td><td>ThermoFisher</td><td>A37362</td><td>1.0-&amp;mu;m 直径，2%（w/v）</td></tr><tr><td>丙酮</td><td>Sigma</td><td>32201</td><td></td></tr><tr><td>肌动蛋白聚合缓冲液</td><td>细胞骨架</td><td>BSA02</td><td>10X</td></tr><tr><td>声光偏转器（AODs）</td><td>AA光电电子</td><td>DTS-XY 250</td><td>激光束偏转器</td></tr><tr><td>ATP</td><td>Sigma</td><td>A7699</td><td></td></tr><tr><td>生物素标记的BSA</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>29130</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma</td><td>B4287</td><td></td></tr><tr><td>猪脑钙调蛋白（CaM）</td><td>默克密理博</td><td>208783</td><td></td></tr><tr><td>牛肝过氧化氢酶</td><td>Sigma</td><td>C40</td><td></td></tr><tr><td>聚光镜</td><td>Olympus</td><td>奥林巴斯U-AAC，平场消色差，消色差</td><td>NA 1.4，油镜</td></tr><tr><td>磷酸肌酸二钠盐四水合物</td><td>Sigma</td><td>27920</td><td></td></tr><tr><td>兔肌肉肌酸磷酸激酶</td><td>Sigma</td><td>C3755</td><td></td></tr><tr><td>DDs</td><td>AA 光电</td><td>AA.DDS.XX</td><td>双通道数字合成器</td></tr><tr><td>DL-二硫苏糖醇（DTT）&gt;</td><td>Sigma</td><td>43819</td><td></td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Sigma</td><td>E4378</td><td></td></tr><tr><td>G-肌动蛋白</td><td>细胞骨架</td><td>AKL99</td><td></td></tr><tr><td>葡萄糖</td><td>Sigma</td><td>G7528</td><td></td></tr><tr><td>来自黑曲霉的葡萄糖氧化酶</td><td>Sigma</td><td>&amp;nbsp;G7141</td><td></td></tr><tr><td>HaloTag 琥珀酰亚胺酯 O2 配体</td><td>Promega</td><td>P1691</td><td></td></tr><tr><td>高真空硅脂，重型</td><td>默克密理博</td><td>107921</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma</td><td>P9541</td><td></td></tr><tr><td>KH2PO4/K2HPO4</td><td>Sigma</td><td>P5379/ P8281</td><td></td></tr><tr><td>Labview</td><td>国家仪器公司</td><td>8.1 版本</td><td>数据采集</td></tr><tr><td>Labview FPGA 模块</td><td>国家仪器公司</td><td>8.1 版本</td><td>快速力钳</td></tr><tr><td>Matlab</td><td>MathWorks</td><td>2016</td><td>数据分析</td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Fluka</td><td>63020</td><td></td></tr><tr><td>显微镜物镜</td><td>尼康</td><td>Plan-Apo 60X</td><td>数值孔径 1.2，工作距离 0.2 毫米，水浸</td></tr><tr><td>MOPS</td><td>Sigma</td><td>M1254</td><td></td></tr><tr><td>硝酸纤维素</td><td>Sigma</td><td>N8267</td><td>0.45 孔径</td></tr><tr><td>戊酸乙酯溶液</td><td>Sigma</td><td>46022</td><td></td></tr><tr><td>纯乙醇</td><td>&amp;nbsp;Sigma</td><td>2860</td><td></td></tr><tr><td>QPDs</td><td>UDT</td><td>DLS-20</td><td>D 位置检测器</td></tr><tr><td>罗丹明 BSA</td><td>分子探针</td><td>A23016</td><td></td></tr><tr><td>罗丹明鬼笔环肽</td><td>&amp;nbsp;Sigma</td><td>P1951</td><td></td></tr><tr><td>二氧化硅珠</td><td>邦斯拉布斯</td><td>SS04N</td><td>1.21 毫米，10% 固含量</td></tr><tr><td>叠氮化钠</td><td>&amp;nbsp;Sigma</td><td>S2002</td><td></td></tr><tr><td>链霉亲和素蛋白</td><td>&amp;nbsp;Sigma</td><td>189730</td><td></td></tr></tbody></table>

利用超快力钳光谱技术解析行进性肌球蛋白的力-酶特性

Dissecting Mechanoenzymatic Properties of Processive Myosins with Ultrafast Force-Clamp Spectroscopy

超快力钳光谱技术（UFFCS）是一种基于激光镊子的单分子技术，能够在负载条件下以 unprecedented 的时间分辨率研究传统和非传统肌球蛋白的化学力学特性。特别是，该技术能够在肌动蛋白-肌球蛋白键形成后立即在恒定力条件下探测肌球蛋白马达，结合高速力反馈（200 kHz），已证明 UFFCS 是研究负载依赖性快速动力学（如肌球蛋白工作行程）的有力工具。此外，UFFCS 还可用于研究施加力的强度和方向如何影响过程性和非过程性肌球蛋白-肌动蛋白相互作用。
通过遵循本方案，可对持续性运动的肌球蛋白-5分子马达及多种非常规肌球蛋白进行超快力钳实验。经过适当调整，该方案也可轻松拓展用于研究其他类型的持续性运动马达，如驱动蛋白和动力蛋白。本方案涵盖了从实验装置搭建、样品制备、校准程序到数据采集与分析的全部必要步骤。

代表性数据包括随时间变化的位置记录，如图所示 图4在位置记录中可观察到两种位移。首先，当肌球蛋白马达未与肌动蛋白丝相互作用时，被捕获的微珠在溶液黏性阻力作用下以恒定速度移动，表现出在线性位移，该位移在操作者设定的三角波振荡范围内波动。3 （不可见于 图4 由于时间尺度较长）。其次，一旦肌球蛋白马达与细丝相互作用，运动细丝所携带的力会迅速传递给蛋白质，系统速度骤降至零（图中红线所示 图4）并在恒定力作用下持续发生步进事件直至运行结束。如图所示 图5 力的方向由反馈系统在正方向和负方向之间切换（反之亦然），当微珠到达用户设定的振荡范围边界时，反馈系统即切换力的方向。在某些情况下，当肌球蛋白结合并朝正方向移动微丝时，会推动微珠向振荡范围的（上方）边界移动。若此时作用力为辅助力（即方向朝向正向位移，推动） <strong cla...

本文介绍了一种针对持续性运动的肌球蛋白-5分子马达进行超快力钳实验的完整方案，该方案可轻松拓展应用于其他类型的持续性分子马达研究。本方案详细描述了从实验装置的搭建、样品制备，到数据采集与分析的全部必要步骤。

超快力钳光谱法（UFFCS）是一种基于激光镊子的单分子技术，可用于研究化学机械学特性……

超快力钳光谱学是一种基于激光镊子的单分子技术，能够以最高的时间分辨率研究载荷下肌球蛋白马达的化学力学特性。该技术通过在马达与目标相互作用的各个阶段始终保持力的恒定，并精确控制力的方向，从而探测力生成过程中的极快速事件。通过适当的调整，本方案可轻松应用于其他类型的运动型马达蛋白，包括驱动蛋白（kinesins）和动力蛋白（dyneins），以揭示力对其功能的调控机制。将一组声光偏转器安装到线性平移台上后，取一个可调光阑，调节其孔径以匹配物镜后焦面的尺寸。取下物镜，换上已将光阑中心对准螺纹物镜安装座的装置。移动平移台，使激光束中被压电晶体遮挡的部分在通过光阑后可见，然后将平移台略微回退，直至光束完全充满光阑孔径。在戊酸戊酯中制备二氧化硅微珠时，首先将20微升1.2微米、10%固含量的二氧化硅微珠用1-1.5毫升丙酮稀释，通过涡旋混合并超声处理30秒。超声处理后，通过离心收集微珠，并将微珠沉淀重悬于1毫升新鲜丙酮中进行第二次洗涤。第二次丙酮洗涤后，在相同离心条件下，每次使用1毫升新鲜戊酸戊酯，共洗涤三次，然后将沉淀重悬于100微升1%硝酸纤维素溶液和900微升戊酸戊酯中。接下来，使用一块浸有纯乙醇的实验室擦拭纸仔细擦拭24 × 24毫米的玻璃盖玻片，然后用洁净的镊子将盖玻片直接在乙醇中冲洗，并在温和的氮气流下使其干燥。将配制好的二氧化硅微球储备液涡旋振荡并超声处理30秒，用经乙醇清洁的24 × 60毫米盖玻片取2微升二氧化硅微球溶液，涂布于较小盖玻片的表面。在微球干燥的同时，按演示方法清洗一张26 × 76毫米载玻片，并在载玻片的长边两侧各贴上一条厚度为60–100微米、宽3毫米的双面胶带。使用洁净的镊子将带有微珠的盖玻片放置在胶带上，微珠面朝向载玻片腔室内部，并向腔室内加入15毫摩尔磷酸盐缓冲液和悬浮的聚苯乙烯微珠溶液。然后用硅脂密封腔室。为校准明场相机的像素与纳米比例，首先在距视野中心约5微米处获取盖玻片表面一个二氧化硅微珠的图像。移动载物台，使微珠向视场中心移动10微米，并拍摄第二幅图像。通过测量微珠在两个位置之间的像素距离，计算相机校准常数。为校准光阱位置，先用一个光阱捕获单个悬浮微粒，然后以0.2兆赫为步长调节声光偏转器，每步均获取微粒图像及对应的偏转器频率。然后，以相同的方式对第二个光阱重复进行校准。为校准光阱的功率和刚度，需在每个光阱中捕获单个粒子，并利用声光偏转器以 0.2 兆赫兹的步长移动两个光阱，同时使用四象限光电二极管探测器记录两个光阱中粒子的布朗运动及其对应的声光偏转器频率。通过将洛伦兹函数拟合到所记录布朗运动的功率谱上，获得校准常数。为准备测量样品，向一个新的样品腔中加入浓度为1毫克/毫升的生物素化BSA，该样品腔的盖玻片表面附有二氧化硅微珠。5分钟后，用AB缓冲液冲洗样品腔，并向其中加入浓度为1毫克/毫升的链霉亲和素。再过5分钟后，按所示方法清洗样品腔，然后在M5B缓冲液中加入终浓度为3纳摩尔的生物素化Myosin-5B重酶切肌球蛋白片段，该缓冲液中已添加2微摩尔的钙调蛋白。5分钟后，用含有2微摩尔钙调蛋白的1毫克/毫升生物素化BSA的AB缓冲液洗涤反应腔三次，每次洗涤后等待3分钟。加入反应混合物，并用硅脂密封反应腔。测量样品时，将反应腔置于显微镜载物台上，移动物镜直至悬浮的α-辅肌动蛋白珠清晰对焦。打开一个光镊并捕获一个微珠。第一个光镊捕获到微珠后，移动长距离平移装置，将被捕获的微珠移至接近盖玻片表面的位置，以避免同时捕获多个微珠，随后在第二个光镊中捕获另一个微珠。通过长距离平移装置移动样品，寻找溶液中长度至少为5微米的肌动蛋白丝。当观察到一根细丝后，移动样品使被捕获的微珠接近细丝的一端。一旦细丝与微珠连接，调节微珠与细丝之间的距离至接近细丝的长度，然后移动载物台，使未结合的微珠朝向流动方向移动。细丝将因流体作用而被拉伸，并最终与第二个微珠结合。该复合物被称为哑铃形结构。为建立肌动蛋白-肌球蛋白接触，轻轻分离两个光镊，并将丝状物预张力调节至约3皮牛的水平。为检测哑铃形结构的刚性，通过改变一个声光偏转器的频率，使其中一个光镊以三角波形式振荡，并通过后随微珠的位置信号验证运动是否成功传递至该微珠。移动载物台，将哑铃形结构定位至邻近一个基座上的二氧化硅微珠处，并调节哑铃形结构的高度，使肌动蛋白丝与二氧化硅微珠表面接触。如本代表性位置记录所示，当肌球蛋白马达未与肌动蛋白丝相互作用时，被捕获的微珠在溶液黏滞拖拽力作用下以恒定速度移动。一旦肌球蛋白马达开始与丝状物相互作用，运动丝所携带的力会极快地传递至该蛋白质，系统速度随即降至零，随后的步进事件在恒定力条件下持续进行直至运行结束。反馈系统会在微珠到达用户设定的振荡范围边缘时，将施加的力从正方向切换至负方向。当肌球蛋白结合并朝正方向移动微丝时，会推动小球向振荡范围的上边缘移动。如果这种情况发生在辅助力作用下，肌球蛋白的运行将在振荡边缘因力方向的反转而中断，从而使肌球蛋白的运行长度受限于哑铃形振荡的振幅。必须精确对准光学系统，以获得最佳的空间和时间分辨率，同时需要进行准确的校准，以精确定义所施加力的数值。该技术已应用于研究转录因子在DNA上的滑动和靶向搜索，以及机械转导蛋白在微管纤维上诱导的动态相互作用。

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科研

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