利用超快力钳光谱技术解析行进性肌球蛋白的力-酶特性

超快力钳光谱学是一种基于激光镊子的单分子技术，能够以最高的时间分辨率研究载荷下肌球蛋白马达的化学力学特性。该技术通过在马达与目标相互作用的各个阶段始终保持力的恒定，并精确控制力的方向，从而探测力生成过程中的极快速事件。通过适当的调整，本方案可轻松应用于其他类型的运动型马达蛋白，包括驱动蛋白（kinesins）和动力蛋白（dyneins），以揭示力对其功能的调控机制。

将一组声光偏转器安装到线性平移台上后，取一个可调光阑，调节其孔径以匹配物镜后焦面的尺寸。取下物镜，换上已将光阑中心对准螺纹物镜安装座的装置。移动平移台，使激光束中被压电晶体遮挡的部分在通过光阑后可见，然后将平移台略微回退，直至光束完全充满光阑孔径。

在戊酸戊酯中制备二氧化硅微珠时，首先将20微升1.2微米、10%固含量的二氧化硅微珠用1-1.5毫升丙酮稀释，通过涡旋混合并超声处理30秒。超声处理后，通过离心收集微珠，并将微珠沉淀重悬于1毫升新鲜丙酮中进行第二次洗涤。第二次丙酮洗涤后，在相同离心条件下，每次使用1毫升新鲜戊酸戊酯，共洗涤三次，然后将沉淀重悬于100微升1%硝酸纤维素溶液和900微升戊酸戊酯中。

接下来，使用一块浸有纯乙醇的实验室擦拭纸仔细擦拭24 × 24毫米的玻璃盖玻片，然后用洁净的镊子将盖玻片直接在乙醇中冲洗，并在温和的氮气流下使其干燥。将配制好的二氧化硅微球储备液涡旋振荡并超声处理30秒，用经乙醇清洁的24 × 60毫米盖玻片取2微升二氧化硅微球溶液，涂布于较小盖玻片的表面。在微球干燥的同时，按演示方法清洗一张26 × 76毫米载玻片，并在载玻片的长边两侧各贴上一条厚度为60–100微米、宽3毫米的双面胶带。

使用洁净的镊子将带有微珠的盖玻片放置在胶带上，微珠面朝向载玻片腔室内部，并向腔室内加入15毫摩尔磷酸盐缓冲液和悬浮的聚苯乙烯微珠溶液。然后用硅脂密封腔室。为校准明场相机的像素与纳米比例，首先在距视野中心约5微米处获取盖玻片表面一个二氧化硅微珠的图像。

移动载物台，使微珠向视场中心移动10微米，并拍摄第二幅图像。通过测量微珠在两个位置之间的像素距离，计算相机校准常数。为校准光阱位置，先用一个光阱捕获单个悬浮微粒，然后以0.2兆赫为步长调节声光偏转器，每步均获取微粒图像及对应的偏转器频率。

然后，以相同的方式对第二个光阱重复进行校准。为校准光阱的功率和刚度，需在每个光阱中捕获单个粒子，并利用声光偏转器以 0.2 兆赫兹的步长移动两个光阱，同时使用四象限光电二极管探测器记录两个光阱中粒子的布朗运动及其对应的声光偏转器频率。通过将洛伦兹函数拟合到所记录布朗运动的功率谱上，获得校准常数。

为准备测量样品，向一个新的样品腔中加入浓度为1毫克/毫升的生物素化BSA，该样品腔的盖玻片表面附有二氧化硅微珠。5分钟后，用AB缓冲液冲洗样品腔，并向其中加入浓度为1毫克/毫升的链霉亲和素。再过5分钟后，按所示方法清洗样品腔，然后在M5B缓冲液中加入终浓度为3纳摩尔的生物素化Myosin-5B重酶切肌球蛋白片段，该缓冲液中已添加2微摩尔的钙调蛋白。

5分钟后，用含有2微摩尔钙调蛋白的1毫克/毫升生物素化BSA的AB缓冲液洗涤反应腔三次，每次洗涤后等待3分钟。加入反应混合物，并用硅脂密封反应腔。测量样品时，将反应腔置于显微镜载物台上，移动物镜直至悬浮的α-辅肌动蛋白珠清晰对焦。

打开一个光镊并捕获一个微珠。第一个光镊捕获到微珠后，移动长距离平移装置，将被捕获的微珠移至接近盖玻片表面的位置，以避免同时捕获多个微珠，随后在第二个光镊中捕获另一个微珠。通过长距离平移装置移动样品，寻找溶液中长度至少为5微米的肌动蛋白丝。

当观察到一根细丝后，移动样品使被捕获的微珠接近细丝的一端。一旦细丝与微珠连接，调节微珠与细丝之间的距离至接近细丝的长度，然后移动载物台，使未结合的微珠朝向流动方向移动。细丝将因流体作用而被拉伸，并最终与第二个微珠结合。

该复合物被称为哑铃形结构。为建立肌动蛋白-肌球蛋白接触，轻轻分离两个光镊，并将丝状物预张力调节至约3皮牛的水平。为检测哑铃形结构的刚性，通过改变一个声光偏转器的频率，使其中一个光镊以三角波形式振荡，并通过后随微珠的位置信号验证运动是否成功传递至该微珠。移动载物台，将哑铃形结构定位至邻近一个基座上的二氧化硅微珠处，并调节哑铃形结构的高度，使肌动蛋白丝与二氧化硅微珠表面接触。

如本代表性位置记录所示，当肌球蛋白马达未与肌动蛋白丝相互作用时，被捕获的微珠在溶液黏滞拖拽力作用下以恒定速度移动。一旦肌球蛋白马达开始与丝状物相互作用，运动丝所携带的力会极快地传递至该蛋白质，系统速度随即降至零，随后的步进事件在恒定力条件下持续进行直至运行结束。反馈系统会在微珠到达用户设定的振荡范围边缘时，将施加的力从正方向切换至负方向。

当肌球蛋白结合并朝正方向移动微丝时，会推动小球向振荡范围的上边缘移动。如果这种情况发生在辅助力作用下，肌球蛋白的运行将在振荡边缘因力方向的反转而中断，从而使肌球蛋白的运行长度受限于哑铃形振荡的振幅。必须精确对准光学系统，以获得最佳的空间和时间分辨率，同时需要进行准确的校准，以精确定义所施加力的数值。

该技术已应用于研究转录因子在DNA上的滑动和靶向搜索，以及机械转导蛋白在微管纤维上诱导的动态相互作用。