Name: 用于低肿瘤含量组织中肿瘤富集的自动解剖方案 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-03-29T14:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 44 s
Description: 了解自动化组织解剖技术，用于从低肿瘤含量样本中富集肿瘤区域。该方法结合数字注释与自动铣削，提高核酸提取质量，适用于全外显子组测序等下游基因组分析。

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作者谨此感谢 Carmina Espiritu 和 Robin E. Taylor 在自动化解剖技术开发方面的支持，同时感谢为本研究提供支持的基因泰克病理学核心实验室工作人员。

在开始之前，根据机构审查委员会（IRB）的规程获取适当的组织样本。本文所述所有方法均已获得基因泰克公司（Genentech, Inc.）机构动物护理和使用委员会（IACUC）的批准。
1. 组织和切片制备
<ol>
	<li>选择福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）或新鲜冷冻组织块，并采用下述相应的处理方法。</li>
	<li>将组织块切片至带正电荷的玻璃载玻片上，厚度按需设定。连续切取FFPE组织成带状，第一张参考切片厚度应适用于苏木精和伊红（H&amp;#38;E）染色（例如4 µm），随后根据需要和组织可用性，再切取1–4张厚度为4–20 µm的切片。将组织切片收集至带正电荷的显微镜载玻片上。 
	注意：新鲜冷冻参考组织切片应立即采用常规冷冻切片染色方案进行苏木精和伊红（H&amp;#38;E）染色，未染色的冷冻切片则应保存于-20 °C，直至需要时用于后续提取。</li>
	<li>将所有FFPE切片在室温下干燥过夜。</li>
	<li>将FFPE参考切片在60 °C下烘烤30分钟，然后采用常规方案进行H&amp;#38;E染色。</li>
	<li>使用全切片成像仪以20倍或更高放大倍数对H&amp;#38;E染色切片进行扫描。</li>
	<li>使用供应商提供的查看平台或开源查看器，对扫描图像中标注的肿瘤感兴趣区域进行注释。将这些注释导出为低倍率截图，或保存为包含对应多边形顶点X-Y像素坐标的元数据文件。 
	注意：前者在技术操作上较为简便，但后者在流程自动化方面具有优势。</li>
	<li>根据所采用的方法创建感兴趣区域的数字掩膜，并导出人工注释。 
	&#8203;注意：若使用注释的截图/图像，可利用简单的图像处理软件选择区域并填充整个选区。若使用每个感兴趣区域（ROI）的X-Y坐标，则需借助编程语言读取图像数据和多边形坐标，以生成包含填充感兴趣区域的低倍图像。用户应与自动切割仪器供应商协作，根据其软件配置和实际需求建立相应流程。若无法进行扫描、数字切片注释和/或数字掩膜创建，可使用记号笔在载玻片上进行仔细的手工标注，并将其作为参考图像替代数字掩膜。数字掩膜创建的伪代码已提供于补充文件1中。</li>
</ol>
2. 自动化组织解剖
<ol>
	<li>使用数字载玻片参考时，将未染色的样本组织切片置于载物台的第一至第四位。若使用载玻片上标注而非数字选项，则将未染色的样本组织切片置于载物台的第二至第四位，并在第一位放置参考切片。</li>
	<li>使用自动组织解剖软件创建铣削任务： 职位选择 &#62; 创建新任务 &#62; 病例编号&#160;&#62; 名称 研磨作业；前往 厚度 &#62; 切片厚度 使用上下箭头选项卡；然后转到 组织制备 &#62; 石蜡包埋的 或 脱蜡的, 参考图像 &#62; 从文件 &#62; 导入图像 &#62; 文件 （如适用）从下拉菜单中选择作为数字参考导入。选择 从阶段 用于载物台玻片参考。当所有字段填写完成后，通过选择扫描载物台 扫描台 单击右下角的按钮，以采集第一至第四位置的每张样本组织切片。</li>
	<li>选择用于图像采集的组织区域。
	<ol>
		<li>若使用载物台参考图像，将方框从一个角拖动至对角，以在组织上创建一个矩形区域。选择矩形区域下方的圆形气泡，以采集载物台参考图像。若使用数字参考图像，将该图像叠加至所选的矩形区域上，并在低倍镜下粗略调整其大小和位置，使其与样本组织的尺寸和位置尽可能匹配。</li>
		<li>通过参考图像右上角的复制选项，将此矩形区域复制到第二至第四张载玻片位置的其余样本组织切片上。根据需要进行大致对齐和调整大小。 
		注意：当使用载玻片上的参考图像而非数字掩膜时，应选择载物台上哪一张载玻片作为参考。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>对齐参考片和样本片
	<ol>
		<li>当参考图像在所有载玻片位置上均与组织样本载玻片大致对齐后，选择 扫描台 单击屏幕右下角的按钮，进入精细调整步骤。选择第一阶段位置并 转化 使用工具图标（右侧工具栏中第三个图标）对参考图像进行精细对齐和缩放调整，以使其与样本幻灯片的叠加效果最佳匹配。使用 样品参照 屏幕底部的滑动条可在参考图像与样本图像之间进行切换，同时配合 放大 和 缩小 调整并校准每张载玻片的位置。在第二至第四张样本载玻片位置重复此操作。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>选择感兴趣区域的研磨区域
	<ol>
		<li>当四个载物片位置均达到最佳样品覆盖后，使用以下方法绘制研磨路径标记 颜色选择器 工具图标（右侧工具栏中第十个图标）点击蒙版参考图像的着色区域。选择 扩展至相似内容&#160;若对多个切片或区域进行了解剖标注，则选择该框，然后选择 获取注释 右下角的按钮，用于在样本载玻片上绘制铣削路径。&#160;</li>
		<li>在第一个幻灯片位置选择铣削路径。 
		注意：当在第一个切片位置选择铣削路径时，该路径将被复制到其余切片位置，并计算铣削针头的使用数量。左上角显示的铣削针头使用量是根据所覆盖的区域和选定的针头尺寸进行计算的。若计算出的针头使用数量超过四个，可选择更大的针头尺寸以覆盖所标注的感兴趣区域。针头尺寸可在屏幕左侧的相应选项中进行选择或更改。 研磨提示 箭头和尖端的使用将被重新计算。</li>
		<li>当计算铣削路径时，收集包含四个或更少铣削尖端的标注感兴趣区域（ROI）。选择 设置阶段 点击屏幕右下角的按钮，以提示从已放置的收集管中加载研磨头，并将其正确安置在载台的指定位置。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>用 3.0 mL 最适合组织类型（FFPE 或新鲜冷冻）及下游核酸提取试剂盒需求的解离缓冲液填充储液池，并选择 解剖 屏幕右下角的按钮。使用分子级矿物油或商品化核酸提取试剂盒中提供的适当缓冲液。 
	注意：仪器随即开始自动切割载玻片及选定的兴趣区域，并收集样本。仪器头部将从载物台后方拾取研磨针头，从储液器中吸入切割液。针头随后沿研磨路径旋转，从载玻片上吸取样本组织，直至切割完成或针头充满。含有切割液的收集样本随后被排入位于载物台后方的收集管中。</li>
	<li>自动化解剖完成后，从载物台上取下收集管和已解剖的样本载玻片，分别放入离心管架和载玻片架中。 
	注意：新鲜冷冻样本应根据制造商说明书直接进行核酸提取，解剖后的新鲜冷冻切片应进行H&amp;#38;E 立即采用冰冻切片常规方案进行染色。</li>
	<li>将解剖后的组织切片在 60 °C 下烘烤 30 分钟，然后用 H 染色&amp;#38;E 使用常规方案。</li>
	<li>扫描解剖后的 H&amp;在全片成像仪上以20倍放大倍数对#38;E染色的切片进行成像，和/或存档以记录未采集且仍保留在切片上的组织。 
	&#8203;注：有关其他扫描选项，请参见上述步骤1.5。</li>
</ol>
3. 核酸提取
<ol>
	<li>汇集组织并离心成团。使用市售试剂盒并按照制造商说明书进行核酸提取。</li>
</ol>

<ol><li>Cho, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue+recommendations+for+precision+cancer+therapy+using+next+generation+sequencing%3A+a+comprehensive+single+cancer+center%27s+experiences%5BTitle%5D)+AND+%22Oncotarget%22%5BJournal%5D)">Tissue recommendations for precision cancer therapy using next generation sequencing: a comprehensive single cancer center's experiences.</a> Oncotarget. 8 (26), 42478-42486 (2017).</li>
<li>Smits, A. J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+estimation+of+tumor+cell+percentage+for+molecular+testing+by+pathologists+is+not+accurate%5BTitle%5D)+AND+%22Modern+Pathology%3A+An+Official+Journal+of+the+United+States+and+Canadian+Academy+of+Pathology%2C+Inc%22%5BJournal%5D)">The estimation of tumor cell percentage for molecular testing by pathologists is not accurate.</a> Modern Pathology: An Official Journal of the United States and Canadian Academy of Pathology, Inc. 27 (2), 168-174 (2014).</li>
<li>Poole-Wilson, P. A., Langer, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+pH+on+ionic+exchange+and+function+in+rat+and+rabbit+myocardium%5BTitle%5D)+AND+%22The+American+Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Effect of pH on ionic exchange and function in rat and rabbit myocardium.</a> The American Journal of Physiology. 229 (3), 570-581 (1975).</li>
<li>Viray, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+prospective%2C+multi-institutional+diagnostic+trial+to+determine+pathologist+accuracy+in+estimation+of+percentage+of+malignant+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Archives+of+Pathology+%26+Laboratory+Medicine%22%5BJournal%5D)">A prospective, multi-institutional diagnostic trial to determine pathologist accuracy in estimation of percentage of malignant cells.</a> Archives of Pathology & Laboratory Medicine. 137 (11), 1545-1549 (2013).</li>
<li>El-Serag, H. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+Expression+in+Barrett%27s+Esophagus%3A+Laser+capture+versus+whole+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Scandinavian+Journal+of+Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Gene Expression in Barrett's Esophagus: Laser capture versus whole tissue.</a> Scandinavian Journal of Gastroenterology. 44 (7), 787-795 (2009).</li>
<li>Harrell, J. C., Dye, W. W., Harvell, D. M. E., Sartorius, C. A., Horwitz, K. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Contaminating+cells+alter+gene+signatures+in+whole+organ+versus+laser+capture+microdissected+tumors%3A+a+comparison+of+experimental+breast+cancers+and+their+lymph+node+metastases%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+%26+Experimental+Metastasis%22%5BJournal%5D)">Contaminating cells alter gene signatures in whole organ versus laser capture microdissected tumors: a comparison of experimental breast cancers and their lymph node metastases.</a> Clinical & Experimental Metastasis. 25 (1), 81-88 (2008).</li>
<li>Kim, H. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinctions+in+gastric+cancer+gene+expression+signatures+derived+from+laser+capture+microdissection+versus+histologic+macrodissection%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Medical+Genomics%22%5BJournal%5D)">Distinctions in gastric cancer gene expression signatures derived from laser capture microdissection versus histologic macrodissection.</a> BMC Medical Genomics. 4, 48(2011).</li>
<li>Klee, E. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impact+of+sample+acquisition+and+linear+amplification+on+gene+expression+profiling+of+lung+adenocarcinoma%3A+laser+capture+micro-dissection+cell-sampling+versus+bulk+tissue-sampling%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Medical+Genomics%22%5BJournal%5D)">Impact of sample acquisition and linear amplification on gene expression profiling of lung adenocarcinoma: laser capture micro-dissection cell-sampling versus bulk tissue-sampling.</a> BMC Medical Genomics. 2, 13(2009).</li>
<li>Civita, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laser+capture+microdissection+and+RNA-seq+analysis%3A+High+sensitivity+approaches+to+explain+histopathological+heterogeneity+in+human+glioblastoma+FFPE+archived+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Oncology%22%5BJournal%5D)">Laser capture microdissection and RNA-seq analysis: High sensitivity approaches to explain histopathological heterogeneity in human glioblastoma FFPE archived tissues.</a> Frontiers in Oncology. 9, 482(2019).</li>
<li>Emmert-Buck, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laser+capture+microdissection%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Laser capture microdissection.</a> Science. 274 (5289), 998-1001 (1996).</li>
<li>Bonner, R. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laser+capture+microdissection%3A+molecular+analysis+of+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Laser capture microdissection: molecular analysis of tissue.</a> Science. 278 (5342), 1481-1483 (1997).</li>
<li>Hunt, J. L., Finkelstein, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microdissection+techniques+for+molecular+testing+in+surgical+pathology%5BTitle%5D)+AND+%22Archives+of+Pathology+%26+Laboratory+Medicine%22%5BJournal%5D)">Microdissection techniques for molecular testing in surgical pathology.</a> Archives of Pathology & Laboratory Medicine. 128 (12), 1372-1378 (2004).</li>
<li>Espina, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laser-capture+microdissection%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Laser-capture microdissection.</a> Nature Protocols. 1, 586-603 (2006).</li>
<li>Grafen, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimized+expression-based+microdissection+of+formalin-fixed+lung+cancer+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Laboratory+Investigation%3B+A+Journal+of+Technical+Methods+and+Pathology%22%5BJournal%5D)">Optimized expression-based microdissection of formalin-fixed lung cancer tissue.</a> Laboratory Investigation; A Journal of Technical Methods and Pathology. 97 (7), 863-872 (2017).</li>
<li>Javey, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((innovative+tumor+tissue+dissection+tool+for+molecular+oncology+diagnostics%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Molecular+Diagnnostics%3A+JMD%22%5BJournal%5D)">innovative tumor tissue dissection tool for molecular oncology diagnostics.</a> The Journal of Molecular Diagnnostics: JMD. (21), 1525-1578 (2021).</li>
<li>Adey, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+mill+based+instrument+and+software+system+for+dissecting+slide-mounted+tissue+that+provides+digital+guidance+and+documentation%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Clinical+Pathology%22%5BJournal%5D)">A mill based instrument and software system for dissecting slide-mounted tissue that provides digital guidance and documentation.</a> BMC Clinical Pathology. 13 (1), 29(2013).</li>
</ol>

Charles A Havnar、Oliver Zill、Jeff Eastham、Jeffrey Hung、Jennifer Giltnane、Nicolas Lounsbury、Daniel Oreper、Sarajane Saturnio 和 Amy A Lo 是基因泰克（Genentech）和罗氏（Roche）的员工及股东，Mana Javey 和 Emmanuel Naouri 是罗氏（Roche）的员工及股东。

本文介绍了一种结合数字标注与自动化切割技术的实验方案，用于从肿瘤含量较低的福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）或新鲜冷冻组织中分离肿瘤区域，以实现肿瘤富集并用于全外显子组测序（WES）。通过将数字标注与掩模创建同自动化切割相结合，显著减少了传统肿瘤富集方法（包括手工大切片和激光显微切割）所必需的操作时间与专业技术要求。该方案提供了一种具有潜在重要意义的中等精度肿瘤富集策略，不仅适用于低肿瘤含量样本的富集，还可用于在高通量条件下，将弥散分布的肿瘤灶从邻近正常组织中有效分离，从而实现有意义的肿瘤富集。尽管本方案在此处以低肿瘤含量的异种移植组织为例进行展示，但研究发现该流程同样适用于多种组织类型，包括人类、小鼠及异种移植来源的多种正常组织与肿瘤组织。
因此，该方法也可广泛应用于多种场景，例如在无需显著污染背景组织的情况下富集特定目标区域（如富集特定脑区），或在使用传统大体解剖法进行核酸提取前去除特定组织区域。
市场上存在多种用于切片扫描和数字注释的平台。因此，需要注意的是，平台兼容性可能存在限制，且任何方案中指定的平台未必在所有实验室中...

下一代测序（NGS）在患者诊疗和癌症研究中日益广泛应用，有助于指导治疗方案并推动科学发现。由于组织样本通常有限，临床上常使用肿瘤含量不一的小样本进行检测。因此，肿瘤的充分性和完整性仍是获得有意义数据的主要障碍。肿瘤比例较低的样本可能难以区分真实的基因变异与测序过程中的技术假象，通常不符合NGS检测的纳入标准1。对于肿瘤含量低于20%的低肿瘤含量样本，进行肿瘤富集已被证明有助于获得足够的起始材料，从而生成可重复的测序数据，并确保不遗漏低频变异2,3。然而，具体的检测下限会因所使用的测序平台及数据预期用途的不同而有所差异。
传统上，为提取而富集肿瘤区域的方法是通过手工大体解剖或激光捕获显微切割（LCM）对福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）切片进行操作。手工大体解剖，即从切片上刮取特定组织区域，可将肿瘤区域分离用于后续检测，成本相对较低，但准确性和精确度较差2,4。在肿瘤含量较高、存在大片肿瘤组织和/或组织损失对结果影响不大的情况下，较低的技术准确性仍可能有效；但对于肿瘤含量较低或肿瘤分布较分散的样本，则需要更高的精确度。因此，激光捕获显微切割（LCM）于20世纪90年代被发明，并成为一种能够从福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）切片中精确分离微小、特定显微区域组织的有效方法5,6,7,8。当样本存在复杂的异质性时，LCM可用于收集单一细胞群体，从而实现对以往难以分离的细胞群体的获取9。然而，LCM需要昂贵的设备，且操作过程要求较高的技术水平和较长的手动操作时间10,11,12,13,14。
用于自动组织切割的仪器，其精度介于激光显微切割（LCM，约10 µm）与宏观切割（约1 mm）之间15。此外，该仪器在成本和技术要求方面也介于宏观切割与LCM之间，其设计旨在通过对连续的福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）切片进行快速组织富集，以克服先前方法的不足15。此类自动切割利用数字注释或载物台上参考图像叠加至连续未染色组织切片，以实现目标区域的切割与富集。该仪器采用塑料旋转刀头铣削技术，配备1.5 mL收集管，可使用多种不同液体进行切割，以收集适用于下游检测（包括核酸提取和测序）的目标区域。旋转塑料铣削刀头通过内、外两个注射器筒储液腔及推杆来吸取缓冲液，随后对组织进行铣削并收集组织16。可变的铣削刀头直径（250 µm、525 µm、725 µm）可用于切割不同组织区域以进行比较，或分别收集多灶性区域进行合并，亦可从单张或多张FFPE切片中获取独立的小区域。用于采集的切片厚度可根据具体实验需求进行调整，用户可在用于采集的最后一张切片之后，对下一张连续切片进行额外的苏木精-伊红（H&amp;#38;E）染色，以确认目标区域尚未耗尽。
自动解剖技术被确定为一种在肿瘤含量较低的样本中富集肿瘤成分的方法。我们测试并拓展了一款市售自动组织解剖仪器的预期功能，该仪器目前适用于厚度不超过10 µm的福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）临床样本。本研究显示，自动解剖技术可应用于厚度达20 µm的FFPE以及新鲜冷冻的人类或动物组织切片，适用于科研用途。本方案还展示了一种对低肿瘤含量组织，或存在嵌套状、弥散分布肿瘤的病例进行数字标注并实现解剖自动化以富集肿瘤的方法，此类情况下传统大块解剖难以实施或不可行。研究结果表明，所获得的核酸在质量和产量上均足以满足下一代测序（NGS）的要求。因此，自动解剖技术可为肿瘤富集提供中等精度和更高通量，也可用于富集其他感兴趣的区域，或与其他平台联用以解决科研或临床问题。

<table><tbody><tr><td>Agilent SureSelectXT</td><td>Agilent</td><td>G9611A</td><td></td></tr><tr><td>AVENIO Millisect 填充工作站</td><td>Roche</td><td>8106533001</td><td></td></tr><tr><td>AVENIO Millisect 仪器底座</td><td>Roche</td><td>8106568001</td><td></td></tr><tr><td>AVENIO Millisect 仪器头部</td><td>Roche</td><td>8106550001</td><td></td></tr><tr><td>AVENIO Millisect 小型研磨头</td><td>Roche</td><td>8106509001</td><td></td></tr><tr><td>AVENIO Millisect 电脑系统</td><td>Roche</td><td>8106495001</td><td></td></tr><tr><td>BioAnalyzer</td><td>Agilent</td><td>G2939BA</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf 5427R</td><td>Eppendorf</td><td>22620700</td><td>微型离心机</td></tr><tr><td>孵育缓冲液</td><td>Promega</td><td>D920D</td><td></td></tr><tr><td>Leica Autostainer XL</td><td>Leica</td><td>ST5010</td><td>全自动染色机</td></tr><tr><td>分子级矿物油</td><td>Sigma</td><td>M5904-500ML</td><td></td></tr><tr><td>蛋白酶K</td><td>Promega</td><td>V302B</td><td>消化缓冲液</td></tr><tr><td>Qiagen AllPrep DNA/RNA 小量提取试剂盒</td><td>Qiagen</td><td>80284</td><td></td></tr><tr><td>RLT Plus 缓冲液</td><td>Qiagen</td><td>80204</td><td></td></tr><tr><td>Superfrost Plus 带正电荷显微镜载玻片</td><td>Thermo Scientific</td><td>6776214</td><td></td></tr></tbody></table>

低肿瘤含量组织中肿瘤富集的自动化解剖方案

Automated Dissection Protocol for Tumor Enrichment in Low Tumor Content Tissues

对于肿瘤含量较低的组织（根据方法不同，通常指肿瘤含量低于20%的组织），为了在多种下游检测（如新一代测序）中稳定地获得高质量数据，必须进行肿瘤富集。自动化组织切取是一种新兴技术，通过将数字图像注释叠加至未染色切片上，实现对这类常见低肿瘤含量组织的自动化和优化富集。该方法克服了传统大体解剖法因操作者依赖导致的不精确性，以及激光捕获显微切割在时间、成本和专业技术方面的限制。本方案中，利用数字苏木精-伊红（H&amp;#38;E）注释，在未染色的福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）或新鲜冷冻切片（厚度不超过20 µm）上识别微小肿瘤区域，并使用直径为250 µm2的切割刀片进行自动化肿瘤富集，随后开展核酸提取和全外显子组测序（WES）。自动化切取可从单张或多张切片中采集低肿瘤含量组织中标注的区域用于核酸提取，同时支持在采集前后收集大量定量指标，在减少切片使用量的同时提升准确性、可重复性和通量。本方案适用于对动物和/或人类的低肿瘤含量FFPE或新鲜冷冻组织进行数字注释结合自动化切取，也可用于富集任意感兴趣区域，以提升临床或科研工作流程中下游测序应用的样本充分性。

选取含有异种移植模型中转移性结直肠癌的福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）及新鲜冷冻（FF）小鼠肝脏切片。切片经苏木精-伊红（H&amp;E）染色（图 1A、E、I），并在全切片成像仪上以20倍放大倍率进行扫描。由病理学家对肿瘤感兴趣区域进行数字标注，并使用商业软件生成数字PNG格式的参考掩膜图像（图 1B、F、J）。将连续的10 µm和20 µm未染色样本切片置于载物台上，按前述方法进行自动化切割。新鲜冷冻组织收集至商用试剂盒提供的裂解缓冲液中，并依照制造商说明书直接进行核酸提取。FFPE样本使用分子级矿物油收集，切割后的样本合并后在4 °C下以25,000 × g 离心20分钟。弃去上清液，加入所需最小量的矿物油重新悬浮组织，转移并收集至单个收集管中。样本在室温下运送至第三方服务商，依照制造商说明书进行核酸提取，并测定RNA和DNA的片段大小、浓度、完整性及纯度。根据制造商说明书，构建测序文库并使用商业试剂进行杂交与捕获。切割后剩余的...

采用自动组织切割的数字注释为低肿瘤含量样本中富集肿瘤细胞提供了创新性方法，且适用于石蜡和冷冻两种组织类型。所述工作流程可提高准确性、可重复性和通量，可广泛应用于科研和临床环境。

低肿瘤含量组织（根据方法不同，通常指肿瘤含量低于20%的组织）的肿瘤富集是可重复地生成高质量数据所必需的……

与传统方法相比，利用自动化切片技术可更快、更高效地从福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）或新鲜冷冻组织中分离或富集微小的分散目标区域。从FFPE或新鲜冷冻组织中提取基因组物质是许多临床和转化医学研究实验室的必要步骤。自动化切片技术填补了宏观切片与激光捕获显微切割之间的显著技术空白。首先，使用供应商提供的查看平台或开源查看器，对扫描的切片图像中感兴趣的肿瘤区域进行标注。使用数字切片作为参考时，将未染色的样本组织切片放置在载物台的第一至第四切片位置。通过打开“作业列表”并选择“创建新作业”，在自动组织解剖软件中创建铣削作业，并输入病例编号和名称以命名该作业。转到厚度设置，使用上下箭头选项选择切片厚度。然后，进入组织处理，选择石蜡包埋或脱蜡处理。选择参考图像“来自文件”，并导入图像。然后，从下拉菜单中选择要导入的文件作为数字参考。通过点击右下角的“扫描载物台”按钮来扫描载物台，以依次捕获位于第一至第四位置的每个样本组织切片。对于载物台上的参考样本，拖动方框在组织上创建一个矩形区域，并点击矩形区域下方的圆形按钮以获取载物台参考图像。通过选择参考图像右上角的复制选项，将此矩形区域复制到第二至第四张位置上的其余样本组织切片中。然后根据需要进行对齐和调整大小。对于数字参考图像，将其叠加在所选的矩形区域上。然后，大致调整数字参考图像的大小和位置，通过缩放使其与样本组织的尺寸和位置尽可能匹配。通过选择参考图像右上角的复制选项，将此矩形区域复制到第二至第四张位置的其余样本组织切片上。随后根据需要进行对齐和调整大小。单击右下角的“扫描阶段”按钮，进入精细调整步骤。选择第一阶段位置，然后单击右侧工具栏中的变换工具图标，对参考图像进行精细对齐和缩放调整，以使其与样本幻灯片的叠加图像最佳匹配。使用屏幕底部的参考与样本滑动条，在参考图像和样本图像之间切换查看。通过放大和缩小功能调整并实现每张切片位置的对齐。当达到最佳样本重叠效果后，选择右侧工具栏中的取色工具图标，在遮罩参考图像的彩色区域上绘制铣削路径标记。通过点击屏幕右下角的“获取注释”按钮，将铣削路径绘制到样本切片上。当计算出铣削路径后，使用四个或更少的铣削探针捕获并收集标注的目标区域。左上角显示的探针使用数量基于所覆盖的面积和所选探针尺寸计算得出。可通过铣削探针箭头下方更改探针尺寸，探针使用数量将随之重新计算。当在第一个载物片位置选择铣削路径后，该路径将被复制到其余的载物片位置。点击屏幕右下角的“设置”阶段按钮，以从收集管中快速加载铣削探针，并将其正确放置在载物台上指定位置。向储液槽中加入三毫升适用于该组织类型的解离缓冲液，用于后续的核酸提取。然后，点击屏幕右下角的“Dissect”按钮。自动解剖完成后，从载物台上取下收集管和已解剖的样本载玻片。将收集管放入试管架中，载玻片放入载玻片架中。含有异种移植性结直肠癌转移灶的福尔马林固定、石蜡包埋及新鲜冷冻小鼠肝脏切片经苏木精-伊红（H&E）染色后，在全切片成像仪上以20倍放大倍数进行扫描，作为参考切片。对H&E染色的参考切片进行标注，并对肿瘤区域进行数字掩膜处理，以用于显微切割及核酸提取。显微切割后的样本切片经H&E染色，以确认10微米和20微米切片中的切割区域。捕获的指标证明了自动化解剖和核酸提取的成功。在尝试本方案时，请注意将注释相对准确地叠加到未染色切片上对于分离感兴趣区域至关重要。

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低肿瘤含量组织中肿瘤富集的自动化解剖方案

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