Name: 15N CPMG 放松分散，用于研究 μs-ms 时间尺度上的蛋白质符合性动力学 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-04-19T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 9 s
Description: 学习使用¹⁵N CPMG弛豫分散核磁共振技术表征蛋白质构象动力学，无需特殊样品制备即可获取微秒至毫秒时间尺度的动力学、热力学及结构信息。该方法适用于首次使用CPMG的研究者。

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本工作获得了NIGMS R35GM133488基金以及Roy J. Carver慈善信托基金对V.V.的资助。

1. 核磁共振样品的制备
<ol>
	<li>表达并纯化目标蛋白的2H,15N标记样品。 
	注意：尽管可以使用15N标记的蛋白样品进行CPMG弛豫弥散（RD）实验的数据采集，但全氘代（在可行的情况下）可显著提高所获数据的质量。有关全氘代蛋白制备的实验方案可参见文献13。</li>
	<li>将纯化的蛋白样品置换至已脱气的核磁共振（NMR）缓冲液中。</li>
	<li>将NMR样品转移至NMR管中。 
	注意：NMR样品的浓度需仔细优化，以最大化信噪比并尽量减少蛋白质-蛋白质相互作用的发生。通常情况下，CPMG实验的典型浓度范围为0.1–1.0 mM。</li>
</ol>
2. 核磁共振实验的首次设置
<ol>
	<li>下载并解压缩补充文件。</li>
	<li>将文件 bits.vv 和 trosy_15N_cpmg.vv（位于名为 pulseprogram 的文件夹中）复制到脉冲程序目录（&lt;path&gt;/exp/stan/nmr/lists/pp/user）中。 
	注意：请确保 trosy_15N_cpmg.vv 文件第一行中列出的 bits.vv 路径正确无误。</li>
	<li>打开采集软件，并使用命令edc将先前运行的1H-15N HSQC实验复制为新实验。</li>
	<li>使用命令pulprog，将脉冲程序 trosy_15N_cpmg.vv 加载至新创建的实验中。</li>
	<li>根据脉冲程序文件（trosy_15N_cpmg.vv）末尾提供的说明设置 CPMG 实验。</li>
</ol>
3. 核磁共振实验的常规设置
<ol>
	<li>将样品放入磁体中，并执行所有核磁共振实验的基本采集步骤：对样品进行锁场和匀场；匹配并调谐1H和15N通道。</li>
	<li>将p1和p7分别设置为1H和15N硬脉冲90°的持续时间。 
	注意：为获得最佳结果，必须仔细校准15N的90°脉冲。通常使用DMSO中100 mM的15N标记尿素样品，按照波谱仪手册所述方法完成校准。此外，还可以在实际使用的NMR样品上直接验证校准结果：采集一段1H-15N HSQC谱的第一组数据点，其中第一个INEPT模块中的15N 90°脉冲改为180°脉冲。若校准正确，则应得到一个零信号（null）。</li>
	<li>在采集窗口中，设置1H和15N维的中心频率和谱宽。 
	注意：为实现最优的水信号抑制，应将1H谱的中心频率设在水信号的共振频率处。</li>
	<li>将弛豫延迟（d30）设为0.7 T2，其中T2为蛋白质预期的15N横向弛豫时间。 
	注意：d30的值可通过实验经验优化，以获得最佳结果。</li>
	<li>使用命令vclist创建一个整数列表，对应于图1A和图1B中的参数n。确保列表中的每个数值对应不同的CPMG场强（νcpmg），关系为νcpmg = 4 × n / d30。列表中的第一个数值必须为0（这对应于跳过CPMG模块的参考实验，此时d30 = 0 s），且不得使用大于1,000 × d30 / 4的数值。超过该阈值可能导致νcpmg > 1 kHz，从而损坏探头。</li>
	<li>将l8设为vclist中的条目数，l3设为间接维的实数点数（通常l3设置在64–200范围内），并将td设为l8 × l3 × 2。 
	注意：执行步骤3.7–3.11以优化水信号抑制。</li>
	<li>将接收增益（rg）设为1；打开脉冲程序文件（edcpul），跳转至第91行，删除goto 999前的分号，并保存文件。</li>
	<li>使用命令gs调节参数spdb0（或spdw0），以最小化FID信号的强度。</li>
	<li>在脉冲程序文件的第91行重新添加分号，并保存文件。</li>
	<li>重复步骤3.7–3.9，以优化脉冲程序文件中第168行的spdb11、第179行的spdb2以及第184行的pldb2。</li>
	<li>运行命令rga以优化接收增益。</li>
	<li>将扫描次数（ns）设为8的倍数。</li>
	<li>运行命令zg以启动实验。</li>
</ol>
4. NMR 数据的处理与分析
<ol>
	<li>将名为 Process 的文件夹（补充文件）复制到包含 ser 文件的目录中。</li>
	<li>使用 sep_fid.com 和 ft2D.com 文件处理核磁共振（NMR）数据。 
	注意：sep_fid.com 和 ft2D.com 文件中提供了如何编辑处理脚本的说明。</li>
	<li>在 Sparky 中打开 CPMG_Sparky_files 目录中包含的 ucsf 文件。 
	注意：ucsf 文件由处理脚本生成。每个 vclist 条目对应一个 ucsf 文件。第一个 ucsf 文件（test_1.ucsf）包含参考实验数据。后续的 ucsf 文件（test_2.ucsf、test_3.ucsf，…，test_n.ucsf）按 νcpmg 值从低到高排序。</li>
	<li>在参考 NMR 谱图（test_1.ucsf）上选取 NMR 交叉峰。</li>
	<li>使用 Sparky 命令 pa 选中所有已选取的交叉峰。</li>
	<li>运行 Sparky 命令 rh。该命令将打开一个对话窗口。选择选项 在每个谱图的相同位置提取信号强度。点击 Setup 并勾选所有 NMR 谱图。点击 Update，并将输出文件保存至工作目录。输出文件包含所有已打开 NMR 谱图的信号强度矩阵。 
	注意：文献中已描述了使用线型拟合方法从交错式伪三维实验中更精确地提取信号强度的方案14。可用于线型拟合的免费软件可在以下网址获取：https://pint-nmr.github.io/PINT/（PINT）、https://www.ucl.ac.uk/hansen-lab/fuda/（FUDA），以及 NMRPipe（nLinLS 模块）和 SPARKY（it 模块）中。</li>
	<li>对于每个 CPMG 场，使用公式 <img alt="静态平衡方程；R₂=1/d₃₀ ln(I₀/Iₓ₃₀)；公式分析方法。" src="/files/ftp_upload/62395/62395eq03.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="公式 3"> 将信号强度转换为 R2 率，其中 I0 和 Id30 分别为参考谱图（vc = 0）和弛豫谱图（vc &gt; 0）的信号强度。 
	注意：在 补充文件 中，提供了用于将信号强度转换为 R2 率并可视化弛豫弥散（RD）曲线的电子表格模板文件（R2_calc.xls）。</li>
	<li>使用 Sparky 命令 st 读取参考谱图中的噪声水平，并对 R2 率进行误差传递。 
	注意：在 补充文件 中，提供了用于对测量得到的 R2 率进行误差传递的电子表格模板文件（R2_calc.xls）。</li>
</ol>
5. 拟合RD曲线
<ol>
	<li>复制名为 RD_fitting 的文件夹（补充文件) 到工作目录中。</li>
	<li>针对每个指定的 NMR 峰，估算 Rex 通过计算 <img alt="低态与高态下R2的方程，用于科学图示中说明动态频率变化。" src="/files/ftp_upload/62395/62395eq04.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="方程 4">. <img alt="R&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;&lt;sup&gt;lowF&lt;/sup&gt;，化学式，方程，科学计数法，教学用途" src="/files/ftp_upload/62395/62395eq05.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="公式 5"> 和 <img alt="静态平衡；数学符号 R₂^highF；物理公式表示。" src="/files/ftp_upload/62395/62395eq06.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="方程 6"> 是 R2 在最低和最高ν下测得的速率cpmg 在 vclist 中.</li>
	<li>使用 R 可视化检查 RD 曲线ex 大于估计误差两倍的数据点，并剔除所有噪声过大而无法准确建模的RD曲线。 
	注意：R 上的噪声ex 可由误差传播得到 <img alt="R&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;&lt;sup&gt;lowF&lt;/sup&gt;，化学式，方程，科学计数法，教学用途" src="/files/ftp_upload/62395/62395eq05.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="公式 5"> 和 <img alt="静态平衡；数学符号 R₂^highF；物理公式表示。" src="/files/ftp_upload/62395/62395eq06.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="公式 6">.</li>
	<li>使用所有带有 R 的 RD 曲线准备拟合脚本的输入文件ex 大于估计误差的两倍。 
	注意：输入文件准备的详细说明包含在拟合脚本中。示例输入文件作为 补充文件通常，RD 数据在两个不同的静态磁场下进行测量，并同时拟合。在本方案中，需要两个不同的输入文件（补充文件).</li>
	<li>使用提供的脚本拟合RD数据 补充文件. 
	注意：提供了两个不同的脚本，分别用于对 RD 曲线进行基于残基的拟合或全局拟合。两个脚本均使用两态交换模型和 Carver-Richards 方程对 RD 曲线进行拟合。拟合脚本中提供了更详细的说明。此外，还可使用其他软件包（如 Chemex（https://github.com/gbouvignies/ChemEx）和 CATIA（https://www.ucl.ac.uk/hansen-lab/catia/））基于 Block-McConnell 方程进行数据拟合。</li>
	<li>检验拟合参数估计值的可靠性，以降低 χ2 作为 p 的函数b 和 kex. 
	注意：降低的 χ2 在输出文件中提供。b 和 kex 可通过拟合过程中的下限和上限将参数限制为特定值。在我们的脚本中，参数 p 的下限和上限b 分别为 k 的下界 lb(2) 和上界 ub(2)ex 分别为 lb(3) 和 ub(3)。</li>
	<li>估算拟合参数的误差。可通过将脚本中的 MC_fac 值设为 1，并多次重复拟合过程（通常 &gt;20 次重复）。每个参数的误差估计为该分布的标准差。 
	注意：将 MC_fac 设置为 1 时，会生成一个合成数据集，其中向实验数据添加了基于实验误差计算的高斯分布误差。</li>
</ol>

<ol><li>Anthis, N. J., Clore, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualizing+transient+dark+states+by+NMR+spectroscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Quarterly+Reviews+of+Biophysics%22%5BJournal%5D)">Visualizing transient dark states by NMR spectroscopy.</a> Quarterly Reviews of Biophysics. 48 (1), 35-116 (2015).</li>
<li>Lisi, G. P., Loria, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Solution+NMR+spectroscopy+for+the+study+of+enzyme+allostery%5BTitle%5D)+AND+%22Chemical+Reviews%22%5BJournal%5D)">Solution NMR spectroscopy for the study of enzyme allostery.</a> Chemical Reviews. 116 (11), 6323-6369 (2016).</li>
<li>Mittermaier, A., Kay, L. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+tools+provide+new+insights+in+NMR+studies+of+protein+dynamics%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">New tools provide new insights in NMR studies of protein dynamics.</a> Science. 312 (5771), 224-228 (2006).</li>
<li>Venditti, V., Clore, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conformational+selection+and+substrate+binding+regulate+the+monomer%2Fdimer+equilibrium+of+the+C-terminal+domain+of+Escherichia+coli+enzyme+I%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Conformational selection and substrate binding regulate the monomer/dimer equilibrium of the C-terminal domain of Escherichia coli enzyme I.</a> Journal of Biological Chemistry. 287 (32), 26989-26998 (2012).</li>
<li>Venditti, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Large+interdomain+rearrangement+triggered+by+suppression+of+micro-+to+millisecond+dynamics+in+bacterial+Enzyme+I%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Large interdomain rearrangement triggered by suppression of micro- to millisecond dynamics in bacterial Enzyme I.</a> Nature Communications. 6, 5960(2015).</li>
<li>Yip, G. N., Zuiderweg, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+phase+cycle+scheme+that+significantly+suppresses+offset-dependent+artifacts+in+the+R2-CPMG+15N+relaxation+experiment%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Magnetic+Resonance%22%5BJournal%5D)">A phase cycle scheme that significantly suppresses offset-dependent artifacts in the R2-CPMG 15N relaxation experiment.</a> Journal of Magnetic Resonance. 171 (1), 25-36 (2004).</li>
<li>Mulder, F. A., Skrynnikov, N. R., Hon, B., Dahlquist, F. W., Kay, L. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measurement+of+slow+%28micros-ms%29+time+scale+dynamics+in+protein+side+chains+by+%2815%29N+relaxation+dispersion+NMR+spectroscopy%3A+application+to+Asn+and+Gln+residues+in+a+cavity+mutant+of+T4+lysozyme%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Chemical+Society%22%5BJournal%5D)">Measurement of slow (micros-ms) time scale dynamics in protein side chains by (15)N relaxation dispersion NMR spectroscopy: application to Asn and Gln residues in a cavity mutant of T4 lysozyme.</a> Journal of the American Chemical Society. 123 (5), 967-975 (2001).</li>
<li>Loria, J. P., Rance, M., Palmer, A. G. 3rd <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+TROSY+CPMG+sequence+for+characterizing+chemical+exchange+in+large+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomolecular+NMR%22%5BJournal%5D)">A TROSY CPMG sequence for characterizing chemical exchange in large proteins.</a> Journal of Biomolecular NMR. 15 (2), 151-155 (1999).</li>
<li>Dotas, R. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hybrid+thermophilic%2Fmesophilic+enzymes+reveal+a+role+for+conformational+disorder+in+regulation+of+bacterial+Enzyme+I%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Hybrid thermophilic/mesophilic enzymes reveal a role for conformational disorder in regulation of bacterial Enzyme I.</a> Journal of Molecular Biology. 432 (16), 4481-4498 (2020).</li>
<li>Purslow, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Active+site+breathing+of+human+Alkbh5+revealed+by+solution+NMR+and+accelerated+molecular+dynamics%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Active site breathing of human Alkbh5 revealed by solution NMR and accelerated molecular dynamics.</a> Biophysical Journal. 115, 1895-1905 (2018).</li>
<li>Loria, J. P., Rance, M., Palmer, A. G. 3rd <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+relaxation-compensated+Carr%E2%88%92Purcell%E2%88%92Meiboom%E2%88%92Gill+sequence+for+characterizing+chemical+exchange+by+NMR+Spectroscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Chemical+Society%22%5BJournal%5D)">A relaxation-compensated Carr−Purcell−Meiboom−Gill sequence for characterizing chemical exchange by NMR Spectroscopy.</a> Journal of the American Chemical Society. 121 (10), 2331-2332 (1999).</li>
<li>Hansen, D. F., Vallurupalli, P., Kay, L. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+improved+15N+relaxation+dispersion+experiment+for+the+measurement+of+millisecond+time-scale+dynamics+in+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Physical+Chemistry+B%22%5BJournal%5D)">An improved 15N relaxation dispersion experiment for the measurement of millisecond time-scale dynamics in proteins.</a> Journal of Physical Chemistry B. 112 (19), 5898-5904 (2008).</li>
<li>Tugarinov, V., Kanelis, V., Kay, L. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isotope+labeling+strategies+for+the+study+of+high-molecular-weight+proteins+by+solution+NMR+spectroscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Isotope labeling strategies for the study of high-molecular-weight proteins by solution NMR spectroscopy.</a> Nature Protocols. 1 (2), 749-754 (2006).</li>
<li>Niklasson, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comprehensive+analysis+of+NMR+data+using+advanced+line+shape+fitting%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomolecular+NMR%22%5BJournal%5D)">Comprehensive analysis of NMR data using advanced line shape fitting.</a> Journal of Biomolecular NMR. 69, 93-99 (2017).</li>
<li>Palmer, A. G. 3rd, Kroenke, C. D., Loria, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nuclear+magnetic+resonance+methods+for+quantifying+microsecond-to-millisecond+motions+in+biological+macromolecules%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Enzymology%22%5BJournal%5D)">Nuclear magnetic resonance methods for quantifying microsecond-to-millisecond motions in biological macromolecules.</a> Methods in Enzymology. 339, 204-238 (2001).</li>
<li>Tollinger, M., Skrynnikov, N. R., Mulder, F. A., Forman-Kay, J. D., Kay, L. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Slow+dynamics+in+folded+and+unfolded+states+of+an+SH3+domain%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Chemical+Society%22%5BJournal%5D)">Slow dynamics in folded and unfolded states of an SH3 domain.</a> Journal of the American Chemical Society. 123, 11341-11352 (2001).</li>
<li>Carver, J. P., Richards, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+general+two-site+solution+for+the+chemical+exchange+produced+dependence+of+T2+upon+the+Carr-Purcell+pulse+separation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Magnetic+Resonance%22%5BJournal%5D)">A general two-site solution for the chemical exchange produced dependence of T2 upon the Carr-Purcell pulse separation.</a> Journal of Magnetic Resonance. 6 (1), 89-105 (1972).</li>
<li>Egner, T. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Surface+Contrast%27+NMR+Reveals+Non-innocent+Role+of+Support+in+Pd%2FCeO2+Catalyzed+Phenol+Hydrogenation%5BTitle%5D)+AND+%22ChemCatChem%22%5BJournal%5D)">Surface Contrast' NMR Reveals Non-innocent Role of Support in Pd/CeO2 Catalyzed Phenol Hydrogenation.</a> ChemCatChem. 12 (6), 4160-4166 (2020).</li>
<li>Egner, T. K., Naik, P., Nelson, N. C., Slowing, I. I., Venditti, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanistic+Insight+into+Nanoparticle+Surface+Adsorption+by+Solution+NMR+Spectroscopy+in+an+Aqueous+Gel%5BTitle%5D)+AND+%22Angewandte+Chemie+%28International+Edition+in+English%29%22%5BJournal%5D)">Mechanistic Insight into Nanoparticle Surface Adsorption by Solution NMR Spectroscopy in an Aqueous Gel.</a> Angewandte Chemie (International Edition in English). 56, 9802-9806 (2017).</li>
<li>Tugarinov, V., Libich, D. S., Meyer, V., Roche, J., Clore, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+energetics+of+a+three-state+protein+folding+system+probed+by+high-pressure+relaxation+dispersion+NMR+spectroscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Angewandte+Chemie+%28International+Edition+in+English%29%22%5BJournal%5D)">The energetics of a three-state protein folding system probed by high-pressure relaxation dispersion NMR spectroscopy.</a> Angewandte Chemie (International Edition in English). 54, 11157-11161 (2015).</li>
<li>Korzhnev, D. M., Kloiber, K., Kanelis, V., Tugarinov, V., Kay, L. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Probing+slow+dynamics+in+high+molecular+weight+proteins+by+methyl-TROSY+NMR+spectroscopy%3A+application+to+a+723-residue+enzyme%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Chemical+Society%22%5BJournal%5D)">Probing slow dynamics in high molecular weight proteins by methyl-TROSY NMR spectroscopy: application to a 723-residue enzyme.</a> Journal of the American Chemical Society. 126 (12), 3964-3973 (2004).</li>
<li>Mayzel, M., Ahlner, A., Lundstrom, P., Orekhov, V. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measurement+of+protein+backbone+%2813%29CO+and+%2815%29N+relaxation+dispersion+at+high+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomolecular+NMR%22%5BJournal%5D)">Measurement of protein backbone (13)CO and (15)N relaxation dispersion at high resolution.</a> Journal of Biomolecular NMR. 69, 1-12 (2017).</li>
<li>Pritchard, R. B., Hansen, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterising+side+chains+in+large+proteins+by+protonless+%2813%29C-detected+NMR+spectroscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Characterising side chains in large proteins by protonless (13)C-detected NMR spectroscopy.</a> Nature Communications. 10, 1747(2019).</li>
</ol>

所有作者均已阅读并批准了该稿件。我们声明不存在利益冲突。

本文描述了实验室中用于获取和分析蛋白质15N RD 数据的实验方案。特别涵盖了核磁共振（NMR）样品制备、NMR 数据采集以及RD谱图分析中的关键步骤。下文讨论了RD实验获取与分析过程中的一些重要方面。然而，若需更深入地了解该实验及数据分析方法，强烈建议仔细研读原始文献3,8,11,15,16。
在制备核磁共振（NMR）样品时，必须充分考虑：任何微量（&#60;1% 比例）的状态，若与主要的、在 NMR 上可观测的物种在微秒至毫秒（µs-ms）时间尺度上发生交换，均会产生可检测的弛豫色散（RD）谱图1。因此，建议使用高度纯化的蛋白质储备液（&#62;90% 纯度），以避免污染物与被研究体系形...

Carr-Purcell Meiboom-Gill（CPMG）弛豫色散（RD）实验被常规用于表征发生在 µs通过溶液核磁共振波谱法在毫秒时间尺度上1,2,3,4,5与其他研究构象动态的方法相比，CPMG技术在现代核磁共振波谱仪上相对容易实现，无需特殊的样品制备步骤（如结晶、样品冷冻或取向排列，以及与荧光或顺磁性标签的共价偶联），并可对构象平衡进行全面表征，提供有关交换过程的结构、动力学和热力学信息。要使CPMG实验能够报告构象平衡，必须满足两个条件：（i）发生构象交换的状态（微观态）中被观测的核磁共振自旋必须具有不同的化学位移；（ii）交换过程必须发生在约~的时间尺度范围内50 µs 约10毫秒。在这些条件下，观测到的横向弛豫速率（<img alt="鲁棒性度量公式，R_obs。" src="/files/ftp_upload/62395/62395eq01v2.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="公式 1">) 是内在R的总和2 （R2 在不存在的情况下测量 µs-ms dynamics, <img alt="静力平衡方程 ΣFx=0，ΣFy=0；数学公式；教学示意图。" src="/files/ftp_upload/62395/62395eq02v3.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="公式 2">）以及横向弛豫（Rex）。Rex 对 R 的贡献2观察 可通过减小间距逐步淬灭 180° 构成脉冲序列CPMG模块的脉冲，所得的弛豫色散（RD）曲线可通过Bloch-McConnell理论进行建模，以获得微态之间的化学位移差异、各微态的分数分布以及微态之间的交换速率（图1)1,2,3.
文献中已报道了多种用于15N CPMG实验的脉冲序列和分析方法。本文描述了本实验室所采用的实验方案。具体将介绍核磁共振（NMR）样品制备、NMR实验的设置与采集，以及NMR数据的处理与分析等关键步骤（图2）。为便于该方案在其他实验室的推广应用，提供了脉冲程序、数据处理与分析脚本以及一个示例数据集作为补充文件，可从以下网址下载：(https://group.chem.iastate.edu/Venditti/downloads.html)。所提供的脉冲序列在CPMG模块中采用了四步相位循环，以抑制与偏置相关的伪影6，并编码支持多个交错实验的采集。这些交错实验具有相同的弛豫时段，但再聚焦脉冲的次数不同，从而实现不同的CPMG场强7。还需特别注意，所述脉冲程序测量的是NMR信号TROSY组分的15N R28。总体而言，该方案已成功应用于中等及较大尺寸蛋白质构象交换的表征4,5,9,10。对于较小的体系（&lt;20 kDa），建议采用基于异核单量子相干（Heteronuclear Single Quantum Coherence, HSQC）的脉冲序列11,12。

<table><tbody><tr><td>低温探头</td><td>Bruker</td><td>5mm TCI 800 H-C/N-D cryoprobe</td><td>提高灵敏度</td></tr><tr><td>重水</td><td>Sigma Aldrich</td><td>756822-1</td><td>&gt;99.8% 纯度，用于制备核磁共振样品和氘代培养物</td></tr><tr><td>手动离心机</td><td>United Scientific supply</td><td>CENTFG1</td><td>用于去除核磁共振管壁上附着的气泡或残留液体</td></tr><tr><td>高场核磁共振波谱仪</td><td>Bruker</td><td>Bruker Avance II 600, Bruker Avance 800</td><td>采集核磁共振数据</td></tr><tr><td>MATLAB</td><td>MathWorks</td><td>https://www.mathworks.com/products/get-matlab.html</td><td>核磁共振数据建模</td></tr><tr><td>核磁共振巴斯德移液管</td><td>Corning Incorporation</td><td>7095D-NMR</td><td>Pyrex 玻璃巴斯德移液管，用于将液体样品转移至核磁共振管中</td></tr><tr><td>核磁共振管</td><td>Willmad Precision</td><td>535-PP-7</td><td>5 mm 薄壁 7 英寸圆柱形玻璃管</td></tr><tr><td>NMRPipe</td><td>生物科学与生物技术研究所</td><td>https://www.ibbr.umd.edu/nmrpipe/install.html</td><td>核磁共振数据处理</td></tr><tr><td>SPARKY</td><td>加利福尼亚大学旧金山分校</td><td>https://www.cgl.ucsf.edu/home/sparky/</td><td>核磁共振数据分析</td></tr><tr><td>Tospin 3.2（或更新版本）</td><td>Bruker</td><td>https://www.bruker.com/protected/en/services/software-downloads/nmr/pc/pc-topspin.html</td><td>数据采集软件</td></tr></tbody></table>

15n cpmg 驰豫弥散用于研究蛋白质构象动力学的 µs-ms 时间尺度

15N CPMG Relaxation Dispersion for the Investigation of Protein Conformational Dynamics on the &#181;s-ms Timescale

蛋白质构象动力学在调控酶催化、配体结合、变构效应和信号转导等重要生物学过程中发挥着基础性作用。理解结构与动力学之间的平衡如何调控生物学功能，是现代结构生物学的一个新兴前沿领域，并推动了多项技术和方法的发展。其中，CPMG弛豫色散溶液核磁共振方法能够提供关于发生在微秒至毫秒时间尺度上的蛋白质构象平衡的结构、动力学和热力学信息，具有独特的原子分辨率。 &#181;微秒至毫秒时间尺度。本文介绍了15N弛豫弥散实验数据采集与分析的详细方案。&#160;15N 弛豫弥散实验。以细菌酶I的C端结构域在微秒至毫秒时间尺度上的动力学分析为例，展示了该分析流程。 &#181;细菌酶I的C端结构域中的μs-ms动力学被展示。

本方案可获得每个峰的RD谱型 1H-15N TROSY 谱图3A）。从获得的RD谱图中，可以估算交换作用对弛豫的贡献 15每条主链酰胺基团的N横向弛豫图3A3B）。通过绘制 Rex 根据所研究蛋白质的三维结构，可以鉴定出在构象交换过程中发生改变的结构区域 µs毫秒时间尺度（图3C）。使用Carver-Richards方程对RD曲线进行建模，可获得交换过程的热力学和动力学参数，例如各状态在平衡状态下的摩尔分数以及这些状态之间的交换速率（图1, 图3D）。这些热力学和动力学参数的温度依赖性（通过在多个实验温度下进行RD实验获得）可分别利用范特霍夫（van't Hoff）方程和艾林（Eyring）方程进行建模，从而获得关于构象交...

本文详细描述了在实验室中通过溶液核磁共振波谱法获取和分析15N弛豫色散谱的实验方案。

15N CPMG 驰豫弥散用于研究蛋白质构象动力学的 µs-ms 时间尺度

蛋白质构象动力学在调控酶催化、配体结合、别构效应和信号转导等过程中发挥着基础性作用，这些过程至关重要……

该方案可用于检测和表征蛋白质的构象动态，这对于理解多种细胞过程至关重要。与其他方法相比，该方法无需特殊的样品制备步骤，且能够全面表征构象平衡的动力学、热力学和结构特征。CPMG弛豫色散技术可更广泛地应用于核酸及其他生物大分子的构象动态表征，也可用于配体-纳米颗粒相互作用的表征。本方案主要面向初次使用 CPMG 的用户，因此是一个良好的起点。然而，我们期望用户已了解运行常规 NMR 实验的基本步骤。首次设置核磁共振（NMR）实验时，首先下载并解压缩这些补充文件。复制 Bits.vv 和 trosy_15N_CPMG。将脉冲程序文件夹中的 vv 文件复制到脉冲程序目录中。打开采集软件，使用 EDC 命令将之前运行过的氢-氮15 HSQC 实验复制到新实验中。使用脉冲程序命令加载 trosy_15N_CPMG。将vv脉冲程序文件导入新创建的实验中。然后根据脉冲程序文件末尾的说明设置CPMG实验。要设置常规NMR实验，请将样品放入磁体中，并执行所有基本的NMR采样步骤。将P1设置为氢原子90度硬脉冲的持续时间，将P7设置为氮-15 90度硬脉冲的持续时间。在采集窗口中，设置氢和氮-15维度的中心频率和谱宽。将弛豫延迟设置为0.7倍T2，并使用VC列表命令创建一组与N相对应的整数列表。在确认列表中的每一项均对应一个不同的CPMG场强（根据公式：CPMG场强 = 4N × γ / D30）后，检查列表中的第一个数值是否为零。将L8设为VC列表中的条目数，L3设为间接维的实数点数，1TD设为L8乘以L3再乘以2。为优化水峰抑制，将接收增益设为1，并输入EDC pull以打开脉冲程序文件。在第91行，删除goto 999前的分号，然后保存文件。使用 GS 命令调整 SPDB0 参数，以最小化 FID 信号的强度。当信号强度被调整后，在脉冲程序文件的第 91 行重新插入分号，并保存文件。为优化 SPDB11，将接收增益设为 1，并将类型 EDC 拉动以打开脉冲程序文件。在第 168 行，删除 goto 999 前的分号，并保存文件。使用 GS 命令调节 SPDB11 参数，以最小化 FID 信号的强度。当信号强度被调整后，在第 168 行重新插入分号，并保存文件。为了优化 SPDB2，将接收增益设为 1，并输入 EDC pull 以打开脉冲程序文件。在第 179 行，删除 goto 999 前的分号，然后保存文件。使用 GS 命令调节 SPDB2 参数，以最小化 FID 信号的强度。当信号强度被修改后，在脉冲程序文件的第179行重新插入分号，并保存文件。为优化PLDB2，将接收增益设为1，输入EDC pull以打开脉冲程序文件。在第184行，删除goto 999前的分号，然后保存文件。使用 GS 命令调整 PLDB2 参数，以最小化 FID 信号的强度。当信号强度被调整后，在脉冲程序文件的第 184 行重新插入分号，并保存文件。运行 RGA 命令以优化接收增益。然后运行 ZG 命令以开始实验。在该图中，可以观察到针对氢-氮-15 TROSY 谱中每个峰所获得的弛豫色散曲线结果。根据所获得的弛豫色散曲线，可估算每个骨架酰胺基团氮-15 横向弛豫的交换贡献。通过将横向弛豫数据绘制在所研究蛋白质的三维结构上，可以鉴定出在微秒至毫秒时间尺度上发生构象交换的结构区域。利用Carver-Richards方程对弛豫色散曲线进行建模，可获得该交换过程的热力学和动力学参数，例如平衡状态下各构象态的占比以及这些状态之间的交换速率。随后，可分别通过van't Hoff方程和Eyring方程对这些热力学和动力学参数的温度依赖性进行建模，从而获得关于构象交换过程能量学的详细信息。必须仔细优化所有采集参数，特别是P7。同时，制备高纯度且均一的样品以避免虚假的色散现象也至关重要。利用本方案获得的动力学、热力学和化学芯片参数可用于推导发生构象交换物种的能量学和结构信息。通过CPMG方法获得的蛋白质构象动力学表征，为理解信号传导和酶活性提供了关键信息，并为药物设计提供了新的视角。

15n-cpmg-relaxation-dispersion-for-investigation-protein

Research

科研

JoVE Journal

Biochemistry

生物化学

15N CPMG 放松分散，用于研究 μs-ms 时间尺度上的蛋白质符合性动力学

原子分辨率下的超分子蛋白质组装体结构因其在多种生物现象中发挥的关键作用而具有重要意义。本文介绍了一种利用魔角旋转固体核磁共振波谱技术（MAS...

利用固态核磁共振波谱法对大分子组装体进行原子尺度结构研究

核磁共振（NMR）波谱法能够以残基特异性的方式表征蛋白质的结构动力学。本文提供了一套实用的实验方案，用于采集对皮秒到纳秒时间尺度敏感的NMR 15N R1 和 R2...

NMR 15N 弛豫实验用于研究蛋白质的皮秒至纳秒级结构动力学

本基于核磁共振（NMR）的实验方案利用氰病毒素-N（cyanovirin-N）与D-甘露糖研究弱蛋白-聚糖相互作用。通过结合配体检测与蛋白检测方法，该方案可定位结合位点、检测变构效应并鉴定碰撞复合物。该方法概述了样品制备与数据分析流程，为聚糖特异性诊断及识别机制提供重要的结构与动态信息。...

探索蛋白质-聚糖相互作用：核磁共振技术的进展

本文描述了一种用于评估整合膜蛋白相互作用与组装的方法 体外 在脂质邻近环境中与多种伴侣因子相互作用。...

利用支架脂质体在体外重建脂质邻近的蛋白质-蛋白质相互作用 In Vitro

构象柔性在蛋白质功能中起着关键作用。本文介绍了将时间分辨电喷雾电离质谱与氢-氘交换相结合，用于研究有序和无序蛋白质中驱动功能的快速结构变化。...

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本文介绍一种简单的方法，可快速制备数百个线虫生长培养基琼脂96孔培养板，每孔中秀丽隐杆线虫（Caenorhabditis...

一种在Caenorhabditis elegans中进行高通量化学筛选的简单方法

生物体在其生命周期中面临的最具挑战性的应激条件之一是氧化剂的积累。在氧化应激过程中，细胞高度依赖分子伴侣。本文介绍了用于研究氧化还原调控的抗聚集活性的方法，以及利用氢氘交换质谱（HDX-MS）监测调控伴侣功能的结构变化的方法。...

利用氢氘交换质谱法定义Hsp33的氧化还原调控型分子伴侣活性并绘制其构象变化

蛋白质-蛋白质相互作用对生物系统至关重要，对结合动力学的研究有助于揭示蛋白质复合物的动态特性与功能。本文介绍一种利用荧光共振能量转移和停流技术来定量测定蛋白质复合物动力学参数的方法。...

利用体外荧光共振能量转移研究蛋白质复合物在毫秒时间尺度上的动态变化

本文介绍了一种在单分子水平上评估复杂蛋白质样品中每种蛋白质组分标记均一性的实验方案。...

单分子水平下蛋白质组范围内的标记均一性定量分析

本实验方案的目的是展示如何利用晶格光片显微镜对活细胞中表面受体的动力学过程进行四维可视化观察。此处展示的是CD4+原代T细胞上的T细胞受体。...

使用晶格光片显微镜四维可视化T细胞受体表面动力学

学习使用¹⁵N CPMG弛豫分散核磁共振技术表征蛋白质构象动力学，无需特殊样品制备即可获取微秒至毫秒时间尺度的动力学、热力学及结构信息。该方法适用于首次使用CPMG的研究者。

¹⁵N CPMG 驰豫弥散用于研究蛋白质构象动力学的 µs-ms 时间尺度

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