使用Tol2转座子介导的人工microRNA的转基因表达在胚胎雏鸡视网膜中实现功能丧失的方法

该方法为研究雏鸡视网膜发育提供了一种功能丧失方法。该技术支持快速和持续地抑制视网膜特定区域中的靶基因。这种方法也可以应用于雏鸡胚胎的其他部分，包括神经和非神经组织。

对于卵电穿孔，通过将25毫克的Fast Green FCF溶解在10毫升PBS中来制备0.25%的Fast Green Solution，然后使用0.2微米的注射器过滤器过滤溶液。接下来，通过将microRNA祖母绿GFP质粒与Tol2转座酶表达质粒以2:1的比例混合来制备DNA鸡尾酒注射溶液。然后将制备的Fast Green溶液以1:10的比例添加到DNA混合物中，以可视化注射区域。

接下来，设置显微注射装置。该设备由汉密尔顿注射器、18 号两英寸针、两厘米长的聚氯乙烯管和微量移液器针组成。用重矿物油填充汉密尔顿注射器，然后将18号针头连接到注射器上，并通过按下注射器柱塞来填充针头的内部空间。

接下来，将聚氯乙烯管连接到针头的末端，并在管子中填充油。将拉动的微量移液器针头连接到管子上。然后在使用细镊子的解剖显微镜下，将针尖折断至直径为10至20微米，以开一个小口。

用油填充整个针头。接下来，将五微升彩色DNA鸡尾酒放入培养皿上。在解剖显微镜下，将微量移液器针头的尖端放入培养皿上的DNA溶液中，然后将溶液缓慢抽入针中。

在针头内外的压力平衡后，将针尖从DNA溶液中取出，并将其浸没在无菌PBS中的小烧杯中直至注射。然后要设置电穿孔设备，请将一对铂电极牢固地固定在显微操纵器上。将电极尖端之间的间距调整为两毫米，并使用电缆将电极连接到方波脉冲发生器。

接下来，对于DNA显微注射，从培养箱中取出受精白里格角牛卵，并用浸泡在70%乙醇中的薄纸擦拭鸡蛋表面。然后将 18 号针头连接到 10 毫升注射器上，并将针头插入鸡蛋的钝端，向下倾斜以避免损坏蛋黄。从鸡蛋中取出两到三毫升白蛋白后，用一块透明胶带密封孔，并用光烛蜡烛，以确保胚胎和卵黄膜与壳分离。

接下来，使用镊子从鸡蛋顶部取出一块蛋壳，露出胚胎。任何时候不要窗口超过五个鸡蛋，以防止在电穿孔过程中胚胎变干。将针尖从其近端以45度角插入视囊泡，并通过缓慢按下柱塞直到蓝色溶液充满管腔来注射DNA混合物。

取出针头，并将其尖端放回PBS。对于电穿孔，将脉冲电压设置为 15 伏，脉冲长度设置为 15 毫秒，脉冲间隔设置为 915 毫秒，脉冲数设置为 5。在胚胎上方的玻璃膜上加入几滴HBSS后，使用显微操纵器将电极降低到垂直于胚胎前后轴的HBSS中。

将电极放在视囊泡的两侧，确保电极不接触胚胎或血管，然后施加脉冲电场。电穿孔完成后，取出电极，并用水浸泡的无菌棉签轻轻清洁电极，以避免白蛋白积聚。用透明胶带密封窗口，并重新孵育胚胎直到所需的发育阶段。

将单个前microRNA序列转染到表达HEK293T细胞的Nel AP细胞中，导致针对核苷酸482至502、910至930和2461至2481的构建体显着抑制Nel表达。链上两个microRNA序列显著提高了敲低效率。与未链的单个前microRNA序列相比，所有三种组合均显示出增强的抑制活性。

在转染后至少13天观察到强烈的抑制。当靶向核苷酸 482 至 502 和 2461 至 2481 的 Nel 前 microRNA 构建体与转座酶表达载体共转染到鸡视网膜中时，在胚胎第 4.5 天，表达祖母绿 GFP 的细胞中视网膜色素上皮中的 Nel 表达显着降低。在八天大的胚胎中，Nel在视网膜神经节细胞中的表达也下降。

相比之下，视网膜中的Nel表达不受对照microRNA引入的影响。按照该程序，可以使用各种方法检查对靶基因抑制的影响，例如检查细胞增殖和分化，细胞死亡以及细胞和轴突示踪。