利用 Tol2 转座子介导的 人工 microRNA 转基因表达在鸡胚视网膜中进行功能缺失研究

该方法为鸡胚视网膜发育研究提供了一种功能缺失的研究手段。该技术可在视网膜的特定区域实现对靶基因的快速且持续的抑制。此方法也可应用于鸡胚的其他部位，包括神经组织和非神经组织。

进行体内电穿孔时，通过将25毫克快绿FCF溶解于10毫升PBS中配制0.25%快绿溶液，然后使用0.2微米注射器滤器过滤该溶液。接下来，通过将microRNA翡翠绿色荧光蛋白质粒与Tol2转座酶表达质粒按2:1的比例混合，制备DNA混合注射液。然后按1:10的比例将制备好的快绿溶液加入DNA混合液中，以便可视化注射区域。

接下来，设置显微注射装置。该装置由一个汉密尔顿注射器、一根18号两英寸针头、一段两厘米长的聚氯乙烯管以及一根微毛细管针头组成。用重矿物油填充汉密尔顿注射器，然后将18号针头连接到注射器上，并通过推动注射器活塞使矿物油充满针头内部空间。

接下来，将聚氯乙烯管连接到针头末端，并用油充满管道。将拉制的微移液针连接到管道上。然后在解剖显微镜下，使用精细镊子将针尖折断，使其顶端直径为10至20微米，形成一个小开口。

用油充满整个针头。接下来，将五微升带颜色的DNA混合液滴加到培养皿上。在解剖显微镜下，将微量移液器针头的尖端插入培养皿中的DNA溶液，然后缓慢将溶液吸入针头中。

当针头内外压力达到平衡后，将针尖从DNA溶液中取出，并保持浸没在小烧杯中的无菌PBS中，直至进行注射。然后设置电穿孔装置，使用电极夹将一对铂电极牢固地固定在显微操作器上。调节电极尖端之间的距离至2毫米，并通过导线将电极连接至方波脉冲发生器。

接下来进行DNA显微注射时，从孵育器中取出一枚受精的白来航鸡鸡蛋，用浸有70%乙醇的纸巾擦拭蛋壳表面。然后将一根18号针头连接至10毫升注射器上，从鸡蛋的钝端斜向下插入针头，以避免损伤蛋黄。从鸡蛋中抽出2至3毫升蛋清后，用一小片透明胶带封住穿刺孔，并用透射光照射鸡蛋（照蛋），确认胚胎和卵黄膜已与蛋壳分离。

接着，使用镊子从鸡蛋顶部移除一块蛋壳，暴露胚胎。在电穿孔过程中，任何时候均不得超过五个鸡蛋进行开窗操作，以防止胚胎干燥。将针头尖端以45度角从视泡的近端侧插入，缓慢按压注射器推杆，注入DNA混合液，直至蓝色溶液充满腔室。

拔出针头，并将其尖端重新放入 PBS 中。进行电穿孔时，将脉冲电压设为 15 伏，脉冲时长设为 15 毫秒，脉冲间隔设为 915 毫秒，脉冲次数设为五次。在胚胎卵黄膜上滴加数滴 HBSS 后，使用显微操作仪将电极垂直于胚胎的头尾轴方向缓缓浸入 HBSS 中。

将电极置于视泡两侧，确保电极不接触胚胎或血管，然后施加脉冲电场。电穿孔完成后，移除电极，并用浸水的无菌棉签轻轻清洁电极，以避免白蛋白积聚。用透明胶带密封窗口，将胚胎重新放入培养箱中继续孵育，直至达到所需发育阶段。

将单个pre-microRNA序列转染至表达Nel AP的HEK293T细胞中，发现针对第482至502、910至930以及2461至2481位核苷酸的构建体可显著抑制Nel的表达。将两个microRNA序列串联后，基因敲低效率显著提高。与未串联的单个pre-microRNA序列相比，所有三种组合均表现出更强的抑制活性。

转染后至少13天仍可观察到显著的抑制效果。当将靶向第482至502位和第2461至2481位核苷酸的Nel前体miRNA构建体与转座酶表达载体共转染至鸡视网膜时，在胚胎发育第4.5天，视网膜色素上皮细胞中表达翠绿色GFP的细胞内Nel表达显著降低。在8天龄的胚胎中，视网膜神经节细胞内的Nel表达也有所下降。

相比之下，对照 microRNA 的导入并未影响视网膜中 Nel 的表达。通过该操作，可采用多种方法检测靶基因抑制的效果，例如细胞增殖与分化、细胞死亡以及细胞和轴突示踪分析。