Name: ApoE小鼠后肢缺血的改进手术模型-/- 使用微型切口 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-05-13T12:30:00.000+00:00
Duration: 5 min 47 s
Description: 了解使用微型切口在ApoE小鼠中建立后肢缺血模型的改进手术方法。该技术通过股动脉结扎诱导缺血性坏死，为研究血管病理和缺血再灌注损伤提供了低侵入性的实验平台。

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作者感谢 Viktoria Skude、Alexander Schlund 和 Felix Hörner 提供的出色技术支持。

注意：所有实验操作均按照欧盟指南 EC 2010/63/EU 进行，并已获得德国当地法律法规的批准（35-9185.81/G[1]239/18）。使用十只雄性 ApoE-/- C57BL/6J 背景的小鼠，体重为 29.6–38.0 g，在 12 小时光照/12 小时黑暗循环条件下饲养，并饲喂西方饮食（含 1.25% 胆固醇和 21% 脂肪）和水 随意摄取 持续12周，从8周龄开始。在20周龄小鼠上按如下所述进行HLI手术。
1. 在ApoE-/-小鼠中诱导HLI
<ol>
	<li>准备手术所需的设备和工具（参见材料表和图1）。&#160;使用前通过高压灭菌法对手术器械进行灭菌，并在手术过程中使用玻璃珠灭菌器。</li>
	<li>在所有手术操作前，通过皮下注射（S.C.）给予小鼠咪达唑仑（5 mg/kg）、美托咪啶（0.05 mg/ml/kg）和芬太尼（0.5 mg/kg）混合物进行麻醉。
	<ol>
		<li>麻醉起效后，使用兽用眼膏涂抹眼睛以防止干燥，并确认前肢和后肢无足底回缩反射。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>随后将小鼠置于加热垫上，以维持核心体温在约37 °C。使用棉签和脱毛膏，小心清除右侧后肢皮肤上的毛发。 
	注意：脱毛膏应足量使用，覆盖整个后肢，尤其是将要切开的腹股沟区域。脱毛时间应少于3分钟，之后用湿润的棉签擦拭2至3次以清除脱毛膏。</li>
	<li>将小鼠仰卧位放置在解剖显微镜下的加热垫上。使用皮肤消毒剂&#160;（参见&#160;材料表）&#160;对小鼠皮肤进行消毒。随后使用尖头镊子和手术剪在腹股沟区域中部做一个约3-4 mm的切口。手术步骤示意图见图2。</li>
	<li>借助精细尖头镊子小心去除皮下脂肪组织，暴露近端股骨神经血管束。使用精细尖头镊子小心刺破股鞘膜。用生理盐水湿润的棉签将股动脉（FA）小心地与股神经（FN）和股静脉（FV）分离。</li>
	<li>将两根7-0可吸收缝线穿过近端FA，并使用弹簧剪打双结，在两结之间切断FA。</li>
	<li>为暴露远端FA，将一根7-0可吸收缝线穿过切口下缘，并轻轻将切口牵拉至后肢右侧膝部区域。</li>
	<li>小心拨开皮下组织以暴露神经血管束。使用精细尖头镊子刺破股鞘膜，并将FA从FV和FN中分离出来。</li>
	<li>将两根7-0可吸收缝线穿过远端FA，并打双结。使用弹簧剪在两结之间切断FA。 
	注意：每只小鼠的左后肢未进行结扎，作为对照。</li>
	<li>随后使用6-0可吸收缝线缝合切口。将小鼠置于清洁笼子中的加热垫上，并持续监测其生命体征直至苏醒。术后给予镇痛药物：皮下注射布托啡诺（0.1 mg/kg体重，每8小时一次，持续48 h）。术后48 h开始，在饮水中给予安乃近（24 mg/5 mL水，相当于每日4次，每次200 mg/kg）。</li>
</ol>
2. 磁共振成像
注意：DLFA 手术后一天，小鼠必须接受 MRI 扫描以评估 FA 阻塞情况。
<ol>
	<li>将小鼠放入透明诱导室中，使用含1.5-2%异氟烷的空气麻醉小鼠，直至其翻正反射消失。</li>
	<li>将小鼠置于配备咬合固定器的加热动物床面上，并通过激光控制系统将其定位至磁体方向。维持体温在37±1 °C。</li>
	<li>在图像采集过程中，持续使用含1.5-2%异氟烷的空气维持麻醉，并通过压力探头监测呼吸。</li>
	<li>采用三维（3D）飞行时间（TOF）血管成像序列，在横断面方向采集图像，参数为回波时间（TE）/重复时间（TR）/翻转角（FA）= 2 ms/12 ms/13°，信号平均4次，采集矩阵为178 x 144，重建至256 x 192，共采集121层切片，最终获得各向同性分辨率为0.15 mm3的图像。为抑制静脉信号，在后肢远端位置设置饱和带。</li>
</ol>
3. 临床评估与随访
<ol>
	<li>评估1中的功能恢复情况st, 3rd, 5th，以及 7th 术后数天内采用功能评分Tarlov量表18,19 (表1).</li>
</ol>
4. 组织学评估
<ol>
	<li>手术后第7天，注射戊巴比妥钠（115 mg/kg）处死小鼠。</li>
	<li>通过左心室灌注含1%多聚甲醛（PFA）的磷酸盐缓冲液（PBS）（每只小鼠100 mL）。将小鼠双侧腓肠肌（Gm）在4% PFA中固定，4 °C过夜。</li>
	<li>按照先前描述的方案20将样本包埋于石蜡中。
	<ol>
		<li>使用切片机对石蜡包埋的组织块切片，厚度为4–5 µm。借助圆形画笔，将切下的组织切片放入维持在42 °C的水浴中。</li>
		<li>将载玻片以45°角插入水中，并小心地将其置于待收集的一组切片下方。</li>
		<li>小心地将载玻片从水中提起，使切片附着于载玻片上，并在37 °C的台式孵育箱中干燥过夜。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>对石蜡切片进行苏木精-伊红（HE）染色。
	<ol>
		<li>将带有切片的载玻片放入玻片架中。准备3个盛有新鲜二甲苯的容器，将载玻片依次放入每个容器中5分钟，以脱去切片中的石蜡。</li>
		<li>依次将切片浸入96%、80%、70%、50%、30%乙醇及去离子水中，每步5分钟，进行再水化。</li>
		<li>用苏木精溶液染色10分钟。</li>
		<li>将切片转移至盛有去离子水的容器中，并在流动的自来水下冲洗5分钟。</li>
		<li>在显微镜下观察苏木精染色强度。若染色可清晰识别细胞核，则继续下一步操作；若染色强度不足以识别细胞核或染色较浅，需将载玻片再次放入苏木精溶液中1分钟，重复水洗步骤（步骤4.4.4），然后再次检查。</li>
		<li>用伊红-Y溶液复染5分钟。</li>
		<li>依次将切片浸入去离子水以及30%、50%、70%、80%、96%乙醇中，每步10秒，进行脱水。随后，将切片依次放入3个盛有新鲜二甲苯的容器中，每步10秒。</li>
		<li>将载玻片水平放置于显微镜载玻片储存盒中，切片面朝上。在载玻片上滴加足量封片介质，并加盖盖玻片进行封片。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>对石蜡切片进行免疫组织化学（IHC）染色。
	<ol>
		<li>重复步骤4.4.1–4.4.2的脱蜡和再水化操作。随后，将切片浸入含10 mM柠檬酸钠缓冲液（pH 6）的容器中，并在微波炉中加热至沸腾。 
		注意：由于样品过热或加热不足会导致染色不一致，应将温度维持在略低于沸点的水平，持续10分钟。</li>
		<li>接着，在室温下静置冷却30分钟。之后，用PBS洗涤切片三次，每次5分钟。小心擦干样品周围区域，并使用疏水笔在样品周围画一个大圆圈。 
		注意：切勿触碰样品。使用疏水笔标记可形成疏水边界，有助于减少抗体溶液的使用量。</li>
		<li>将切片置于含0.3% H2O2的PBS中孵育10分钟，以淬灭内源性过氧化物酶活性。随后，在湿盒中室温下用400 µL封闭缓冲液（含3%牛血清白蛋白和0.3%非离子型去污剂的PBS）封闭切片1小时。</li>
		<li>用PBS洗涤切片5分钟。然后加入100–400 µL稀释后的抗CD31抗体（1:250），确保完全覆盖切片。接着，在湿盒中4 °C孵育过夜。 
		注意：确保切片被抗体溶液完全覆盖。</li>
		<li>去除一抗，用PBS洗涤切片三次，每次5分钟。</li>
		<li>将1滴DAB浓缩液加入1 mL DAB稀释液中，充分混匀，配制3,3'-二氨基联苯胺（DAB）混合液。随后，向切片上加入100–400 µL DAB混合液，并密切肉眼观察约2分钟，直至出现可接受的染色强度。 
		注意：确保切片被DAB混合液完全覆盖。</li>
		<li>之后，在流动自来水下冲洗5分钟。按照步骤4.4.3–4.4.5所述进行苏木精染色。</li>
		<li>按照步骤4.4.6所述进行伊红-Y染色，按照步骤4.4.7所述进行脱水操作。</li>
		<li>使用封片介质加盖盖玻片封片。使用ImageJ软件在5个随机选取的视野（40倍）中估算CD31阳性区域所占百分比（%），该指标可作为微血管密度的评估参数，方法如前所述21。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
5. 统计分析
<ol>
	<li>使用统计分析软件将结果表示为均值 ± 标准差，并对比较进行非配对 t 检验。当 P &#60; 0.05 时，认为差异具有统计学显著性。</li>
</ol>

作者声明，本文内容的撰写不存在任何可能被解释为潜在利益冲突的商业或财务关系。

本研究报道了一种改良的、简化的且手术效率更高的方法，通过3-4 mm的切口对ApoE-/-小鼠股动脉（FA）近端和远端进行双重结扎，以建立下肢缺血（HLI）模型，且无需对实验室设备进行任何升级。该方法的主要特点是与此前报道的小鼠HLI模型研究8,9,10,11,12,15,20,22,23,24相比，切口更小。
<p class="jove_...

目前在血管疾病（如外周动脉疾病（PAD））的研究中，尚缺乏满足需求的临床前动物模型。尽管在诊断和治疗方面已取得显著进展，2018年全球PAD患者仍超过2亿人1，且患者数量持续增长。尽管已有多种新型治疗策略被报道2,3,4,5,6,7，但这些治疗方法成功转化为临床应用仍面临巨大挑战。因此，迫切需要建立可靠且具有临床相关性的in vivo实验模型，以模拟人类疾病的病理状态，从而深入研究这些新型治疗手段在治疗PAD中的潜在机制和有效性6,7。
高脂血症和动脉粥样硬化（AS）是外周动脉疾病（PAD）发生的主要危险因素。载脂蛋白E基因敲除（ApoE-/-）小鼠在高脂饮食条件下表现出脂肪代谢异常和高脂血症，并继而形成动脉粥样硬化斑块，因此ApoE-/-小鼠是模拟临床相关PAD模型的最佳选择。目前，临床前的后肢缺血（HLI）动物模型通常通过股动脉双结扎（DLFA）方法建立，该方法是全球实验室最广泛采用的技术8,9,10,11,12,13,14,15，用于模拟慢性基础上的急性缺血。然而，该方法通常需要较大且具有侵入性的切口。此外，它不可避免地导致实验动物（尤其是小鼠）遭受更严重的疼痛损伤和炎症反应，从而影响后续实验结果5,6,16,17。本文介绍了一种在APOE-/-小鼠中建立慢性基础上急性HLI模型的方法，仅需使用极小切口即可完成。

<table><tbody><tr><td>10倍磷酸盐缓冲液</td><td>Roth</td><td>9143.1</td><td>用于苏木精-伊红染色和免疫组织化学染色</td></tr><tr><td>30% H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Roth</td><td>9681.2</td><td>用于免疫组织化学染色</td></tr><tr><td>6-0 可吸收缝线</td><td>PROLENE</td><td>8776H</td><td>用于皮肤缝合</td></tr><tr><td>6-0 可吸收缝线</td><td>PROLENE</td><td>EP8706</td><td>用于手术</td></tr><tr><td>7-0 可吸收缝线</td><td>PROLENE</td><td>EH8021E</td><td>用于结扎动脉</td></tr><tr><td>7-0 可吸收缝线</td><td>PROLENE</td><td>EP8755</td><td>用于手术</td></tr><tr><td>乙酸</td><td>Roth</td><td>6755.1</td><td>用于苏木精-伊红染色</td></tr><tr><td>白蛋白 V 组分</td><td>Roth</td><td>8076.2</td><td>用于免疫组织化学染色</td></tr><tr><td>高压灭菌器</td><td>Systec GmbH</td><td>Systec VX-150</td><td>用于手术器械的灭菌</td></tr><tr><td>Axio vert A1 显微镜</td><td>Carl Zeiss</td><td>ZEISS Axio Vert.A1</td><td>用于观察和拍摄苏木精-伊红染色及免疫组织化学染色图像</td></tr><tr><td>Bruker BioSpec 94/20 AVIII</td><td>Bruker Biospin MRI GmbH</td><td>N/A</td><td>扫描股动脉阻塞情况</td></tr><tr><td>Buprenovet Sine 0.3 mg/ml</td><td>Bayer AG</td><td>2542 (WDT)</td><td>用于术后镇痛管理。剂量：每8小时按0.1 mg/kg体重给药，持续48小时</td></tr><tr><td>CD31 抗体</td><td>Abcam</td><td>ab28364</td><td>用于免疫组织化学染色</td></tr><tr><td>伊红Y水溶液（0.5%）</td><td>Roth</td><td>X883.1</td><td>用于苏木精-伊红染色</td></tr><tr><td>pH 6 抗原修复液</td><td>Leica Biosystems</td><td>6046945</td><td>用于免疫组织化学染色</td></tr><tr><td>乙醇 &amp;ge; 99.5%</td><td>Roth</td><td>5054.1</td><td>用于苏木精-伊红染色和免疫组织化学染色</td></tr><tr><td>芬太尼</td><td>Cayman Chemical</td><td>437-38-7</td><td>用于麻醉</td></tr><tr><td>精细尖头镊子</td><td>Medixplus</td><td>93-4505S</td><td>用于分离动脉与神经和静脉</td></tr><tr><td>玻璃珠灭菌器</td><td>Simon Keller</td><td>Type 250</td><td>用于手术器械的灭菌</td></tr><tr><td>弯头Graefe虹膜镊</td><td>VUBU</td><td>VUBU-02-72207</td><td>用于钝性分离皮肤和皮下组织</td></tr><tr><td>脱毛膏，Veet（含芦荟）</td><td>Reckitt Benckiser</td><td>108972</td><td>去除小鼠后肢毛发</td></tr><tr><td>加热板</td><td>ST&amp;Ouml;RK-TRONIC</td><td>7042092</td><td>维持小鼠体温稳定</td></tr><tr><td>苏木精</td><td>Roth</td><td>T865.2</td><td>用于苏木精-伊红染色和免疫组织化学染色</td></tr><tr><td>Leica 手术显微镜</td><td>Leica</td><td>M651</td><td>放大视野以方便手术操作</td></tr><tr><td>液体DAB+底物显色系统</td><td>Dako</td><td>K3468</td><td>用于免疫组织化学染色</td></tr><tr><td>雄性ApoE-/-小鼠</td><td>Charles River Laboratories</td><td>N/A</td><td>用于建立外周动脉疾病小鼠模型</td></tr><tr><td>美托咪定</td><td>Cayman Chemical</td><td>128366-50-7</td><td>用于麻醉</td></tr><tr><td>微型持针器</td><td>Black &amp;amp; Black Surgical</td><td>B3B-18-8</td><td>用于夹持缝合针</td></tr><tr><td>微型打结镊</td><td>Life Saver Surgical Industries</td><td>PS-MSF-145</td><td>用于辅助手术中打结</td></tr><tr><td>切片机</td><td>Biobase</td><td>Bk-Mt268m</td><td>用于组织切片</td></tr><tr><td>咪达唑仑</td><td>Ratiopharm</td><td>44856.01.00</td><td>用于麻醉</td></tr><tr><td>磁共振兼容小型动物监测与门控系统，型号1025</td><td>SA Instruments</td><td>N/a</td><td>在MRI扫描期间监测动物生命体征</td></tr><tr><td>无色Octeniderm</td><td>Sch&amp;uuml;lke &amp;amp; Mayr GmbH</td><td>180212</td><td>用于皮肤消毒</td></tr><tr><td>眼鼻用软膏</td><td>Bayer AG</td><td>1578675</td><td>在麻醉期间保持眼睛湿润</td></tr><tr><td>多聚甲醛</td><td>Roth</td><td>0335.1</td><td>用于组织固定</td></tr><tr><td>戊巴比妥</td><td>Nembutal</td><td>76-74-4</td><td>用于麻醉</td></tr><tr><td>生理盐水</td><td>DeltaSelect</td><td>1299.99.99</td><td>用于麻醉</td></tr><tr><td>弹簧手柄精细尖头剪刀</td><td>Black &amp;amp; Black Surgical</td><td>B66167</td><td>用于剪切动脉</td></tr><tr><td>SuperCut 剪刀</td><td>Black &amp;amp; Black Surgical</td><td>B55992</td><td>用于剪切皮肤</td></tr><tr><td>曲拉通X-100</td><td>Roth</td><td>9002-93-1</td><td>用于免疫组织化学染色</td></tr><tr><td>西方饮食，含1.25%胆固醇</td><td>ssniff Spezialdi&amp;auml;ten GmbH</td><td>E15723-34</td><td>小鼠饲料</td></tr><tr><td>二甲苯</td><td>Roth</td><td>4436.3</td><td>用于苏木精-伊红染色和免疫组织化学染色</td></tr></tbody></table>

一种改良的apoe基因敲除小鼠后肢缺血外科模型-/- 采用微型切口的小鼠手术

A Modified Surgical Model of Hind Limb Ischemia in ApoE-/- Mice using a Miniature Incision

本研究旨在介绍并评估一种改良的小鼠急性缺血诱导手术方法，该方法可在大多数动物实验室中实施。&#160;与传统的股动脉双结扎法（DLFA）不同，本方法仅在右侧腹股沟区域做一较小切口，以暴露近端股动脉（FA）并实施双结扎。随后，使用7-0缝线将切口向膝部方向牵拉，以暴露远端股动脉（FA）。术后采用双侧后肢磁共振成像（MRI）检测股动脉闭塞情况。术后0、1、3、5和7天，通过Tarlov评分对后肢功能恢复情况进行视觉评估和分级。在双结扎术后7天处死动物，进行组织学评估。该手术在10只ApoE-/-小鼠的右后肢成功实施，术后观察期间无小鼠死亡。所有10只小鼠的切口长度均小于5 mm（4.2 ± 0.63 mm）。MRI结果显示，缺血侧股动脉血流明显阻断。Tarlov评分结果表明，手术后小鼠后肢功能显著下降，并在随后的7天内缓慢恢复。组织学评估显示，缺血侧出现显著的炎症反应，且缺血后肢的微血管密度降低。综上所述，本研究介绍了一种采用微小切口实施股动脉双结扎以建立后肢缺血（HLI）模型的改良技术。

ApoE-/- 小鼠的特征 
成功对10只小鼠实施了DLFA手术以建立HLI模型，术后无小鼠死亡。为追踪体重变化，分别在DLFA手术前（术前）和手术后7天（术后）对小鼠进行称重。术前体重范围为29.6至38.0 g（平均值34.74 ± 2.47 g），术后体重范围为26.5至34.1 g（平均值30.77 ± 2.15 g），显著低于术前体重（P &lt; 0.05，图3A）。手术时间范围为15至47分钟（平均34.2 ± 8.82分钟，不包括麻醉时间）。10只小鼠的切口大小范围为3至5 mm（平均4.2 ± 0.63 mm）。
MRI 扫描与功能恢复 
MRI 扫描非常清晰地表明，右侧股动脉近端和远端区域无灌注（图 3C），说明该方法成功建立缺血模型。术后第 1 天，Tarl...

本文展示了一种通过小切口在小鼠体内建立急性缺血的高效手术方法。该方法无需对实验室进行任何升级改造，大多数研究团队均可应用。

一种改良的ApoE基因敲除小鼠后肢缺血外科模型-/- 采用微型切口的小鼠手术

本研究旨在介绍并评估一种改良的小鼠急性缺血诱导手术方法，该方法可在大多数……中实施

今天我们介绍了一种简化的、经过改良且手术效率更高的方法，用于在ApoE小鼠中建立后肢缺血模型。该方法可在任何动物实验设施中实施。该方法的主要优势在于侵入性低，仅需小于五毫米的切口即可完成操作。该方法存在学习曲线。因此，我们建议在用于最终分析的动物实验之前，先在显微外科模型上进行练习。本方法将由我实验室的医学博士研究生严凯旋（Kaixuan Yan）进行演示。首先准备手术所需的设备和工具。对小鼠实施麻醉后，在其眼睛上涂抹眼膏以防止角膜干燥。然后将小鼠置于加热垫上，以维持其核心体温在约 37 摄氏度。使用棉签和脱毛膏，仔细去除右侧后肢皮肤上的毛发。将小鼠仰卧位放置在解剖显微镜下的加热垫上。用酒精对皮肤进行消毒，并用棉签从切口的远端方向擦拭。使用尖头镊子和手术剪，在腹股沟区域中部做一长约三至四毫米的切口。借助精细的尖头镊子小心去除皮下脂肪组织，以暴露近端股骨的神经血管束。用生理盐水润湿的棉签，小心地将股动脉从股神经和股静脉处分离。然后使用7.0缝线的线尖小心刺破股鞘膜。接着将两条7-0可吸收缝线穿过近端股动脉，并使用弹簧剪打双重结。之后在两道结扎线之间横断股动脉。将6-0可吸收缝线穿过切口下缘，并轻柔地将切口牵拉至后肢膝关节右侧区域，以暴露股骨远端动脉。小心移开皮下组织，暴露神经血管束。分离股动脉与股静脉及股神经，并用棉片保护神经。然后使用7.0缝线的针尖刺破股鞘膜。将两根7-0可吸收缝线穿过远端股动脉，并使用弹簧剪刀打双重结，在两结之间横断股动脉。随后，使用6-0可吸收缝线缝合切口。将小鼠置于清洁笼盒中的加热垫上，并持续监测其生命体征直至恢复。通过磁共振成像（MRI）在术后次日评估股动脉双侧结扎（DLFA）是否成功。在进行DLFA手术前，小鼠的体重范围为29.6至38.0克。DLFA手术后7天，体重范围为26.5至34.1克，显著低于DLFA术前体重。右侧前肢动脉的近端和远端区域均无灌注。手术后1天，Tarlov评分显著降低。尽管在随后的几天中逐渐升高，但直到第7天仍低于基线水平。七只小鼠缺血后肢的足爪与对侧相比无法自然伸展。此外，其中四只小鼠的足爪与对侧相比出现轻微变色。右旋股肌的H&E染色显示，肌纤维呈现不规则的缺血性坏死，增殖的卫星细胞已取代坏死的肌纤维，并呈团块状或规则性分散分布。伴有多个核巨噬细胞炎性浸润的肌纤维已失去其正常的形态学特征，仅见极少量再生肌纤维。这些再生肌纤维的横切面呈圆形。细胞质被染成红色，一个小型细胞核或多个细胞核位于中央。然而，在左侧骨骼肌中未观察到此类炎症模式。通过CD31抗体染色观察微血管密度，结果显示缺血侧后肢的微血管密度显著高于非缺血侧。最重要的是股动脉的解剖分离。操作者需具备显微外科技术经验，并熟悉小鼠后肢解剖结构。原则上，该方法也可用于研究腿部的缺血-再灌注损伤。此时可在允许再灌注前，使用柔软的血管夹闭合动脉。

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