Name: 免疫荧光染色，用于 在果蝇 唾液腺中可视化异色素相关蛋白质 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-08-21T14:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 13 s
Description: 学习利用免疫荧光染色技术在果蝇多线唾液腺细胞中可视化异染色质聚集体的实验方法。该方案使用HP1蛋白标记评估野生型与突变体之间的染色质结构差异，为研究基因调控和染色质动态提供可靠手段。

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我们感谢Marco Antonio Rosales Vega和Abel Segura拍摄部分共聚焦图像，感谢Carmen Muñoz进行培养基制备，感谢LMNA的Arturo Pimentel博士、M.C. Andrés Saralegui以及Chris Wood博士在显微镜使用方面提供的建议。
资金支持： 
本工作由墨西哥国家科学技术理事会（CONACyT）（项目号 A1-S-8239，授予 VV-G）以及研究与技术创新项目支持计划（项目号 204915 和 200118，授予 VV-G）资助

1. 三龄幼虫培养
<ol>
	<li>通过加入100 g酵母、100 g未精制的全甘蔗糖、16 g琼脂、10 mL丙酸和14 g明胶来配制1升标准培养基。除酵母外，将所有成分溶解于800 mL自来水中，然后溶解酵母。立即高压灭菌30分钟。
	<ol>
		<li>随后，让培养基冷却至60 °C，并加入丙酸至终浓度为0.01%。将瓶子静置，直至明胶凝固。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>为优化三龄幼虫的培养，首先收集5至10日龄的成虫，并将50只（25只雄性和25只雌性）放入装有标准培养基的宽口瓶中。</li>
	<li>将装有果蝇的瓶子置于25 °C的恒温培养箱中，直至产卵数量达到50枚（对于野生型品系约需12小时）。</li>
	<li>培养时间结束后，移除成虫并将其转移至新瓶子中以重复该操作。让胚胎在18 °C下生长72小时 
	&#8203;注意：有关黑腹果蝇（Drosophila）品系保种条件的更多信息，请参见Tennessen &amp;#38; Thymmel13。</li>
</ol>
2. 幼虫采集
<ol>
	<li>收集幼虫时，应选择未出现气门外翻的游走期幼虫。气门外翻后，幼虫进入前蛹期，此时唾液腺仍具有优良的多线染色体，适合进行分析。唾液腺细胞在12小时后才开始启动程序性细胞死亡14,15。</li>
	<li>取15只三龄幼虫，放入培养皿中清洗。随后将其转移至冰冷的生理盐水或PBS溶液中（1× PBS：137 mM NaCl，2.7 mM KCl，10 mM Na2HPO4，2 mM KH2PO4，调节pH至7.4）。</li>
	<li>在含有蛋白酶抑制剂的冷PBS中，于体视显微镜下解剖15至30对唾液腺（或在30分钟内尽可能多地解剖）。将解剖得到的唾液腺转移至1.5 mL离心管中，并加入冰冷的PBS。</li>
	<li>用1 mL含蛋白酶抑制剂的PBS洗涤一次。等待组织沉降至管底。</li>
	<li>洗涤后，用1000 µL移液器吸除PBS，注意不要触碰组织。
	<ol>
		<li>或者，可在5 mL PBS中直接解剖唾液腺，从而省去此洗涤步骤，随后将唾液腺转移至0.5 mL下述Ruvkun固定液中，进入步骤3。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. 唾液腺组织固定
<ol>
	<li>上一步骤的 PBS 去除后，直接加入 0.5 mL 含 50% 甲醇（加入 0.5 mL 甲醇）和 2% 甲醛的 1× Ruvkun 固定缓冲液。 
	&#8203;注意：2× Ruvkun 溶液为 pH 7.4 条件下的 160 mM KCl、40 mM NaCl、20 mM EGTA、30 mM PIPES。</li>
	<li>在 4 °C 下轻轻旋转孵育 2 小时。</li>
</ol>
4. 唾液腺组织洗涤
<ol>
	<li>用1 mL Tris/Triton缓冲液（100 mM Tris pH 7.4，1% Triton X-100和1 mM EDTA）进行一次5分钟的旋转洗涤。 
	&#8203;注意：等待组织沉降至管底。</li>
</ol>
5. 透化处理
<ol>
	<li>将唾液腺在1 mL Tris/Triton X-100（同上）中孵育。对于某些蛋白质，可能需要添加1% β-巯基乙醇。</li>
	<li>在37 °C下轻轻振荡（300 rpm）孵育2小时。</li>
</ol>
6. 保存步骤（可选）
注意：如果未立即进行抗体孵育，请按以下方法保存组织。
<ol>
	<li>用 1 mL BO3 缓冲液（0.01 M H3BO3，pH 9.2 + 0.01 M NaOH）洗涤，然后在 37 °C 条件下用 BO3/10 mM DTT 溶液轻度振荡（300 rpm）孵育 15 分钟。</li>
	<li>孵育结束后，用 1 mL BO3 缓冲液单独洗涤一次。 
	注意：等待组织沉降至管底。</li>
	<li>加入 1 mL PBS。将组织保存在此溶液中，于 4 °C 最多可保存 72 小时，随后进行下一步操作。当处理不同突变株（其生命周期可能存在延迟）时，此步骤尤为有用，可使免疫检测与对照组同时进行。</li>
</ol>
7. 组织切块
<ol>
	<li>将唾液腺在1 mL缓冲液B（PBS + 0.1% BSA + 0.5% Triton X-100 + 1 mM EDTA）中室温旋转孵育2小时。</li>
</ol>
8. 免疫染色
<ol>
	<li>移除所有缓冲液B，加入缓冲液A（PBS + 0.1% BSA）以及目标抗体。 
	&#8203;注意：我们使用Hybridoma Bank提供的HP1a C1A9c（浓缩抗体），稀释比例最高可达1:3000。当使用C1A9s（上清液）时，我们尝试过1:100至1:500之间的各种稀释比例，均能获得良好效果。4 ᵒC条件下旋转孵育过夜。此步骤中需注意震荡不可产生气泡，以免损伤抗体。</li>
</ol>
9. 免疫染色洗涤
<ol>
	<li>在室温下，每次使用1 mL缓冲液B，搅拌条件下进行3次，每次15分钟的洗涤。</li>
	<li>将腺体转移至含有与荧光染料偶联的二抗的缓冲液B中，在4 ᵒC条件下旋转孵育2小时（使用的二抗为Invitrogen Alexa Fluor 568，稀释比例为1:3000）。
	<ol>
		<li>用铝箔纸包裹离心管，避免二抗暴露于光照下。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>在室温下，加入1 mL缓冲液B，旋转条件下进行2次、每次15分钟的洗涤。</li>
	<li>加入DNA标记物（如Sytox：取2 µL 5 mM的储存液溶于1 mL缓冲液B中；或Hoechst：取1 µL 10 mg/mL的储存液溶于1 mL缓冲液B中），在室温下旋转孵育10分钟。</li>
	<li>用缓冲液B和PBS各洗涤一次，每次洗涤在室温下旋转10分钟。 
	&#8203;注意：请始终避免光照。</li>
</ol>
10. 成像
<ol>
	<li>将唾液腺置于载玻片上，用盖玻片形成液滴。</li>
	<li>将唾液腺置于液滴中央，并加入AF1 Citifluor以防止产生气泡，同时将黏稠液体均匀铺展。然后用透明指甲油密封四周。</li>
	<li>在荧光显微镜或共聚焦显微镜下观察。若样品不在当天观察，需避光保存于4 °C环境中。</li>
	<li>使用GraphPad Prism 6软件生成所有图表并进行统计分析。</li>
	<li>采用Kruskal-Wallis检验分析唾液腺中HP1a分布的数据。统计学显著性水平设定为（p &#60; 0.05*，&#60; 0.01 **，&#60; 0.001***，&#60; 0.0001****）。</li>
</ol>

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</ol>

作者声明不存在任何竞争利益。

真核生物的细胞功能可以决定细胞核内的三维结构，这种结构依赖于不同蛋白质与染色质以及包括RNA在内的多种分子之间的相互作用。在过去三年中，具有重要生物学意义的生物凝聚物（如异染色质）在相分离过程中发挥了关键作用，促进了活性染色质与抑制性染色质在细胞核内独特的空间组织形式16,17,18。
异染色质对于维持细胞功能和细胞特性至关重要。过去人们认为这些致密区域不会发生转录。然而，随着技术手段的进步，我们现在发现异染色质不仅能够被转录，而且其转录过程对于维持细胞核骨架结构具有重要作用，并且对发育或病理过程具有敏感性12,19。此外，位于着丝粒周围异染色质中的一些基因需要异染色质环境才能正常发挥功能。HP1a基因的突变会降低最早被发现的light和rolled</e...

自从Emil Heitz的早期研究以来1，异染色质一直被认为是调控基因表达、染色体的减数分裂和有丝分裂分离以及维持基因组稳定性等细胞过程的重要调节因子2,3,4。
异染色质主要分为两种类型：组成型异染色质和兼性异染色质。组成型异染色质通常位于染色体的特定区域，如端粒和着丝粒，其特征是包含重复序列和可移动元件。这类异染色质主要通过特定的组蛋白修饰在表观遗传上加以定义，例如组蛋白H3第9位赖氨酸的二甲基化或三甲基化（H3K9me3），以及异染色质蛋白1a（HP1a）的结合5,6。另一方面，兼性异染色质分布于染色体臂上，主要由在发育过程中被沉默的基因组成7,8。通过对有丝分裂中期细胞中异染色质区段进行免疫染色，或观察间期细胞中异染色质的聚集现象，已极大地增进了人们对异染色质区域形成机制与功能的理解9。
利用Drosophila作为模式系统，使得研究人员能够在不使用电子显微镜的情况下开发出研究异染色质的关键工具10。自从位置效应花斑现象被描述以及异染色质相关蛋白（如HP1a）和组蛋白翻译后修饰被发现以来，许多研究团队已开发出多种免疫组织化学技术，可用于可视化这些异染色质区域10,11。
这些技术基于使用特异性抗体来识别与异染色质相关的蛋白质或组蛋白修饰。对于每种细胞类型和抗体，固定和透化条件必须通过实验经验确定。此外，如果使用压片等额外的机械处理步骤，条件可能需要相应调整。在本方案中，我们描述了利用Drosophila唾液腺来研究异染色质焦点的方法。唾液腺细胞含有多线染色体，其基因组拷贝数超过1,000份，因此可显著放大大多数染色质特征的信号，但卫星DNA和某些异染色质区域因复制不足而例外。尽管如此，异染色质区域在多线染色体制片中易于观察，但压片技术有时会破坏特征性的染色质结合复合物或染色质结构。因此，在完整的唾液腺组织中进行蛋白质免疫定位可避免这些不利影响。我们已使用该方案检测了多种染色质结合蛋白，并证明该方法结合突变型Drosophila品系可用于研究异染色质的破坏12。

<table><tbody><tr><td>1.5 mL 微量离心管</td><td>Axygen MCT-150-C</td><td>11351904</td><td>品牌不关键</td></tr><tr><td>16% 甲醛</td><td>Thermo Scientific</td><td>28908</td><td></td></tr><tr><td>AF1 Citifluor</td><td>Ted pella</td><td>19470</td><td>25 mL</td></tr><tr><td>BSA，分子生物学级</td><td>Roche</td><td>10735078001</td><td>品牌不关键</td></tr><tr><td>Complete，不含EDTA的超纯蛋白酶抑制剂&lt;br/&gt;蛋白酶抑制剂</td><td>Merck</td><td>5892953001</td><td></td></tr><tr><td>盖玻片</td><td>Corning</td><td>CLS285022-200EA</td><td>22×22，品牌不关键</td></tr><tr><td>DTT</td><td>Sigma</td><td>d9779</td><td>品牌不关键</td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma</td><td>E5134</td><td>品牌不关键</td></tr><tr><td>EGTA</td><td></td><td></td><td>品牌不关键</td></tr><tr><td>载玻片</td><td>Gold seal</td><td>3011</td><td>品牌不关键</td></tr><tr><td>H&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;BO&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;</td><td>Baker</td><td>0084-01</td><td>品牌不关键</td></tr><tr><td>H3K9me3</td><td>Abcam</td><td>8889</td><td></td></tr><tr><td>HP1a</td><td>Hybridoma Bank</td><td>C1A9</td><td>产品形态&amp;nbsp;浓缩液 0.1 mL</td></tr><tr><td>KCl</td><td>Baker</td><td>3040-01</td><td>品牌不关键</td></tr><tr><td>甲醇</td><td>Baker</td><td>9070-03</td><td>品牌不关键</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma</td><td>71376</td><td>品牌不关键</td></tr><tr><td>NaOH</td><td></td><td></td><td>品牌不关键</td></tr><tr><td>PIPES</td><td></td><td></td><td>品牌不关键</td></tr><tr><td>旋转仪</td><td>Thermo Scientific</td><td>13-687-12Q</td><td>&amp;nbsp;Labquake 试管摇床</td></tr><tr><td>Thermo Mixer C</td><td>Eppendorf</td><td>13527550</td><td>SmartBlock 1.5 mL</td></tr><tr><td>Tris</td><td>Milipore</td><td>648311</td><td>品牌不关键</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma</td><td>T8787</td><td>100 mL，品牌不关键</td></tr><tr><td>&amp;beta;-巯基乙醇</td><td>Bio-Rad</td><td>1610710</td><td>25 mL，品牌不关键</td></tr></tbody></table>

用于可视化异染色质相关蛋白的免疫荧光染色 果蝇 唾液腺

Immunofluorescent Staining for Visualization of Heterochromatin Associated Proteins in Drosophila Salivary Glands

通过免疫染色观察异染色质聚集物具有挑战性。许多哺乳动物的染色质组分在进化上是保守的 黑腹果蝇 因此，它是研究异染色质形成与维持的极佳模型. 多线化细胞，例如三龄幼虫唾液腺中发现的细胞 D. melanogaster 幼虫提供了一种极佳的工具，可观察到染色质被扩增近一千倍的现象，使研究人员能够研究细胞核内异染色质分布的变化。尽管异染色质组分的观察可直接在多线染色体标本中进行，但某些蛋白质的定位可能因处理条件剧烈而发生改变。因此，对细胞中异染色质进行直接可视化观察可补充此类研究。在本方案中，我们描述了用于该组织的免疫染色技术、荧光二抗的使用以及共聚焦显微镜观察，以更精确和详细地观察这些异染色质聚集体。

果蝇 唾液腺中HP1a免疫染色的代表性结果如图1所示。阳性结果表现为观察到一个焦点信号（图1a）（异染色质聚集体或凝聚物）。阴性结果则无信号或信号呈弥散分布。有时可观察到双信号，即出现两个焦点（图1c），但通常出现频率较低。
数据分析可用柱状图表示，以比较不同突变背景下HP1a的分布情况。例如，在图2中可以看出，98%的野生型细胞核呈现单个焦点分布，2%的细胞核具有两个焦点；而在突变体中，这一比例发生变化，具有两个焦点的细胞核比例上升至40%。
图3 显示代表性H3K9me3免疫染色结果于 果蝇 唾液腺。我们可以观察到一个焦点（图3b）与...

本方案旨在可视化Drosophila多线细胞中的异染色质聚集体。

通过免疫染色观察异染色质聚集物具有挑战性。许多哺乳动物的染色质组分在黑腹果蝇（Drosophila）中是保守的……

本实验方案的目的是在果蝇细胞中可视化异染色质聚集体。为此，我们使用存在于三龄幼虫唾液腺中的多线细胞。这些细胞的基因组被扩增了近一千倍，且染色体保留了间期细胞的特征。它们具有明确的端粒，以及称为染色中心的结构，所有着丝粒在此聚集形成桥状结构，且该结构主要由异染色质组成。利用三龄幼虫组织，还可以在不同遗传突变体背景下评估异染色质聚集体的变化。为了优化三龄幼虫的培养，首先需要收集 5 至 10 天龄的成虫，并将约 50 只（25 只雄性和 25 只雌性）放入装有标准培养基的宽口瓶中。将瓶子置于25摄氏度的恒温培养箱中培养12小时。培养结束后，移除成虫并将其转移至新瓶子中以重复该操作。让胚胎在18摄氏度下生长22小时。收集幼虫时，务必选择游走期幼虫，此类幼虫不具有明显的球形结构。在显微镜下，于含蛋白酶抑制剂的冰冷 PBS 中，解剖 15 对唾液腺，或在 30 分钟内尽可能多地完成解剖。将唾液腺转移至另一含有冰冻 PBS 的离心管中。用预冷的 PBS 缓冲液（含蛋白酶抑制剂）洗涤一次。注意，每次均需等待组织沉降至管底。上一步 PBS 去除后，直接加入 0.5 毫升 1× 组蛋白固定缓冲液以及 50% 甲醇和 2% 甲醛。在 4 °C 条件下轻轻旋转孵育两小时。用 Tris-Triton 缓冲液进行一次五分钟的旋转洗涤，加入一毫升。每次均需等待组织沉降至管底。注意：等待组织沉降至管底。将唾液腺与上述相同的 Tris-Triton 溶液加上 1% β-巯基乙醇在 37 摄氏度下温和振荡孵育 2 小时。用 BO3 缓冲液洗涤后，再在 37 摄氏度下用含 10 毫摩尔 DTT 的 BO3 缓冲液温和振荡孵育 15 分钟。孵育结束后，仅用一毫升 BO3 缓冲液进行一次洗涤。将唾液腺在室温下用一毫升缓冲液 B 旋转孵育两小时。移除全部缓冲液 B，加入缓冲液 A 及目标抗体。在此情况下，我们使用铱银行提供的 HP one、A C 1 8 9。4 摄氏度下旋转孵育过夜，比例为 1:3,000。此时需注意，摇动过程不应产生气泡，以免损伤抗体。每次使用一毫升缓冲液B，在室温下搅拌条件下进行15分钟洗涤，共洗涤15次。将腺体连同二次抗体一起转移至缓冲液B中，并置于4°C旋转孵育2小时。此步骤中，必须用铝箔纸包裹离心管，以避免二次抗体暴露于光照下。室温下加入1毫升缓冲液B，旋转孵育，进行两次，每次15分钟的洗涤。加入Sydox或OH等DNA标记物，在1毫升缓冲液B中室温旋转孵育10分钟。用缓冲液B洗涤一次，再用PBS洗涤一次，每次洗涤均持续10分钟，并在室温下旋转。最后将唾液腺置于载玻片上，加盖盖玻片形成液滴。将唾液腺置于液滴中央，用 Sidiflor 封片。为避免气泡变形，防止黏性液体扩散至各处。然后，用透明指甲油密封所有载玻片。在荧光显微镜或共聚焦显微镜下观察。如果样品不在当天观察，则需避光保存于四摄氏度。图一展示了果蝇唾液腺中HB1单染色的代表性结果。阳性结果为观察到一个类似A中的焦点，即异色聚集物或凝聚相。阴性结果为无信号或信号弥散。有时可观察到类似C中的双信号，即两个点，但通常数量较少。为了分析数据，可以将其表示为柱状图，以比较不同突变背景下 HP1 的分布情况。例如，在图二中，我们可以看到在野生型中，98% 的细胞核呈现单个点的分布，而 2% 则呈现两个焦点的分布。在突变体中，比例发生变化，出现两个焦点的比例增加至40%。图三显示了单染色条件下三甲基化赖氨酸9H3的代表性结果。在果蝇唾液腺中观察到一个焦点（B），这是在染色质聚集体或凝聚物中的理想结果；双信号或三信号（C）偶尔可见，但数量较少。在本实验方案结束时，尽管存在状态限制，您将能够观察到HP1蛋白的双色凝聚物，这将是一个良好的初步尝试。

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学习利用免疫荧光染色技术在果蝇多线唾液腺细胞中可视化异染色质聚集体的实验方法。该方案使用HP1蛋白标记评估野生型与突变体之间的染色质结构差异，为研究基因调控和染色质动态提供可靠手段。

用于可视化异染色质相关蛋白的免疫荧光染色果蝇唾液腺

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