免疫荧光染色，用于 在果蝇 唾液腺中可视化异色素相关蛋白质

此协议的目的是可视化德罗索菲拉细胞中的异色素聚合物。为了达到这个目的，我们使用在第三星幼虫唾液腺中发现的多特尼细胞这些细胞的基因组被放大了近一千倍，染色体保存了界面细胞的特征。它们有定义明确的端粒，以及称为染色体的桥梁，其中所有的中心聚集，它主要是异色。

使用第三个星内幼虫组织，也使我们能够评估不同遗传突变体背景中异色聚合的变化。为了优化第三个星内幼虫培养，您需要首先收集 5 到 10 天的老年人，并将大约 50 天放在标准媒体的宽颈瓶中。25男25女。

将瓶子放在25摄氏度的受控温度孵化器中12小时。孵化期结束后，将成人取出并转移到新瓶中重复该程序。让胚胎在18摄氏度下生长22小时。

对于幼虫收集，请确保您选择没有球形的流浪幼虫。解剖15对唾液腺，或在30分钟内在寒冷的PBS与显微镜下的抗议抑制剂尽可能多地。将唾液腺转移到另一个带冰冷 PBS 的管子。

用冷 PBS 加抗议抑制剂洗一次。记住，总是等待组织到达管子的底部。从最后一步中取出 PBS 后，直接添加 0.5 毫升的 X 组牙龈固定缓冲和 50% 甲醇加 2% 甲醛。

在摄氏四度下孵育两小时，轻度旋转。用特里斯-特里顿缓冲器进行一次五分钟的旋转洗涤，增加一毫升。始终等待组织到达管子底部。

注意:等待组织到达管子底部。用特里斯-特里顿（Tris-Triton）孵育唾液腺，与上述相同，外加1%的β麦加普托乙醇，在37摄氏度下两小时，轻微摇晃。用BO3缓冲器清洗，在37摄氏度下用BO3加10毫摩尔DTT孵育，轻度摇晃15分钟。

在潜伏期结束时，单独用一毫升 BO3 缓冲器进行洗涤。在室温下旋转两小时，将唾液腺在一毫升缓冲B中孵育两小时。删除所有缓冲 B 并添加缓冲 A 加感兴趣的抗体。

在这种情况下，我们使用惠普一，A C 1 8 9 从Iridium银行。晚上三千分之一， 旋转四度。在这一点上，重要的是震动不会引发气泡，这可能会损害抗体。

用缓冲B在室温下搅拌1毫米，用缓冲B洗涤15分钟。腺体与二级抗生素夫妇一起转移到缓冲B，在四度旋转下转诊两小时。在此步骤中，用铝纸箔覆盖管子以保护辅助抗体免受光线的照射非常重要。

在室温下进行2x15分钟的垫圈，同时用一毫升缓冲器B.孵化，用DNA标记，如Sydox或OH，并在室温下溶解在一毫升缓冲B中10分钟，旋转。用缓冲 B 洗一次，用 PBS 洗一次，每次洗涤持续 10 分钟，同时在室温下旋转。最后，将唾液腺安装在滑梯上，使池面滑动。

将唾液腺放在池中，并盖上西迪弗洛尔。为了避免气泡变形，将粘性液体扩展到所有地方。然后，用清晰的指甲油密封所有的滑梯。

在荧光或聚焦显微镜下观察。如果当天不观察样品，则从灯光下储存四度。第一图显示了嗜血杆菌唾液腺中HB1单染的代表性结果。

一个积极的结果是观察一个焦点，如在A，气动色聚合或冷凝水。负结果为无信号或分散信号。有时，双信号可以像 C 中的双点一样观察到，但通常以较小的数量发生。

要分析数据，可以将其表示为条形图，比较具有不同突变背景的 HP1 的分布。例如，在第二图中，我们可以看到 98% 的核呈现一点分布。和 2% 的两个 foci 在野生类型。

在突变体中，比例发生变化，两个 foci 的存在增加到 40%图三显示具有代表性的三甲基化赖氨酸 9H3 在单染色。导致果蝇唾液腺观察B中的一个焦点，这是一个有利的结果，在色聚合或凝结，在C的双重或三重信号可以看到在极少数情况下，但在少量。在本协议的末尾，您将能够看到HP1蛋白质的二位星凝结物，尽管状态的限制，这将是一个很好的第一种方法。