一种基于质谱的蛋白质组学方法用于全局且高置信度的蛋白质精氨酸甲基化分析

该方案具有重要意义，因为它代表了通过质谱技术对蛋白质精氨酸甲基化进行全局分析的最新工作流程。这是唯一能够以单一修饰位点分辨率鉴定和分析精氨酸甲基化蛋白质的方法，而其他生物化学技术无法实现这一目标。当结合使用蛋白质精氨酸甲基转移酶（PRMT）抑制剂时（其中多个抑制剂正处于临床试验阶段并作为抗癌药物），该方案可深入解析这些药物的作用机制。

首先，使用超纯水配制的二硫苏糖醇（DTT）储存液对蛋白质的巯基进行还原，终浓度为4.5毫摩尔，在55摄氏度反应30分钟。随后，加入碘乙酰胺至终浓度为10毫摩尔，于室温避光孵育15分钟，对蛋白质的巯基进行烷基化。为验证蛋白质消化效率，保留一份蛋白质提取物的等分试样，用于后续SDS-PAGE考马斯亮蓝染色凝胶分析，并与消化后的相应量样品进行比较。

将剩余的蛋白质提取物用四倍体积的20毫摩尔HEPES（pH 8.0）稀释，使终浓度为2摩尔尿素。将样品分为两部分，分别向其中一份加入测序级修饰胰蛋白酶，另一份加入LysargiNase蛋白酶。将样品置于37摄氏度的ThermoMixer中，以每分钟600转的速度孵育过夜，以完成酶解消化。

针对每个色谱梯度，将所有组分收集至深孔96孔板中。将梯度开始前收集的组分合并为一个单一组分，命名为pre。通过非连续合并的方式，将高pH反相液相色谱梯度中收集的60个组分合并为14个最终组分。

为了获得非连续连接，按照文稿中的描述合并高pH反相洗脱组分。将梯度洗脱后收集的组分合并为一个单独的组分，命名为post。分别对胰蛋白酶和LysargiNase消化得到的两个样品进行连续的免疫亲和富集，以富集修饰肽段。

将10倍浓缩的免疫亲和纯化（IAP）缓冲液稀释10倍。将冻干的多肽在2,000 G离心5分钟，使多肽沉降至管底。每管15毫升样品用250微升稀释后的IAP缓冲液重悬多肽，并转移至1.5毫升低吸附管中。

使用石蕊试纸检测，确保 pH 值大于六。保留每份组分的一小部分作为后续质谱分析的输入样品。将每份组分均分为两部分，以平行进行不对称二甲基化（ADMA）和对称二甲基化（SDMA）肽段的免疫富集。

每10毫克初始蛋白提取物准备三管与蛋白A琼脂糖珠偶联的特异性抗泛R-甲基化抗体。通过在2,000 G离心30秒并移除珠子中的缓冲液，确定与琼脂糖珠偶联的抗体的正确用量。用1毫升1×PBS将珠子洗涤三次，每次在2,000 G离心30秒。

最后一次洗涤后，将每管珠子重悬于40 µL 1× PBS中，合并所有珠子，然后均分为16份。每管加入250 µL 1× IAP缓冲液，通过倒置混匀。随后将各管置于4 °C旋转摇床上孵育2小时。

孵育结束后，将含有肽段和与泛R-甲基化抗体偶联的磁珠的1.5毫升离心管在2,000 G条件下离心30秒，使磁珠沉淀，然后将每份上清液转移至新的1.5毫升低吸附离心管中。将磁珠加入与R-单甲基化抗体偶联的上清液中，重复用PBS重悬、IAP缓冲液孵育及离心步骤。在肽段样品与单甲基化或MMA磁珠孵育期间，用250微升IAP缓冲液对先前使用抗ADMA和SDMA抗体进行免疫沉淀的各组分洗涤两次，每次洗涤后弃去上清液。

然后用LC-MS级水洗涤三次。通过向每根试管中加入50微升0.15% TFA，从琼脂糖珠上洗脱亲和富集的SDMA或ADMA肽。室温下孵育10分钟，每隔两到三分钟颠倒试管一次。

将第一次洗脱液转移至洁净的1.5毫升低吸附离心管中，并用50微升0.15 TFA重复洗脱一次。将两次洗脱液合并至同一管中。对与抗MMA抗体磁珠孵育的R-单甲基化肽段重复此过程。

混合轻标记和重标记细胞后，提取蛋白质并用胰蛋白酶和LysargiNase进行消化。通过SDS-PAGE考马斯亮蓝染色凝胶验证总蛋白质是否被高效酶解为肽段。评估了C18 Sep-Pak柱纯化步骤的效率，确认在C18柱的穿流液、第一次和第二次洗涤液中均无肽段存在，而洗脱液中则检测到预期的肽段。

评估了重通道中MET4的正确掺入以及重链与轻链的正确混合。此处展示了肽段经离线高pH反相液相色谱分离后的色谱图及后续非连续级分合并的结果。肽段通过250纳米紫外检测，而可能残留的未消化蛋白质则通过280纳米紫外进行评估。获得了代表真实阳性甲基化肽段注释的肽段全扫描质谱图。

三个峰之间的质荷比（M/Z）差异与酶促甲基化残基的存在一致。获得了代表假阳性甲基化肽注释的肽段的完整质谱图。轻甲基化肽与其对应的重同位素标记肽之间的质荷比（M/Z）差异偏离预期值0.0312。

该实验方案的整体流程为线性，但有几个步骤需要特别注意。例如，非连续组分合并的 IPH 色谱分离以及 IP 实验设置。该方案可与标准 SILAC 或无标记定量方法联用，用于分析在多种扰动条件下精氨酸甲基化动态变化。

该方案为在多种细胞类型和模型系统中表征蛋白质甲基化的程度与动态变化奠定了基础，支持针对PRMTs的基础研究和转化研究的各个方面。