Name: 基于质谱的蛋白质组学方法用于全局和高置信度的蛋白质R-甲基化分析 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-04-28T12:20:00.000+00:00
Duration: 9 min 40 s
Description: 了解基于质谱的蛋白质组学方法用于全局和高置信度的蛋白质精氨酸甲基化分析。该方案整合代谢标记、双蛋白酶消化、高pH反相色谱和免疫亲和富集技术，支持PRMT抑制剂机制研究及动态甲基化组学分析。

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MM 和 EM 是欧洲分子医学学院（SEMM）的博士研究生。EM 获得了为期三年的 FIRC-AIRC 奖学金（项目编号：22506）。结核病研究组中 R-甲基化蛋白质组的全局分析得到了 AIRC IG 基金（项目编号：21834）的支持。

<ol><li>Bulau, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+assessment+of+arginine+methylation+in+free+versus+protein-incorporated+amino+acids+in+vitro+and+in+vivo+using+protein+hydrolysis+and+high-performance+liquid+chromatography%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">Quantitative assessment of arginine methylation in free versus protein-incorporated amino acids in vitro and in vivo using protein hydrolysis and high-performance liquid chromatography.</a> Biotechniques. 40 (3), 305-310 (2006).</li>
<li>Blanc, R. S., Richard, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Arginine+methylation%3A+the+coming+of+age%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">Arginine methylation: the coming of age.</a> Molecular Cell. 65 (1), 8-24 (2017).</li>
<li>Sylvestersen, K. B., Horn, H., Jungmichel, S., Jensen, L. J., Nielsen, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteomic+analysis+of+arginine+methylation+sites+in+human+cells+reveals+dynamic+regulation+during+transcriptional+arrest%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+%26+Cellular+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Proteomic analysis of arginine methylation sites in human cells reveals dynamic regulation during transcriptional arrest.</a> Molecular & Cellular Proteomics. 13 (8), 2072-2088 (2014).</li>
<li>Yang, Y., Bedford, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+arginine+methyltransferases+and+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Cancer%22%5BJournal%5D)">Protein arginine methyltransferases and cancer.</a> Nature Reviews Cancer. 13 (1), 37-50 (2013).</li>
<li>Bezzi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+constitutive+and+alternative+splicing+by+PRMT5+reveals+a+role+for+Mdm4+pre-mRNA+in+sensing+defects+in+the+spliceosomal+machinery%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+%26+Development%22%5BJournal%5D)">Regulation of constitutive and alternative splicing by PRMT5 reveals a role for Mdm4 pre-mRNA in sensing defects in the spliceosomal machinery.</a> Genes & Development. 27 (17), 1903-1916 (2013).</li>
<li>Auclair, Y., Richard, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+arginine+methylation+in+the+DNA+damage+response%5BTitle%5D)+AND+%22DNA+Repair%22%5BJournal%5D)">The role of arginine methylation in the DNA damage response.</a> DNA Repair. 12 (7), 459-465 (2013).</li>
<li>Spadotto, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PRMT1-mediated+methylation+of+the+microprocessor-associated+proteins+regulates+microRNA+biogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">PRMT1-mediated methylation of the microprocessor-associated proteins regulates microRNA biogenesis.</a> Nucleic Acids Research. 48 (1), 96-115 (2020).</li>
<li>Musiani, D., Massignani, E., Cuomo, A., Yadav, A., Bonaldi, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biochemical+and+computational+approaches+for+the+large-scale+analysis+of+protein+arginine+methylation+by+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protein+and+Peptide+Science%22%5BJournal%5D)">Biochemical and computational approaches for the large-scale analysis of protein arginine methylation by mass spectrometry.</a> Current Protein and Peptide Science. 21 (7), 725-739 (2020).</li>
<li>Ong, S. -E., Mittler, G., Mann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identifying+and+quantifying+in+vivo+methylation+sites+by+heavy+methyl+SILAC%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Identifying and quantifying in vivo methylation sites by heavy methyl SILAC.</a> Nature Methods. 1 (2), 119-126 (2004).</li>
<li>Hart-Smith, G., Yagoub, D., Tay, A. P., Pickford, R., Wilkins, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Large+scale+mass+spectrometry-based+identifications+of+enzyme-mediated+protein+methylation+are+subject+to+high+false+discovery+rates%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+%26+Cellular+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Large scale mass spectrometry-based identifications of enzyme-mediated protein methylation are subject to high false discovery rates.</a> Molecular & Cellular Proteomics. 15 (3), 989-1006 (2016).</li>
<li>Bedford, M. T., Clarke, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+arginine+methylation+in+mammals%3A+who%2C+what%2C+and+why%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">Protein arginine methylation in mammals: who, what, and why.</a> Molecular Cell. 33 (1), 1-13 (2009).</li>
<li>Larsen, S. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteome-wide+analysis+of+arginine+monomethylation+reveals+widespread+occurrence+in+human+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Signaling%22%5BJournal%5D)">Proteome-wide analysis of arginine monomethylation reveals widespread occurrence in human cells.</a> Science Signaling. 9 (443), (2016).</li>
<li>Massignani, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((hmSEEKER%3A+Identification+of+hmSILAC+doublets+in+MaxQuant+output+data%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics%22%5BJournal%5D)">hmSEEKER: Identification of hmSILAC doublets in MaxQuant output data.</a> Proteomics. 19 (5), 1800300(2019).</li>
<li>Bradford, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+rapid+and+sensitive+method+for+the+quantitation+of+microgram+quantities+of+protein+utilizing+the+principle+of+protein-dye+binding%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding.</a> Analytical Biochemistry. 72, 248-254 (1976).</li>
<li>Smith, P. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measurement+of+protein+using+bicinchoninic+acid%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Measurement of protein using bicinchoninic acid.</a> Analytical Biochemistry. 150 (1), 76-85 (1985).</li>
<li>Getz, E. B., Xiao, M., Chakrabarty, T., Cooke, R., Selvin, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+comparison+between+the+sulfhydryl+reductants+tris%282-carboxyethyl%29phosphine+and+dithiothreitol+for+use+in+protein+biochemistry%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">A comparison between the sulfhydryl reductants tris(2-carboxyethyl)phosphine and dithiothreitol for use in protein biochemistry.</a> Analytical Biochemistry. 273 (1), 73-80 (1999).</li>
<li>Nielsen, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Iodoacetamide-induced+artifact+mimics+ubiquitination+in+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Iodoacetamide-induced artifact mimics ubiquitination in mass spectrometry.</a> Nature Methods. 5 (6), 459-460 (2008).</li>
<li>Huesgen, P. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((LysargiNase+mirrors+trypsin+for+protein+C-terminal+and+methylation-site+identification%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">LysargiNase mirrors trypsin for protein C-terminal and methylation-site identification.</a> Nature Methods. 12 (1), 55-58 (2015).</li>
<li>Rappsilber, J., Mann, M., Ishihama, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protocol+for+micro-purification%2C+enrichment%2C+pre-fractionation+and+storage+of+peptides+for+proteomics+using+StageTips%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Protocol for micro-purification, enrichment, pre-fractionation and storage of peptides for proteomics using StageTips.</a> Nature Protocols. 2 (8), 1896(2007).</li>
<li>Hartel, N. G., Chew, B., Qin, J., Xu, J., Graham, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deep+protein+methylation+profiling+by+combined+chemical+and+immunoaffinity+approaches+reveals+novel+PRMT1+targets%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+%26+Cellular+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Deep protein methylation profiling by combined chemical and immunoaffinity approaches reveals novel PRMT1 targets.</a> Molecular & Cellular Proteomics. 18 (11), 2149-2164 (2019).</li>
<li>Bremang, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mass+spectrometry-based+identification+and+characterisation+of+lysine+and+arginine+methylation+in+the+human+proteome%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+bioSystems%22%5BJournal%5D)">Mass spectrometry-based identification and characterisation of lysine and arginine methylation in the human proteome.</a> Molecular bioSystems. 9 (9), 2231-2247 (2013).</li>
<li>Geoghegan, V., Guo, A., Trudgian, D., Thomas, B., Acuto, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comprehensive+identification+of+arginine+methylation+in+primary+T+cells+reveals+regulatory+roles+in+cell+signalling%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Comprehensive identification of arginine methylation in primary T cells reveals regulatory roles in cell signalling.</a> Nature Communications. 6 (1), 1-8 (2015).</li>
<li>Tabb, D. L., Huang, Y., Wysocki, V. H., Yates, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Influence+of+basic+residue+content+on+fragment+ion+peak+intensities+in+low-energy+collision-induced+dissociation+spectra+of+peptides%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Influence of basic residue content on fragment ion peak intensities in low-energy collision-induced dissociation spectra of peptides.</a> Analytical Chemistry. 76 (5), 1243-1248 (2004).</li>
<li>Guthals, A., Bandeira, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Peptide+identification+by+tandem+mass+spectrometry+with+alternate+fragmentation+modes%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+%26+Cellular+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Peptide identification by tandem mass spectrometry with alternate fragmentation modes.</a> Molecular & Cellular Proteomics. 11 (9), 550-557 (2012).</li>
<li>Swaney, D. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Supplemental+activation+method+for+high-efficiency+electron-transfer+dissociation+of+doubly+protonated+peptide+precursors%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Supplemental activation method for high-efficiency electron-transfer dissociation of doubly protonated peptide precursors.</a> Analytical Chemistry. 79 (2), 477-485 (2007).</li>
<li>Kundinger, S. R., Bishof, I., Dammer, E. B., Duong, D. M., Seyfried, N. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Middle-down+proteomics+reveals+dense+sites+of+methylation+and+phosphorylation+in+arginine-rich+RNA-binding+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Proteome+Research%22%5BJournal%5D)">Middle-down proteomics reveals dense sites of methylation and phosphorylation in arginine-rich RNA-binding proteins.</a> Journal of Proteome Research. 19 (4), 1574-1591 (2020).</li>
<li>Batth, T. S., Francavilla, C., Olsen, J. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Off-line+high-pH+reversed-phase+fractionation+for+in-depth+phosphoproteomics%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Proteome+Research%22%5BJournal%5D)">Off-line high-pH reversed-phase fractionation for in-depth phosphoproteomics.</a> Journal of Proteome Research. 13 (12), 6176-6186 (2014).</li>
<li>Yang, F., Shen, Y., Camp, D. G., Smith, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-pH+reversed-phase+chromatography+with+fraction+concatenation+for+2D+proteomic+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Review+of+Proteomics%22%5BJournal%5D)">High-pH reversed-phase chromatography with fraction concatenation for 2D proteomic analysis.</a> Expert Review of Proteomics. 9 (2), 129-134 (2012).</li>
<li>Hartel, N. G., Chew, B., Qin, J., Xu, J., Graham, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deep+protein+methylation+profiling+by+combined+chemical+and+immunoaffinity+approaches+reveals+novel+PRMT1+targets%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+%26+Cellular+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Deep protein methylation profiling by combined chemical and immunoaffinity approaches reveals novel PRMT1 targets.</a> Molecular & Cellular Proteomics. 18 (11), 2149-2164 (2019).</li>
<li>Uhlmann, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+method+for+large-scale+identification+of+protein+arginine+methylation%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+%26+Cellular+Proteomics%22%5BJournal%5D)">A method for large-scale identification of protein arginine methylation.</a> Molecular & Cellular Proteomics. 11 (11), 1489-1499 (2012).</li>
<li>Wang, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antibody-free+approach+for+the+global+analysis+of+protein+methylation%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+chemistry%22%5BJournal%5D)">Antibody-free approach for the global analysis of protein methylation.</a> Analytical chemistry. 88 (23), 11319-11327 (2016).</li>
<li>Moore, K. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+general+molecular+affinity+strategy+for+global+detection+and+proteomic+analysis+of+lysine+methylation%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+cell%22%5BJournal%5D)">A general molecular affinity strategy for global detection and proteomic analysis of lysine methylation.</a> Molecular cell. 50 (3), 444-456 (2013).</li>
<li>Wu, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+chemical+proteomics+approach+for+global+analysis+of+lysine+monomethylome+profiling%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+%26+Cellular+Proteomics%22%5BJournal%5D)">A chemical proteomics approach for global analysis of lysine monomethylome profiling.</a> Molecular & Cellular Proteomics. 14 (2), 329-339 (2015).</li>
<li>Sylvestersen, K. B., Horn, H., Jungmichel, S., Jensen, L. J., Nielsen, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteomic+analysis+of+arginine+methylation+sites+in+human+cells+reveals+dynamic+regulation+during+transcriptional+arrest%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+%26+Cellular+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Proteomic analysis of arginine methylation sites in human cells reveals dynamic regulation during transcriptional arrest.</a> Molecular & Cellular Proteomics. 13 (8), 2072-2088 (2014).</li>
<li>Tay, A. P., Geoghegan, V., Yagoub, D., Wilkins, M. R., Hart-Smith, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MethylQuant%3A+A+Tool+for+Sensitive+Validation+of+Enzyme-Mediated+Protein+Methylation+Sites+from+Heavy-Methyl+SILAC+Data%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Proteome+Research%22%5BJournal%5D)">MethylQuant: A Tool for Sensitive Validation of Enzyme-Mediated Protein Methylation Sites from Heavy-Methyl SILAC Data.</a> Journal of Proteome Research. 17 (1), 359-373 (2018).</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

高置信度鉴定 体内 基于质谱的蛋白质组学中，蛋白质/肽段甲基化的全局分析具有挑战性，因为在样品制备过程中可能发生多种氨基酸替代以及甲基酯化反应，这些修饰与甲基化具有相同的质荷比，若缺乏正交质谱验证策略，易导致错误指认和较高的假发现率（FDR）。该翻译后修饰的亚化学计量特性进一步增加了全局甲基化蛋白质组学的难度，但可通过修饰肽段的选择性富集加以克服。10.
本文介绍了一种生化与分析工作流程，该流程旨在通过结合重甲基稳定同位素标记（hmSILAC）策略、高pH反相色谱（HpH-RP）肽段分级分离以及抗广谱R-甲基化肽抗体试剂盒的亲和富集，提高全局质谱分析R-甲基化肽的效率与可靠性。前一种策略可实现对甲基化肽的正交验证，并显著降低鉴定的假发现率（FDR）；而后一方案则可增强甲基化肽在未修饰肽背景中的可检测性22。然而，该方案的一个局限性在于需要大量起始蛋白提取物（输入量在20–40 mg范围内），以进行后续的肽段分级分离和亲和富集，这限制了该方法仅适用于可大规模扩增的永生化、...

精氨酸（R）甲基化是一种翻译后修饰（PTM），存在于约1%的哺乳动物蛋白质组中1。蛋白质精氨酸甲基转移酶（PRMTs）是一类催化R-甲基化反应的酶，通过将一个或两个甲基基团以对称或不对称的方式添加到精氨酸侧链胍基上的氮（N）原子上。在哺乳动物中，根据其催化单甲基化（MMA）和不对称二甲基化（ADMA）、MMA和对称二甲基化（SDMA），或仅催化MMA的能力，PRMTs可分为三类：I型、II型和III型2,3。PRMTs主要靶向富含甘氨酸和精氨酸的区域（称为GAR基序）中的R残基，但某些PRMTs（如PRMT5和CARM1）也可甲基化富含脯氨酸-甘氨酸-甲硫氨酸（PGM基序）的区域4。R-甲基化已被证实可调控多种生物学过程，例如RNA剪接5、DNA修复6、miRNA生成7以及翻译2，从而推动了对该PTM的深入研究。
质谱（MS）被公认为是在蛋白质、肽段和位点水平上系统研究全基因组R-甲基化的最有效技术。然而，该翻译后修饰在通过质谱进行高置信度鉴定时需要采取一些特殊预防措施。首先，R-甲基化具有亚化学计量特征，即未修饰肽段的丰度远高于修饰肽段，因此在数据依赖采集（DDA）模式下运行的质谱仪更倾向于碎裂高丰度的未修饰肽段，而对低丰度的甲基化肽段碎裂频率较低8此外，大多数基于质谱的R-甲基化位点鉴定工作流程在生物信息学分析层面存在局限性。事实上，由于该翻译后修饰与多种氨基酸替换（如甘氨酸变为丙氨酸）以及天冬氨酸和谷氨酸的甲基酯化等化学修饰具有相同的质荷比，甲基化肽段的计算识别容易产生较高的假发现率（FDR）。9因此，基于甲基同位素标记的方法，例如细胞培养中重甲基稳定同位素标记氨基酸法（hmSILAC），已被用作可靠进行质谱鉴定的正交策略 体内 甲基化，显著降低假阳性注释的比率10.
近年来，多种用于研究精氨酸甲基化蛋白的全蛋白质组学实验方案已得到优化。基于抗体的免疫亲和富集技术的发展，已实现了对人类细胞中数百个精氨酸甲基化位点的注释11,12。此外，许多研究3,13报道，将基于抗体的富集方法与肽段分离技术（如高pH反相色谱分级）相结合，可显著提高所鉴定甲基化肽段的总数。
本文介绍了一种用于系统性、高置信度鉴定人源细胞中R-甲基化位点的实验策略，该策略基于一系列生物化学与分析步骤：从hmSILAC标记的细胞中提取蛋白质，使用胰蛋白酶（Trypsin）和LysargiNase蛋白酶进行平行双酶消化，随后对消化后的肽段进行HpH反相色谱（HpH-RP）分级分离，并结合抗体介导的免疫亲和富集，以富集含有单甲基精氨酸（MMA）、对称二甲基精氨酸（SDMA）和非对称二甲基精氨酸（ADMA）的肽段。所有经亲和富集的肽段随后通过高分辨率液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）在数据依赖采集（DDA）模式下进行分析，原始质谱数据由MaxQuant算法处理，用于鉴定R-甲基化肽段。最后，将MaxQuant的输出结果输入hmSEEKER——一种自主开发的生物信息学工具，用于搜索重链与轻链甲基化肽段的配对信号。简而言之，hmSEEKER首先读取并筛选msms文件中的甲基化肽段鉴定结果，然后将每个甲基化肽段与allPeptides文件中对应的MS1峰进行匹配，最终搜索其重链/轻链对应肽段的峰信号。对于每一对潜在的重-轻链肽段，计算其Log2 H/L比值（LogRatio）、保留时间差异（dRT）以及质荷比误差（ME）参数，位于用户自定义阈值范围内的双峰信号被标记为真实阳性结果。该生物化学实验流程如图1所示。

<table><tbody><tr><td>碳酸氢铵 (AMBIC)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>09830</td><td></td></tr><tr><td>过硫酸铵（APS）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>497363</td><td></td></tr><tr><td>C18 Sep-Pak 柱，真空 6 cc（1 g）</td><td>沃特斯</td><td>WAT036905</td><td></td></tr><tr><td>胶体考马斯亮蓝染色即用型</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>ISB1L-1L</td><td></td></tr><tr><td>cOmplete Mini，无EDTA</td><td>罗氏-西格玛奥德里奇</td><td>11836170001</td><td>蛋白酶抑制剂</td></tr><tr><td>透析胎牛血清（FBS）</td><td>GIBCO ThermoFisher</td><td>26400-044</td><td></td></tr><tr><td>DL-二硫苏糖醇（DTT）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>3483-12-3</td><td></td></tr><tr><td>DMEM培养基</td><td>GIBCO ThermoFisher</td><td>请求的</td><td>&amp;nbsp;含稳定型谷氨酰胺且不含甲硫氨酸</td></tr><tr><td>EASY-nano LC 1200 色谱系统</td><td>ThermoFisher</td><td></td><td></td></tr><tr><td>EASY-Spray 高效液相色谱柱</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>ES907</td><td></td></tr><tr><td>甘油</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G5516</td><td></td></tr><tr><td>HeLa 细胞</td><td>ATCC</td><td>ATCC CCL-2</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3375</td><td></td></tr><tr><td>碘乙酰胺（IAA）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>144-48-9</td><td></td></tr><tr><td>Jupiter C12-RP 色谱柱</td><td>Phenomenex</td><td>00G-4396-E0</td><td></td></tr><tr><td>L-甲硫氨酸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M5308</td><td>轻（L）甲硫氨酸</td></tr><tr><td>L-甲硫氨酸-(甲基-13C,d3)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>299154</td><td>重（H）甲硫氨酸</td></tr><tr><td>LysargiNase</td><td>默克密理博</td><td>EMS0008</td><td></td></tr><tr><td>Microtip 细胞破碎仪 Sonifier 250</td><td>布拉松</td><td></td><td></td></tr><tr><td>N,&lt;em&gt;N,N&amp;prime;，N&amp;prime;&lt;/em&gt;四甲基乙二胺（TEMED）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T9281</td><td></td></tr><tr><td>青霉素-链霉素</td><td>GIBCO ThermoFisher</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>PhosSTOP</td><td>罗氏-西格玛奥德里奇</td><td>4906837001</td><td>磷酸酶抑制剂</td></tr><tr><td>Pierce C18 Tips</td><td>ThermoFisher</td><td>87782</td><td></td></tr><tr><td>皮尔斯&amp;nbsp; 乙腈中0.1%甲酸（v/v），LC-MS级</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>85175</td><td>LC-MS 溶剂 B</td></tr><tr><td>皮尔斯&amp;nbsp; 水（LC-MS级）中的0.1%甲酸（v/v）</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>85170</td><td>LC-MS 溶剂 A</td></tr><tr><td>皮尔斯&amp;nbsp; 乙腈（ACN），液相色谱-质谱级</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>51101</td><td></td></tr><tr><td>皮尔斯&amp;nbsp; 水，液相色谱-质谱级</td><td>ThermoFisher</td><td>51140</td><td></td></tr><tr><td>聚丙烯酰胺</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>92560</td><td></td></tr><tr><td>Precision Plus Protein&amp;nbsp; 所有蓝色预染蛋白质标准品</td><td>伯乐（Bio-Rad）</td><td>1610373</td><td></td></tr><tr><td>PTMScan 抗体 &amp;alpha;-ADMA</td><td>细胞信号技术公司</td><td>13474</td><td></td></tr><tr><td>PTMScan 抗体 &amp;alpha;-甲基丙烯酸甲酯</td><td>细胞信号技术公司</td><td>12235</td><td></td></tr><tr><td>PTMScan 抗体 &amp;alpha;-SDMA</td><td>细胞信号技术公司</td><td>13563</td><td></td></tr><tr><td>Q Exactive HF 混合四极杆-轨道阱质谱仪</td><td>赛默飞世尔科技</td><td></td><td></td></tr><tr><td>测序级修饰胰蛋白酶</td><td>Promega</td><td>V5113</td><td></td></tr><tr><td>三氟乙酸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T6508</td><td></td></tr><tr><td>Ultimate 3000 高效液相色谱仪</td><td>Dionex</td><td></td><td></td></tr><tr><td>尿素</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>U5378</td><td></td></tr><tr><td>真空浓缩仪 5301</td><td>Eppendorf</td><td></td><td>真空浓缩仪</td></tr></tbody></table>

一种基于质谱的蛋白质组学方法用于全局且高置信度的蛋白质精氨酸甲基化分析

A Mass Spectrometry-Based Proteomics Approach for Global and High-Confidence Protein R-Methylation Analysis

蛋白质精氨酸（R）甲基化是一种广泛存在的蛋白质翻译后修饰（PTM），参与调控多种细胞通路，包括RNA加工、信号转导、DNA损伤应答、miRNA生成以及翻译过程。
近年来，得益于生物化学与分析技术的进步，基于质谱（MS）的蛋白质组学已成为以单一位点分辨率表征细胞甲基化蛋白质组的最有效策略。然而，甲基化蛋白的鉴定与分析仍面临挑战。 体内 由于这种修饰具有亚化学计量性质，且存在多种氨基酸替换以及酸性残基的化学甲基酯化（与甲基化具有相同质荷比），因此通过质谱法检测蛋白质R-甲基化仍具有挑战性且容易出错。因此，在甲基化蛋白质组学研究中，需要采用富集方法以提高R-甲基化肽段的鉴定效率，并结合正交验证策略以降低假发现率（FDR）。
本文描述了一种专门用于从细胞样品中高置信度鉴定和定量R-甲基化肽的实验方案，该方案结合了使用重同位素编码的甲硫氨酸（hmSILAC）对细胞进行代谢标记，以及对全细胞裂解液进行双蛋白酶溶液内消化，随后通过离线高pH反相（HpH-RP）色谱分离，并利用抗广谱R-甲基化抗体对R-甲基化肽进行亲和富集。经过高分辨率质谱分析后，原始数据首先使用MaxQuant软件包进行处理，然后利用hmSEEKER软件对MaxQuant输出文件中对应的轻链与重链甲基化肽的质谱峰对进行深度搜索分析。

本文描述了一种高置信度鉴定全局蛋白质精氨酸甲基化的工作流程，该流程基于将蛋白质提取物平行地用两种不同的蛋白酶进行酶解消化，随后对蛋白水解肽段进行HpH反相液相色谱分级，并利用抗广谱精氨酸甲基化抗体对精氨酸甲基化肽段进行免疫亲和富集（图1）。
细胞在甲硫氨酸存在条件下培养，甲硫氨酸包括天然形式（轻型，L，Met-0）或同位素标记形式（重型，H，Met-4）。通过仅对少量Met-4提取物进行质谱（MS）分析，验证了完全的同位素标记后，收集重链和轻链细胞，并按1:1的轻/重（L/H）比例混合，如图1A所示。在13CD3-甲硫氨酸代谢标记过程中，甲基通过甲基供体S-腺苷甲硫氨酸（SAM）添加到蛋白质骨架上，且将以轻或重同位素形式存在21。图1B描述了由蛋白质精氨酸甲基转移酶（PRMTs）家族催化的精氨酸甲基化反应，该反应将...

蛋白质精氨酸（R）甲基化是一种广泛存在的翻译后修饰，可调控多种生物通路。当与修饰肽富集的生物化学方法相结合时，质谱技术是全局分析R-甲基化蛋白质组的最佳手段。本文描述了在人类细胞中高置信度鉴定全局R-甲基化的实验流程。

蛋白质精氨酸（R）-甲基化是一种广泛存在的蛋白质翻译后修饰（PTM），参与调控多种细胞通路，……

该方案具有重要意义，因为它代表了通过质谱技术对蛋白质精氨酸甲基化进行全局分析的最新工作流程。这是唯一能够以单一修饰位点分辨率鉴定和分析精氨酸甲基化蛋白质的方法，而其他生物化学技术无法实现这一目标。当结合使用蛋白质精氨酸甲基转移酶（PRMT）抑制剂时（其中多个抑制剂正处于临床试验阶段并作为抗癌药物），该方案可深入解析这些药物的作用机制。首先，使用超纯水配制的二硫苏糖醇（DTT）储存液对蛋白质的巯基进行还原，终浓度为4.5毫摩尔，在55摄氏度反应30分钟。随后，加入碘乙酰胺至终浓度为10毫摩尔，于室温避光孵育15分钟，对蛋白质的巯基进行烷基化。为验证蛋白质消化效率，保留一份蛋白质提取物的等分试样，用于后续SDS-PAGE考马斯亮蓝染色凝胶分析，并与消化后的相应量样品进行比较。将剩余的蛋白质提取物用四倍体积的20毫摩尔HEPES（pH 8.0）稀释，使终浓度为2摩尔尿素。将样品分为两部分，分别向其中一份加入测序级修饰胰蛋白酶，另一份加入LysargiNase蛋白酶。将样品置于37摄氏度的ThermoMixer中，以每分钟600转的速度孵育过夜，以完成酶解消化。针对每个色谱梯度，将所有组分收集至深孔96孔板中。将梯度开始前收集的组分合并为一个单一组分，命名为pre。通过非连续合并的方式，将高pH反相液相色谱梯度中收集的60个组分合并为14个最终组分。为了获得非连续连接，按照文稿中的描述合并高pH反相洗脱组分。将梯度洗脱后收集的组分合并为一个单独的组分，命名为post。分别对胰蛋白酶和LysargiNase消化得到的两个样品进行连续的免疫亲和富集，以富集修饰肽段。将10倍浓缩的免疫亲和纯化（IAP）缓冲液稀释10倍。将冻干的多肽在2,000 G离心5分钟，使多肽沉降至管底。每管15毫升样品用250微升稀释后的IAP缓冲液重悬多肽，并转移至1.5毫升低吸附管中。使用石蕊试纸检测，确保 pH 值大于六。保留每份组分的一小部分作为后续质谱分析的输入样品。将每份组分均分为两部分，以平行进行不对称二甲基化（ADMA）和对称二甲基化（SDMA）肽段的免疫富集。每10毫克初始蛋白提取物准备三管与蛋白A琼脂糖珠偶联的特异性抗泛R-甲基化抗体。通过在2,000 G离心30秒并移除珠子中的缓冲液，确定与琼脂糖珠偶联的抗体的正确用量。用1毫升1×PBS将珠子洗涤三次，每次在2,000 G离心30秒。最后一次洗涤后，将每管珠子重悬于40 µL 1× PBS中，合并所有珠子，然后均分为16份。每管加入250 µL 1× IAP缓冲液，通过倒置混匀。随后将各管置于4 °C旋转摇床上孵育2小时。孵育结束后，将含有肽段和与泛R-甲基化抗体偶联的磁珠的1.5毫升离心管在2,000 G条件下离心30秒，使磁珠沉淀，然后将每份上清液转移至新的1.5毫升低吸附离心管中。将磁珠加入与R-单甲基化抗体偶联的上清液中，重复用PBS重悬、IAP缓冲液孵育及离心步骤。在肽段样品与单甲基化或MMA磁珠孵育期间，用250微升IAP缓冲液对先前使用抗ADMA和SDMA抗体进行免疫沉淀的各组分洗涤两次，每次洗涤后弃去上清液。然后用LC-MS级水洗涤三次。通过向每根试管中加入50微升0.15% TFA，从琼脂糖珠上洗脱亲和富集的SDMA或ADMA肽。室温下孵育10分钟，每隔两到三分钟颠倒试管一次。将第一次洗脱液转移至洁净的1.5毫升低吸附离心管中，并用50微升0.15 TFA重复洗脱一次。将两次洗脱液合并至同一管中。对与抗MMA抗体磁珠孵育的R-单甲基化肽段重复此过程。混合轻标记和重标记细胞后，提取蛋白质并用胰蛋白酶和LysargiNase进行消化。通过SDS-PAGE考马斯亮蓝染色凝胶验证总蛋白质是否被高效酶解为肽段。评估了C18 Sep-Pak柱纯化步骤的效率，确认在C18柱的穿流液、第一次和第二次洗涤液中均无肽段存在，而洗脱液中则检测到预期的肽段。评估了重通道中MET4的正确掺入以及重链与轻链的正确混合。此处展示了肽段经离线高pH反相液相色谱分离后的色谱图及后续非连续级分合并的结果。肽段通过250纳米紫外检测，而可能残留的未消化蛋白质则通过280纳米紫外进行评估。获得了代表真实阳性甲基化肽段注释的肽段全扫描质谱图。三个峰之间的质荷比（M/Z）差异与酶促甲基化残基的存在一致。获得了代表假阳性甲基化肽注释的肽段的完整质谱图。轻甲基化肽与其对应的重同位素标记肽之间的质荷比（M/Z）差异偏离预期值0.0312。该实验方案的整体流程为线性，但有几个步骤需要特别注意。例如，非连续组分合并的 IPH 色谱分离以及 IP 实验设置。该方案可与标准 SILAC 或无标记定量方法联用，用于分析在多种扰动条件下精氨酸甲基化动态变化。该方案为在多种细胞类型和模型系统中表征蛋白质甲基化的程度与动态变化奠定了基础，支持针对PRMTs的基础研究和转化研究的各个方面。

a-mass-spectrometry-based-proteomics-approach-for-global-high

Research

科研

JoVE Journal

Biochemistry

生物化学

基于质谱的蛋白质组学方法用于全局和高置信度的蛋白质R-甲基化分析

捕获化合物（Capture Compounds）是一类具有三重功能的小分子，可通过功能性可逆的小分子-蛋白质相互作用降低蛋白质组的复杂性，随后进行光交联和纯化。在此，我们使用一种以S-腺苷-L-高半胱氨酸结合为选择性功能的捕获化合物，从大肠杆菌（Escherichia...

甲基转移酶及其他 S-腺苷-L-高半胱氨酸结合蛋白的捕获化合物质谱法（CCMS）分析

通过结合天然染色质免疫沉淀与交联染色质免疫沉淀，并联合高分辨率质谱技术，ChroP...

ChroP 方法结合染色质免疫沉淀与质谱技术解析染色质位点特异性蛋白质组景观

亚硫酸氢盐扩增子测序（BSAS）是一种用于定量目标基因组区域中胞嘧啶甲基化水平的方法。该方法在下一代测序之前，结合亚硫酸氢盐转化与目标区域的PCR扩增，从而在单碱基水平上实现DNA甲基化的绝对定量。...

通过下一代测序进行靶向DNA甲基化分析

本方案概述了一种利用质谱法（MS）全面表征组蛋白翻译后修饰的整合工作流程。该流程包括从细胞培养物或组织中纯化组蛋白、组蛋白衍生化与消化、采用纳米流速液相色谱进行质谱分析，以及数据分析的详细说明。本方案设计可在2至3天内完成。...

使用自下而上质谱法分析组蛋白翻译后修饰的完整工作流程：从组蛋白提取到数据分析

我们介绍一种从复杂的生物样品中纯化、检测和鉴定来源于泛素化蛋白质的diGly肽的方法。该方法具有良好的重复性和稳健性，在泛素化修饰组分析的深度方面优于已发表的方法。...

通过肽段富集与质谱法检测蛋白质泛素化位点

本方案旨在从高粱叶片材料中有效提取完整组蛋白，用于分析组蛋白翻译后修饰，这些修饰可作为潜在的表观遗传标记，有助于培育抗旱作物。...

从高粱叶片组织中分离组蛋白用于潜在表观遗传标记的自上而下质谱分析

本方案介绍了一种利用两种方法——基于标签和非标签定量——对组织样本进行优化的定量蛋白质组学分析。基于标签的方法在蛋白质定量方面具有更高的准确性优势，而非标签方法则更具成本效益，适用于对大规模队列中的数百个样本进行分析。...

基于质谱的组织样本鸟枪法蛋白质组学综合工作流程

这些方案提供了在细胞中评估蛋白质精氨酸甲基转移酶（PRMT）家族各个成员酶活性的方法学。文中详细描述了利用内源性和外源性生物标志物、识别甲基化精氨酸的抗体以及抑制剂工具化合物来评估PRMT活性的具体操作指南。...

研究细胞中蛋白质精氨酸甲基转移酶1-9活性的定量方法

本方案可从多种临床样本中高效提取组蛋白，用于后续通过液相色谱-串联质谱法（LC-MS/MS）进行翻译后修饰分析。通过实现对关键组蛋白修饰的可靠检测，该方法可作为大规模临床队列中全面表观遗传学分析的重要工具。...

从临床样本中提取组蛋白用于质谱法进行表观遗传学分析

构象柔性在蛋白质功能中起着关键作用。本文介绍了将时间分辨电喷雾电离质谱与氢-氘交换相结合，用于研究有序和无序蛋白质中驱动功能的快速结构变化。...

时间分辨电喷雾电离氢氘交换质谱法用于研究蛋白质结构与动力学

了解基于质谱的蛋白质组学方法用于全局和高置信度的蛋白质精氨酸甲基化分析。该方案整合代谢标记、双蛋白酶消化、高pH反相色谱和免疫亲和富集技术，支持PRMT抑制剂机制研究及动态甲基化组学分析。

一种基于质谱的蛋白质组学方法用于全局且高置信度的蛋白质精氨酸甲基化分析

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