Name: 监测氧诱导视网膜病变小鼠模型中视网膜血管的动态生长 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-04-02T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 32 s
Description: 学习免疫荧光染色制备小鼠视网膜平铺片的方法，用于氧诱导视网膜病变模型中血管动态变化的观察。该技术保留视网膜完整性，使每只小鼠可作为自身对照，为研究视网膜疾病机制提供可靠工具。

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感谢我们实验室及中山眼科中心眼科动物实验室所有成员提供的技术支持。同时感谢刘春巧教授给予的实验支持。本研究得到国家自然科学基金（NSFC：81670872；中国北京）、广东省自然科学基金（资助号：2019A1515011347）以及中山眼科中心眼科学国家重点实验室高水平医院建设项目的资助（资助号：303020103；中国广东省广州市）。

所有涉及小鼠使用的实验程序均经中山大学中山眼科中心动物实验伦理委员会批准（批准编号：2020-082），并遵循中山眼科中心动物护理与使用委员会及视力与眼科研究协会（ARVO）《眼科与视力研究中动物使用声明》中的相关规定。
1. 小鼠OIR模型的诱导
<ol>
	<li>选用眼部先天畸形发生率较低的小鼠品系，例如 C57BL/6J 小鼠，以雄:雌 = 1:2 的比例进行交配。获取同一天出生的仔鼠，并于出生后第 7 天（P7）开始建立氧诱导视网膜病变（OIR）模型。建模前严格记录每只仔鼠的体重。 
	注意：将出生当天记为 P0。定期记录每只小鼠的体重。新生仔鼠的体重在 OIR 模型诱导过程中至关重要，因为不同状态小鼠对氧气的敏感性存在差异。在 P7 时剔除体重超过 5 g 的仔鼠，以确保实验结果具有可比性。</li>
	<li>为哺乳母鼠及其仔鼠提供适宜的生活环境，例如将环境温度设定为 23 °C ± 2 °C，湿度控制在 40%–65%，每日实行 12 小时光照与 12 小时黑暗交替，笼内添加适量脱脂棉供筑巢使用，保证充足的灭菌饲料和饮水，并将动物饲养于独立通风笼具（IVC）中。</li>
	<li>监测氧舱内的湿度和温度水平。将湿度控制在 40% 至 65% 之间，温度维持在 23 °C ± 2 °C。</li>
	<li>使用氧气传感器检测氧气供应情况，维持氧浓度恒定在 75%，并控制氧气流速在 0.5–0.75 L/min。在氧舱底部放置 50 g 钠石灰，以吸收过量 CO2，使 CO2 浓度保持在 3% 以下22。</li>
	<li>每天至少观察一次哺乳母鼠的行为，包括筑巢行为、咬伤仔鼠或拒绝哺乳等情况。剔除母性行为不良的哺乳母鼠。</li>
	<li>将出生第 7 天（P7）的仔鼠（雄性和雌性）及其哺乳母鼠放入氧浓度为 75% 的氧舱中，持续 5 天至出生后第 12 天（P12）。在模型诱导期间避免不必要的氧舱开启。确保准备额外的代乳母鼠以备替换，以防哺乳母鼠因高氧暴露导致肺损伤而死亡。 
	注意：为保证实验的可比性，每只哺乳母鼠哺育的仔鼠数量应限制在 6–8 只。需关注高氧可能引起的氧毒性问题，这可能导致部分哺乳母鼠死亡。哺乳母鼠高氧性肺损伤的表现包括但不限于呼吸频率波动、活动减少和摄食量下降。一旦出现上述现象，应尽快使用 1% 戊巴比妥钠（50 mg/kg）实施安乐死。准备若干代乳母鼠（例如 129S1/SvImJ 品系）以备必要时替换，但仅在必要时使用。不建议常规更换哺乳母鼠，因其将导致氧舱频繁开启，引起氧浓度波动，并可能诱发母鼠攻击行为。</li>
	<li>在 P12 将仔鼠及其哺乳母鼠移回常氧环境，并持续监测所有仔鼠的体重直至 P17。根据体重对仔鼠进行分组，确保各实验组间体重分布相似。</li>
</ol>
2. 视网膜整体装片的制备与免疫荧光染色
<ol>
	<li>记录幼崽的体重。通过过量麻醉剂（1% 戊巴比妥钠，50 mg/kg）或吸入 CO2 处死幼崽。如有必要，也可采用其他安乐死方法，如颈椎脱位或双侧开胸术。</li>
	<li>使用弯头剪刀分离眼球与眼眶组织之间的连接。然后将弯头镊子插入眼球后部，夹住视神经，并迅速将眼球从眼眶中提起。将眼球置于预冷的 1× 磷酸盐缓冲液（PBS）中清洗，以去除眼球表面的毛发和血液。</li>
	<li>将清洗后的眼球放入装有 4% 多聚甲醛（PFA）的 2 mL 微量离心管中，在室温下以 12–15 转/分钟（rpm）的速度振荡孵育 15 分钟（初次固定）。 
	警告：多聚甲醛具有致敏性，通常有毒，且具有极强的细胞毒性。请严格遵守安全操作规程，避免吸入和皮肤接触。</li>
	<li>取一培养皿，在中央滴加一滴 1× PBS，并在解剖显微镜下进行以下操作：将一个眼球放入此液滴中。用一对镊子夹住眼球，使用 1 mL 注射器针头在角膜缘处小心刺破角膜。将剪刀尖端插入该孔，沿角膜缘小心剪除角膜。注意不要损伤视网膜。</li>
	<li>用镊子移除虹膜和晶状体。然后将剩余的眼杯放入 4% PFA 中，在室温下以 12–15 rpm 的速度振荡再固定 45 分钟（二次固定）。</li>
	<li>取一培养皿，在中央滴加一滴 1× PBS。将固定后的眼球置于该液滴中，用镊子夹住眼球。使用两把镊子轻轻分离视网膜与巩膜层。将剪刀尖端插入视网膜与巩膜之间，沿视神经方向剪开巩膜。剥离巩膜，获得视网膜杯。 
	注意：可用镊子夹住视神经处的后部眼杯，再用另一把镊子的弯曲端在视神经乳头处按压巩膜，并以前向扫动的方式轻柔按摩，以替代方式分离视网膜。</li>
	<li>用镊子松解玻璃体动脉分支与周边视网膜之间的连接，夹住靠近视神经乳头处的玻璃体动脉根部，小心剪断玻璃体动脉。</li>
	<li>使用剪去尖端的 2 mL 移液器转移视网膜杯。将视网膜杯放入 48 孔板中的一个孔内，在室温下以 12–15 rpm 的速度用 1× PBS 洗涤 3 次，每次 5 分钟。</li>
	<li>将视网膜杯在含有 1% Triton X-100（溶于 PBS）和 5% 正常驴血清（溶于 PBS）的混合溶液中，于 4 °C 过夜孵育。
	<ol>
		<li>也可选择在室温下用封闭液和通透液处理视网膜 1 小时。根据二抗来源选择相应的封闭血清。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>若使用 Isolectin B4 标记视网膜血管系统，将视网膜置于 48 孔板的一个孔中，加入含 0.1% 正常驴血清（400 µL）和 IsolectinB4-594（1:400）的溶液，在 4 °C、12–15 rpm 条件下于摇床上过夜孵育。 
	注意：若使用其他标记物（如 CD31）标记血管，或标记其他细胞类型，请使用相应的特异性一抗进行标记。</li>
	<li>将视网膜在 400 µL 含 0.1% 正常驴血清的溶液中，加入 1:100–1:500 稀释的特异性一抗，在 4 °C、12–15 rpm 条件下于摇床上孵育 48 小时（可选）。</li>
	<li>恢复至室温后，用 0.1% PBST（含 0.1% Triton X-100 的 PBS）在室温、12–15 rpm 条件下洗涤视网膜 3 次，每次 20 分钟。</li>
	<li>将视网膜在 400 µL 含 0.1% 正常驴血清的溶液中，加入 1:1,000 稀释的二抗，在 4 °C、12–15 rpm 条件下于摇床上过夜孵育（可选）。
	<ol>
		<li>也可选择在室温下使用高亲和力二抗孵育 1 小时。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>在室温下用 DAPI（1:1,000）孵育视网膜 20–25 分钟，以标记细胞核。 
	注意：在预实验中测试步骤 10–11 和 13–14 中所用所有抗体的最佳稀释比例。</li>
	<li>在室温、12–15 rpm 条件下，用 0.1% PBST 在摇床上洗涤视网膜 3 次，每次 30 分钟。</li>
	<li>将视网膜杯转移至洁净载玻片上，开口朝上。从周边向中心方向，在 3、6、9 和 12 点钟位置沿放射方向剪开视网膜，剪切位置距离视神经乳头约 1–1.5 mm。</li>
	<li>滴加数滴 1× PBS 冲洗视网膜三次。用吸水纸吸干并展平视网膜。在盖玻片中央滴加封片剂（见材料表），持续滴加直至液滴直径扩展至盖玻片的一半。迅速翻转盖玻片，将其覆盖在展开的视网膜上，避免产生气泡。</li>
	<li>拍摄视网膜平铺标本图像，或将载玻片避光保存于 4 °C。</li>
</ol>
3. 视网膜平铺样品的分析与定量
注意：在氧诱导视网膜病变（OIR）小鼠模型中，研究人员通常记录P12至P25期间中央视网膜血管闭塞区域以及周边视网膜病理性新生血管的范围。既往研究表明，视网膜中央无血管区在P12时达到最大，随后从P13至P17逐渐缩小；与此同时，OIR小鼠视网膜新生血管面积在约P17时达到峰值22,29。从P17开始，新生血管逐渐消退，功能性血管重新生长进入无血管区域。至P25时，视网膜血管结构基本恢复正常33。
<ol>
	<li>使用荧光显微镜（见材料表）配备10倍物镜拍摄视网膜平铺片的图像。首先选择DAPI通道，并将视神经乳头置于视野中央。然后调整其他通道，聚焦于视网膜表层血管。在图像软件中（见材料表）勾选拼图选项，设置需要拼接的照片数量，点击开始实验以获取完整的视网膜图像。</li>
	<li>使用图像处理软件（见材料表）对免疫荧光染色后的血管闭塞区（VO）和新生血管区（NV）面积进行定量分析。
	<ol>
		<li>首先点击魔棒工具，根据亮度差异设置适当的容差值，将光标移至背景区域并单击鼠标。然后选择反向选择，获得视网膜的基本轮廓。使用套索工具进一步勾勒视网膜的细节轮廓。利用直方图功能记录整个视网膜的像素值，并将其记录下来或在数据库程序中生成表格。</li>
		<li>将视网膜图像分为四个象限。在每个象限中，使用套索工具勾画VO区域（图2A-C），使用魔棒工具选择NV区域（图2D-F）。通过直方图中的像素信息，计算VO和NV区域相对于整个视网膜的像素比例，即VO或NV区域占整个视网膜的百分比。 
		注意：目前也存在一个基于深度学习神经网络的开源全自动分析流程，可用于OIR图像中VO和NV区域的定量分析（http://oirseg.org/），&#160;该方法为研究人员提供了可靠且节省时间的解决方案，同时统一了定量分析的标准34。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将像素信息记录在电子表格中，以便后续分析。</li>
</ol>
4. 体内 荧光素眼底血管造影（FFA）成像
注意：对于氧诱导视网膜病变（OIR）小鼠，由于实验动物死亡，荧光素异硫氰酸酯（FITC）灌注和免疫荧光染色均只能使用一次。相比之下，荧光素眼底血管造影（FFA）的一个优势在于能够活体观察小鼠视网膜血管在发育和病理状态下的动态变化in vivo35,36。
<ol>
	<li>在麻醉前称量幼鼠体重。</li>
	<li>通过腹腔注射0.3%戊巴比妥钠，剂量为30–50 mg/kg，对幼鼠进行麻醉。 
	注意：对于1个月以内的小鼠，需特别注意麻醉剂量。应使用较低浓度和剂量的麻醉剂，以减少因麻醉导致的小鼠死亡。幼鼠麻醉后，使用小型加热垫维持其体温。低体温不仅会影响幼鼠的生理功能，还会引起晶状体蛋白变化，加速白内障的发展。</li>
	<li>每只幼鼠使用20 µL散瞳眼药水（0.5%托吡卡胺 + 0.5%盐酸去氧肾上腺素），滴药后等待5分钟，以实现持久的瞳孔扩张（图3A，B）。</li>
	<li>将麻醉后的幼鼠置于成像设备前（参见材料表）。保持幼鼠位于小型加热垫上，将其固定于稳定位置，并定期使用人工泪液以维持角膜湿润。点击红外眼底成像（IR）模式，调整视神经乳头至屏幕中央。&#160; 
	注意：观察幼鼠一只眼睛时，切勿忽略对另一只眼睛的保护。可使用羟丙甲纤维素眼药水，防止角膜因干燥而变白。</li>
	<li>腹腔注射0.15 mL 0.5%荧光素钠溶液后，立即点击成像设备触摸面板上的FA按钮和注射按钮以开始计时。在视网膜血液循环进入静脉期3分钟后记录图像，并持续观察视网膜不少于6–8分钟。 
	注意：腹腔注射荧光素钠溶液后，幼鼠的皮肤、黏膜和尿液会呈现明显的黄绿色。大部分荧光素在一天内被幼鼠排出体外。每隔一天腹腔注射一次荧光素钠，连续注射六次，不会引起显著的不良反应37。</li>
	<li>将视神经乳头移至图像采集区域中心，拍摄中央视网膜的第一张图像。然后将成像设备的镜头水平向眼球鼻侧移动，直至视神经乳头位于图像采集区域一侧的中点，拍摄第二张图像。以此方法继续分别拍摄颞侧、上方和下方视网膜的图像（图3C）。 
	注意：应在12分钟内完成&#34;五方位&#34;图像采集，以免进入消退期。由于镜头角度调节受限，下方视网膜图像中视神经乳头的位置允许不落在边缘线上。</li>
	<li>保存图像，并使用图像处理软件进行拼接。</li>
</ol>
5. 荧光素眼底血管造影（FFA）的图像处理
<ol>
	<li>打开图像处理程序，点击文件中的新建，创建一个具有黑色背景的新画布（图4A）。</li>
	<li>首先在背景图层中打开中央视网膜的图像。点击文件并添加第二幅图像。将第二幅图像的不透明度调整为60%，移动并调整其大小，直到两幅图像的相同部分高度重叠。点击在自由变换与变形模式间切换按钮，如有必要，对血管进行细微调整。然后，将第二幅图像的不透明度恢复至100%（图4A、B）。</li>
	<li>同时选中两幅图像，点击自动混合图层。选择全景图作为混合方法，并勾选以下两句话。点击确定，完成前两幅图像的拼接（图4C、D）。</li>
	<li>将前两幅已拼接的图像视为整体，添加第三幅图像并继续进行混合。重复上述方法，完成五幅图像的拼接（图4E）。</li>
	<li>使用裁剪工具将不同时间点的FFA图像裁剪为统一尺寸，观察正常幼鼠和OIR幼鼠从P15到P25视网膜血管的动态变化。</li>
</ol>
6. 统计分析
<ol>
	<li>以均值 ± 标准差（s.d.）表示结果。</li>
	<li>使用 Student's t-检验比较两组独立样本。使用单因素方差分析（One-Way ANOVA）比较多组数据，并结合 Dunnett 检验或 Tukey 检验进行多重比较，后者为常用的多重比较方法。</li>
	<li>对于非正态分布的数据，采用 Mann-Whitney U 检验或 Kruskal-Wallis 检验。当 P &#60; 0.05 时，认为差异具有统计学显著性。</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

小鼠对氧诱导视网膜病变（OIR）的易感性受多种因素影响。不同遗传背景和品系的幼鼠之间不可相互比较。在BALB/c白化小鼠中，血管会迅速重新生长进入无血管区（VO区域），新生血管簇显著减少38，这给研究带来一定困难。与BALB/cJ小鼠品系相比，C57BL/6小鼠表现出更严重的光感受器损伤39,40。不同类型的转基因小鼠也存在类似差异41,42,43。此外，与129S3/SvIM小鼠相比，C57BL/6小鼠的血管生成水平较低44。
出生后体重增长（PWG）也是需要考虑的重要因素45，是评估新生儿营养状况的指标之一。PWG 已成为预测早产儿视网...

视网膜新生血管形成（RNV）是指病理性新生血管起源于现有的视网膜静脉，通常沿视网膜内表面延伸，并向玻璃体（或在某些情况下向视网膜下腔）生长1。它是多种缺血性视网膜病变的典型特征和常见表现，包括早产儿视网膜病变（ROP）、视网膜静脉阻塞（RVO）和增殖性糖尿病视网膜病变（PDR）2。
大量临床和实验观察表明，缺血是视网膜新生血管形成的主要原因3,4。在早产儿视网膜病变（ROP）中，为了提高存活率，新生儿在密闭培养箱中暴露于高浓度氧气环境，这同时也是导致血管生长停滞的重要因素。治疗结束后，新生儿视网膜会经历一个相对缺氧的时期5。在视网膜静脉阻塞（RVO）中可观察到中央或分支视网膜静脉的闭塞情况，而在增殖性糖尿病视网膜病变（PDR）中则可见由微血管病变引起的视网膜毛细血管损伤2。缺氧进一步通过缺氧诱导因子-1α（HIF-1α）信号通路增加血管生成因子（如血管内皮生长因子，VEGF）的表达，从而引导血管内皮细胞向缺氧区域生长并形成新生血管6,7。
早产儿视网膜病变（ROP）是一种发生在早产儿中的血管增生性视网膜病，也是导致儿童盲症的主要原因之一8,9，其特征为视网膜缺氧、视网膜新生血管形成以及纤维组织增生10,11,12。20世纪50年代，研究人员发现高浓度氧气可显著改善早产儿的呼吸症状13,14，因此当时氧疗在早产儿中被越来越广泛地使用15。然而，随着氧疗在早产儿中的普遍应用，ROP的发病率逐年上升。自此，研究人员开始将氧气暴露与ROP联系起来，并建立多种动物模型以探究ROP及视网膜新生血管（RNV）的发病机制16。
在人类中，大部分视网膜血管系统的发育在出生前已完成，而在啮齿类动物中，视网膜血管在出生后发育，这为研究视网膜血管系统的血管生成提供了一个易于操作的模型系统2。随着研究的不断进展，氧诱导视网膜病变（OIR）模型已成为模拟缺血所致病理性血管生成的主要模型。在OIR模型的研究中并无特定的动物物种限制，该模型已在多种动物物种中建立，包括小猫17、大鼠18、小鼠19、比格犬幼犬20和斑马鱼21。所有这些模型均基于相同的机制，即在视网膜早期发育阶段暴露于高氧环境，随后恢复至常氧环境。Smith等人观察到，将出生后第7天（P7）的小鼠幼崽暴露于高氧环境5天，可导致中央视网膜血管显著退化，而在出生后第12天（P12）将其恢复至室内空气环境后，逐渐触发新生血管簇的形成，这些新生血管向玻璃体方向生长19。这一标准化的小鼠OIR模型也被称为Smith模型。Connor等人在2009年进一步优化了实验方案，提供了一种可广泛适用的方法，用于定量测量血管闭塞区（VO）和新生血管区（NV）的面积，从而提高了该模型的接受度和使用率22。由于小鼠体型小、繁殖快、遗传背景清晰、重复性好且成功率高，OIR小鼠模型至今仍是应用最为广泛的模型。
在小鼠中，视网膜血管化始于出生后，血管从视神经乳头向内层视网膜延伸至锯齿缘。在正常视网膜发育过程中，首批视网膜血管于出生前后从视神经乳头处出芽，形成一个不断扩展的血管网络（初级血管丛），约在出生后第7天（P7）到达视网膜周边区域23。随后，血管开始向视网膜深层生长，穿透视网膜，并在内核层（INL）周围建立分层的血管网络，类似于人类的结构24。到出生后第三周结束时（P21），深层血管丛的发育已基本完成。在氧诱导视网膜病变（OIR）小鼠模型中，由于高氧暴露期间中央区域大量未成熟血管网络迅速退化，血管闭塞总是出现在中央视网膜。因此，病理性新生血管的生长主要发生在中周部视网膜，即无灌注区与有血管区的交界处。然而，人类视网膜血管在出生前已基本形成。对于早产儿而言，当暴露于高氧环境时，周边视网膜尚未完成血管化25,26。因此，血管闭塞和新生血管主要出现在周边视网膜27,28。尽管存在这些差异，小鼠OIR模型仍能高度模拟缺血诱导的病理性新生血管形成过程中的关键病理事件。
OIR 模型的诱导可分为两个阶段29：在第一阶段（高氧阶段），由于 VEGF 水平下降以及内皮细胞发生凋亡，视网膜血管发育受到抑制或延缓，导致血管闭塞和退化24,30；在第二阶段（缺氧阶段），在常氧环境下视网膜的氧气供应将变得不足29，而氧气对于神经发育和稳态维持至关重要19,31。这种缺血状态通常会导致失控性的异常新生血管形成。
目前常用的造模方法是交替高低氧暴露：在出生后第7天（P7）开始，将母鼠及其幼崽暴露于75%氧气环境中5天，随后在空气中饲养5天至出生后第17天（P17），该时间点为氧诱导视网膜病变（OIR）小鼠模型诱导的终点，此方法已显示出可重复的结果22。（图1）。除了模拟早产儿视网膜病变（ROP）外，这种由缺血介导的病理性新生血管形成还可用于研究其他缺血性视网膜疾病。该模型的主要检测指标包括对无血管区（VO）和新生血管（NV）面积进行定量分析，这些指标通过视网膜铺片的免疫荧光染色或FITC-葡聚糖灌注来评估。由于操作具有致死性，每只小鼠仅能用于一次实验。目前，在血管退化和病理性血管生成过程中，连续观察视网膜血管动态变化的方法仍较少32。本文提供了一套详细的OIR模型建立方法、视网膜铺片分析流程，以及小鼠荧光素眼底血管造影（FFA）的操作流程，有助于更全面地理解OIR小鼠模型两个阶段中血管的动态变化。

<table><tbody><tr><td>1 mL 无菌注射器</td><td>Solarbio</td><td>YA0550</td><td>用于制备视网膜平铺片及腹腔注射</td></tr><tr><td>1&amp;times; 磷酸盐缓冲液（PBS）</td><td>Transgen Biotech</td><td>&amp;nbsp;FG701-01</td><td>用于制备视网膜平铺片</td></tr><tr><td>2 ml 微型离心管</td><td>Corning</td><td>MCT-200-C</td><td>用于制备视网膜平铺片</td></tr><tr><td>48 孔透明 TC 处理多孔板</td><td>Corning</td><td>3548</td><td>用于制备视网膜平铺片</td></tr><tr><td>粘附性显微镜载玻片</td><td>Various</td><td></td><td>用于制备视网膜平铺片</td></tr><tr><td>Adobe Photoshop CC 2019</td><td>Adobe Inc.</td><td></td><td>用于图像分析</td></tr><tr><td>二氧化碳气体</td><td>Various</td><td></td><td>用于安乐死</td></tr><tr><td>盖玻片</td><td>Various</td><td></td><td>用于制备视网膜平铺片</td></tr><tr><td>弯头镊子</td><td>World Precision Instruments</td><td>14127</td><td>用于制备视网膜平铺片</td></tr><tr><td>DAPI 染色液</td><td>Abcam</td><td>ab228549</td><td>用于视网膜平铺片上细胞核的标记</td></tr><tr><td>解剖显微镜</td><td>Olmpus</td><td>SZ61</td><td>用于制备视网膜平铺片</td></tr><tr><td>荧光素钠</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F6377</td><td>用于 &lt;em&gt;in vivo&lt;/em&gt; 成像</td></tr><tr><td>荧光显微镜</td><td>&amp;nbsp;Zeiss</td><td>AxioImager.Z2</td><td>用于获取视网膜平铺片的荧光图像</td></tr><tr><td>Fluoromount-G 封片介质</td><td>SouthernBiotech</td><td>&amp;nbsp;0100-01</td><td>用于制备视网膜平铺片</td></tr><tr><td>羟丙基甲基纤维素</td><td>Maya</td><td>89161</td><td>用于 &lt;em&gt;in vivo&lt;/em&gt; 成像</td></tr><tr><td>Isolectin B4 594 抗体</td><td>Invitrogen</td><td>I21413</td><td>用于视网膜平铺片上视网膜血管系统的标记</td></tr><tr><td>小鼠 C57/BL6J</td><td>江苏集萃药康生物科技股份有限公司</td><td></td><td>用于氧诱导视网膜病变模型的建立</td></tr><tr><td>直刃显微解剖剪</td><td>World Precision Instruments</td><td>503242</td><td>用于制备视网膜平铺片</td></tr><tr><td>4 号直头镊子</td><td>World Precision Instruments</td><td>&amp;nbsp;501978-6</td><td>用于制备视网膜平铺片</td></tr><tr><td>正常驴血清</td><td>Abcam</td><td>ab7475</td><td>用于制备视网膜平铺片</td></tr><tr><td>O&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; 传感器</td><td>Various</td><td></td><td>用于监测 O&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; 浓度</td></tr><tr><td>OxyCycler</td><td>Biospherix</td><td>A84XOV</td><td>用于氧诱导视网膜病变模型的建立</td></tr><tr><td>多聚甲醛（PFA）</td><td>Sigma</td><td>P6148-1KG</td><td>用于组织固定</td></tr><tr><td>戊巴比妥钠</td><td>Various</td><td></td><td>用于麻醉</td></tr><tr><td>钠石灰</td><td>Various</td><td></td><td>用于吸收氧舱中过量的 CO&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td></tr><tr><td>SPECTRALIS HRA+OCT</td><td>Heidelberg</td><td>HC00500002</td><td>用于 &lt;em&gt;in vivo&lt;/em&gt; 成像</td></tr><tr><td>SPSS Statistics 22.0</td><td>IBM</td><td></td><td>用于统计分析</td></tr><tr><td>脱色摇床</td><td>Kylin-Bell</td><td>ZD-2008</td><td>用于制备视网膜平铺片</td></tr><tr><td>组织培养皿（低吸附）</td><td>Corning</td><td>3261-20EA</td><td>用于制备视网膜平铺片</td></tr><tr><td>移液管</td><td>Various</td><td></td><td>用于制备视网膜平铺片</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>&amp;nbsp;SLBW6818</td><td>用于制备视网膜平铺片</td></tr><tr><td>托吡卡胺</td><td>Various</td><td></td><td>用于 &lt;em&gt;in vivo&lt;/em&gt; 成像</td></tr><tr><td>ZEN 成像软件</td><td>ZEISS</td><td></td><td>用于图像采集与导出</td></tr></tbody></table>

监测氧诱导视网膜病变小鼠模型中视网膜血管的动态生长

Monitoring Dynamic Growth of Retinal Vessels in Oxygen-Induced Retinopathy Mouse Model

氧诱导视网膜病变（OIR）被广泛用于研究包括早产儿视网膜病变（ROP）、增殖性糖尿病视网膜病变（PDR）和视网膜静脉阻塞（RVO）在内的缺血性视网膜疾病中的异常血管生长。大多数OIR研究仅在特定时间点观察视网膜新生血管形成；然而，活体小鼠在时间进程中的动态血管生长过程——这对于理解与OIR相关的血管疾病至关重要——仍研究不足。本文中，我们描述了一种诱导OIR小鼠模型的逐步实验方案，强调了潜在的技术难点，并提供了一种改进的方法，通过免疫荧光染色快速定量血管闭塞（VO）和新生血管（NV）区域。更重要的是，我们在OIR小鼠模型中通过荧光素眼底血管造影（FFA）对活体小鼠从P15到P25期间的血管再生过程进行了连续监测。将FFA应用于OIR小鼠模型使我们能够观察血管再生过程中的重塑变化。

在OIR小鼠模型中，最重要且最基本的结果是对无灌注区（VO）和新生血管（NV）面积的定量分析。从出生后第7天（P7）起，幼鼠在高氧环境中生活5天后，视网膜中央区域出现最大范围的无灌注区。随后在低氧刺激下持续5天，视网膜逐渐形成新生血管，其荧光强度高于周围正常血管。出生后第17天（P17）之后，随着视网膜的重塑，病理性新生血管的荧光信号迅速消退（图5A）。通过控制每窝幼鼠数量及其出生后的体重增长，OIR小鼠模型中的VO和NV面积表现出良好的重复性和稳定性，且视网膜新生血管的峰值出现在P17，与既往研究结果一致（图5B、C）。
荧光素眼底血管造影（FFA）是研究视网膜血管结构的理想工具。由于FFA可在活体（in vivo）中应用，因此能显著减少实验动物的消耗，同时可随时间动态观察视网膜血管的变化。在以往的研究中，FFA较少用于新生小鼠，且通常仅提供单一视角的图像，不利于进一步分析。在本实验方案中，通过图像处理软件将视...

本方案详细描述了小鼠视网膜平铺片的制备与免疫荧光染色及分析方法。同时详细介绍了小鼠幼崽的荧光素眼底血管造影（FFA）技术及图像处理方法。

氧诱导视网膜病变（OIR）被广泛用于研究缺血性视网膜疾病中的异常血管生长，包括早产儿视网膜病变（ROP）、...

该方案可帮助研究人员轻松分离小鼠视网膜，并观察氧诱导视网膜病变（OIR）小鼠模型中视网膜血管的动态变化。该方法的主要优势在于能够保持分离后视网膜的完整性，并使每只小鼠均可作为自身的对照，从而提高结果的可比性。研究人员首次尝试该方法时，可能在获取五张定位图像的过程中遇到困难，因为将幼鼠准确摆放到合适位置具有一定难度。为获取视网膜整体铺片所需的组织，使用弯头剪刀将已安乐死的C57-Black/6幼鼠眼球与眶内组织分离。随后，将弯头镊插入眼球后部，夹住视神经并迅速将眼球从眼眶中取出。将眼球置于预冷的PBS中，以清除表面的毛发和血液。当所有眼球收集完毕后，将清洗后的眼球转移至含有4%多聚甲醛的2毫升微量离心管中，在室温下以每分钟12至15转的速度孵育15分钟。孵育结束后，在解剖显微镜下向培养皿中央加入一滴PBS，将一个眼球放入液滴中。用镊子固定眼球，使用1毫升注射器针头在角膜缘处小心刺破角膜。将剪刀尖插入穿刺口，沿角膜缘剪开角膜，注意避免损伤视网膜。用镊子取出虹膜和晶状体，将剩余的眼杯置于4%多聚甲醛中，在摇床上室温孵育45分钟。孵育结束后，将固定好的眼杯转移至新的培养皿中央，放入一滴新鲜的PBS中。用一对镊子夹住眼杯，用另一对镊子轻轻分离视网膜和巩膜层。将剪刀尖插入视网膜与巩膜之间，沿巩膜向视神经方向剪开。将巩膜从视网膜上剥离，以获得视网膜杯。使用镊子松解放射状玻璃体血管与周边视网膜之间的连接。用剪去尖端的2毫升移液器将视网膜杯转移至48孔板中的一个孔内，在摇床上用室温PBS洗涤三次，每次5分钟。最后一次洗涤后，将视网膜杯在含1% Triton X-100和5%正常驴血清的PBS中4°C孵育过夜。为了用isolectin B4标记视网膜血管，在48孔板的一个孔中加入400微升含0.1%正常驴血清并补充了isolectin B4-594的溶液，将视网膜置于其中，在4摄氏度下于摇床上孵育过夜。如有需要，可同时加入另一种一抗。次日，在摇床上用0.1% PBST溶液清洗视网膜，每次20分钟，共清洗三次。最后一次洗涤后，在室温下用适当高亲和力的二抗孵育视网膜一小时，随后用 DAPI 标记样本 20 至 25 分钟。孵育结束后，在室温下用 0.1% PBST 溶液振荡洗涤视网膜三次，每次 30 分钟。最后一次洗涤后，将视网膜杯转移至洁净载玻片上，开口朝上，并使用显微镜从周边向中心方向，在三、六、九和十二点钟位置沿径向切割，切至距视神经头约 1 至 1.5 毫米处。用PBS清洗视网膜三次，每次使用几滴PBS，然后用吸水纸吸干并展平视网膜。在盖玻片中央滴加一滴封片剂，使液滴直径覆盖盖玻片的一半。随后迅速将盖玻片有封片剂的一面朝下覆盖在展平的视网膜上。所有视网膜铺片制备完成后，可使用共聚焦荧光显微镜对样品进行成像。进行活体成像时，加入 20 微升散瞳眼药水以实现持久的瞳孔扩张。五分钟后，将幼鼠置于成像设备前方的小型加热板上，保持体位稳定。为保持角膜湿润，在整个成像过程中需定期滴加人工泪液。接下来，在设备上点击“红外眼底成像”，将视神经乳头调整至屏幕中央。经腹腔注射 150 µL 的 0.5% 荧光素钠溶液，随后立即点击成像设备触摸面板上的 FA 和注射按钮，以启动计时器。三分钟后，当视网膜血液循环进入静脉期时，采集中央视网膜的第一张图像。将成像设备的镜头水平向鼻侧移动，直至视神经乳头位于图像采集区域一侧的中点位置，然后采集第二张图像。继续移动镜头，以相同方式依次采集颞侧、上方和下方视网膜的图像。要在合适的图像处理程序中处理视网膜图像，请打开“文件”菜单，点击“新建”以创建一个具有黑色背景的新画布。打开中央视网膜的图像，然后点击“文件”以添加第二幅图像。将第二幅图像的不透明度调整为60%，移动并调整图像大小，直到两幅图像重叠。单击“在自由变换与变形模式之间切换”，如有必要，对血管进行细微调整。然后将第二幅图像的不透明度恢复至100%。选择两幅图像，单击自动混合图层。选择“全景图”作为混合方法，同时勾选“无缝色调和颜色”以及“内容识别填充透明区域”。单击“确定”完成前两张图像的拼接。接下来，添加第三张图像，并按照演示方法将此图像与前两张图像进行拼接，直至完成单个视网膜的全部五张图像拼接。 当完成所有分析图像的处理后，使用裁剪工具将FFA图像裁剪为统一尺寸，以便于观察不同发育时间点视网膜血管动态的变化。出生后第12天的幼鼠在高氧环境中暴露五天后，其中央视网膜显示出较大的无灌注区域。随后转入低氧条件下培养五天，视网膜逐渐发生新生血管化，其荧光信号增强程度超过周围正常血管所观察到的信号。出生后第17天后，病理性新生血管迅速消退，到出生后第25天视网膜呈现完全正常的形态。通过控制仔鼠的窝仔数和出生后体重增长，可获得重复性好且稳定的氧诱导视网膜病变模型。如观察所示，血管闭塞通常在出生后第12天达到高峰，并在出生后第25天消失；而新生血管则在出生后第17天达到高峰，到出生后第25天时已消退。在出生后第15至25天的氧诱导视网膜病变小鼠中，视网膜血管直径增大，并且扭曲程度显著高于正常小鼠的视网膜血管。左手持镊子主要起辅助作用。注意不要挤压眼球，以免造成眼球变形或破裂。

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Research

科研

JoVE Journal

Biology

生物学

活体显微镜可用于动物，以观察和测量视网膜血管直径、血流速度以及总视网膜血流量。...

小鼠视网膜血流的活体视频显微测量

啮齿类动物的视网膜长期以来被视为观察大脑的一个易于接近的窗口。在本技术论文中，我们提供了一种利用小鼠氧诱导性视网膜病变模型来研究缺血性损伤后中枢神经系统内血管再生失败机制的实验方案。该系统还可用于探索促进视网膜和中枢神经系统内功能性血管再生的策略。...

利用小鼠视网膜评估中枢神经系统中的血管再生

许多威胁视力的眼部疾病与视网膜微血管功能障碍相关。因此，测量视网膜小动脉反应对于研究其潜在的病理生理机制具有重要意义。本文介绍了一种详细的小鼠视网膜小动脉分离与制备方案，用于评估血管活性物质对血管直径的影响。...

小鼠视网膜小动脉反应性测定前的准备步骤 离体

氧诱导的视网膜病变（OIR）可用于模拟缺血性视网膜疾病，如早产儿视网膜病变和增殖性糖尿病视网膜病变，并可作为评估抗血管生成药物治疗新生血管疾病的概念验证研究模型。OIR...

用于啮齿类动物缺血性视网膜疾病的氧诱导视网膜病变模型

本文介绍了一种使用玫瑰红（rose...

视网膜静脉阻塞小鼠模型的优化以减少变异性的研究

本文介绍了一种成熟且可重复的凝集素染色实验方法，适用于整体视网膜标本，以及用于定量测量在增殖性和非增殖性视网膜病变中常发生变化的血管参数所需的相关实验方案。...

非增殖性和增殖性视网膜病变小鼠全层视网膜血管参数的定量分析

本文介绍了视网膜静脉阻塞（RVO）研究中荧光素眼底血管造影（FA）和光学相干断层扫描（OCT）图像的三种数据分析方案。...

体内 小鼠视网膜血管损伤检测指标以促进可重复性

小鼠视网膜血管系统在研究血管模式形成机制方面具有重要意义。本方案通过荧光血管造影眼底图像，自动测量距视盘固定距离处的小鼠视网膜血管直径。...

从小鼠荧光血管造影图像中测量视网膜血管直径

本报告中，我们提出一种光固化牙科树脂的新应用，用于慢性实验中电极或微透析探针的基底固定。该材料可直接与颅骨粘接。...

光固化牙科粘接树脂在慢性实验中用于固定电极或微透析探针的应用

卵巢癌的原位动物模型能更好地模拟人类疾病，因此有助于加深对癌症进展及肿瘤治疗反应的理解。小鼠模型通过包膜内注射表达荧光素酶的卵巢肿瘤细胞建立。治疗通过口服灌胃给药。肿瘤生长通过生物发光成像进行监测。 体内...

体内成像与卵巢癌小鼠原位模型中的治疗处理

学习免疫荧光染色制备小鼠视网膜平铺片的方法，用于氧诱导视网膜病变模型中血管动态变化的观察。该技术保留视网膜完整性，使每只小鼠可作为自身对照，为研究视网膜疾病机制提供可靠工具。

监测氧诱导视网膜病变小鼠模型中视网膜血管的动态生长

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