Name: 在XChem设施的Diamond Light Source实现高效的片段筛选 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-05-29T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 35 s
Description: 了解XChem设施在Diamond Light Source实现高效片段筛选的完整流程，涵盖从样品制备到结构解析的X射线晶体学方法。该技术为基于片段的药物发现提供关键结构信息，帮助识别潜在结合位点并加速先导化合物开发。

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本工作是钻石光源（Diamond Light Source）与结构基因组联盟（Structural Genomics Consortium）之间的一项大规模合作成果。作者谨此感谢钻石光源的各个支持团队以及MX团队，感谢他们为i04-1光束线的自动化所做出的贡献，并感谢他们提供了高效的数据采集与自动处理流程，这些流程目前在所有MX光束线上常规运行。作者还感谢SGC PX团队在作为首批测试该系统的用户时所展现出的坚韧与耐心，同时感谢Evotec公司作为首个重要的工业用户参与其中。本工作得到了iNEXT-Discovery（资助号：871037）的支持，该项目由欧洲委员会“地平线2020”计划资助。

作者声明无利益冲突。

本文所述流程已由用户群体进行了广泛测试，且文中所描述方案的适应性对于处理该平台上通常遇到的各类项目至关重要。然而，晶体系统需满足一些先决条件。
对于使用X射线晶体学进行的任何片段筛选实验，可重复且稳定的晶体系统至关重要。由于标准XChem流程涉及将片段直接加入晶体液滴中，因此优化应侧重于含有高质量晶体的液滴数量，而非晶体总数。若单个液滴中含有多个晶体，则这些晶体在功能上是冗余的，尽管可能有助于简化晶体收获过程。此外，将结晶实验流程从本单位转移至现场设施可能具有挑战性。通常最有效的方法是采用晶体引晶技术以促进可重复的成核过程54，因此建议用户在提供蛋白质和结晶溶液的同时，一并提供引晶用的晶体储备样本。
为了确保化合物具有良好的溶解性和支持性，高浓度浸泡旨在促进弱片段的结合，片段库通常以有机溶剂提供，具体为DMSO和乙二醇。提供两种不同的溶剂可使用户在晶体完全不能耐受DMSO，或DMSO会阻碍片段在目标位点结合的情况下有替代选择。用户也可提供以水相缓冲液配制的替代片段库：只要化合物完全溶解，并且置于与液体分配机器人兼容的板中，即可良好地进行分配。
对于无法找到合适有机溶剂以同时溶解化合物库并被晶体系统耐受的项目，可采用另一种方法，即使用干燥化合物，该方法已在BESSY建立55。
在科研领域中，长期以来一直存在一个问题：能否将化合物浸泡到在高盐浓度结晶条件下生长的晶体中。实际操作中，在收获阶段常观察到化合物更易沉淀，且盐晶体快速形成；通过在收获区域周围维持湿润环境，可减轻这一现象。通常情况下，在高盐结晶条件下获得的晶体系统中进行筛选实验，其命中率与低盐条件下的结果相当。
XChem 流程的初始阶段（溶剂耐受性测试和预筛）属于小规模且快速的实验，但可为项目提供明确的继续或终止决策依据。最不利的情况是，若蛋白晶体对两种溶剂均无耐受性，或预筛的命中率极低，则必须寻找其他晶体系统。相反，若实验成功，则结果可直接指导筛选实验中所采用的浸泡条件以及最优的数据收集策略。由于数据质量（尤其是分辨率）会影响电子密度图的质量，进而影响命中化合物的识别与分析，因此目标是在不损害衍射质量的前提下，采用尽可能高的化合物浓度进行浸泡（大多数数据集（约80%）的衍射分辨率达到2.8 Å或更高）。
XChemExplorer 内的数据分析流程得到了简化，该工具依赖 PanDDA 软件来检测弱结合配体，并允许用户快速可视化和审查筛选实验的结果。XChemExplorer 从 Diamond 提供的数据处理软件包（DIALS16、autoPROC30、STARANISO31 和 Xia214）导入处理结果，各软件包的分辨率极限由其标准方法确定（即 CC1/2 = 0.3）。默认情况下，数据集的选择基于由 I/sigI、数据完整性和唯一衍射点数量计算得出的评分，但用户也可全局或针对单个样品选择特定的处理结果25。PanDDA 还会根据分辨率、Rfree 值以及参考数据与目标数据之间晶胞体积差异等标准排除部分数据（默认阈值分别为 3.5 Å、0.4 和 12%），以避免衍射质量差、中心偏离或 indexing 错误的晶体影响分析结果。
PanDDA 算法利用片段筛选过程中收集的大量数据集，检测在标准晶体学图谱中不可见的部分占有率配体。最初，PanDDA 使用溶剂耐受性测试和预筛步骤中收集的数据，构建一个平均密度图谱，进而生成一个基态模型。由于该模型将用于所有后续分析步骤，因此至关重要的是，它必须准确反映片段筛选实验条件下未结合配体的蛋白质状态。随后，PanDDA 通过统计分析识别结合的配体，并为晶体的结合态生成事件图谱。事件图谱通过从部分占有率数据集中减去晶体的未结合组分而获得，呈现的是配体以完全占有率结合时所观察到的密度。即使在传统的 2mFo-DFc 图谱中看起来清晰的片段，若未参考事件图谱，也可能被错误建模32。尽管 PanDDA 是一种强大的方法，可用于识别与平均图谱存在差异的数据集（通常表明片段结合），并且在精修过程中会提供诸如 RSCC、RSZD、B 因子比值和 RMSD 等指标以供用户参考，但最终仍由用户判断所观察到的密度是否准确描绘了预期的配体及其最合适的构象。
在完成数据分析与结构精修后，所有用户均可通过 XChemExplorer 同时向蛋白质数据库（Protein Data Bank, PDB）提交多个结构。每次片段筛选实验需进行两组数据提交。第一组提交包含所有片段结合模型，并在 MMCIF 文件中附带用于计算 PanDDA 事件图的系数。第二组提交提供相应的基态模型以及实验中所有数据集的实测结构因子：这些数据可用于重现 PanDDA 分析结果，并支持未来算法的开发。对于命中片段的结构，当片段占据率较低时，若模型为配体结合态与干扰性基态结构的复合模型，则精修结果更为稳定32；然而，目前通常仅提交结合态组分，因为完整的复合模型通常较为复杂且难以解释。因此，PDB 重新计算的部分质量指标（特别是 R 值/Rfree 值）有时会略有升高。此外，也可通过 Zenodo 等平台提供全部原始数据56，但当前 XChem 流程尚未支持此功能。
总体而言，自2016年运行以来，采用该方法已在超过95%的靶标中成功鉴定出片段配体。XChem支持的众多项目经验已被总结为晶体制备的最佳实践33，同时发展出一个采用“具备可优化性”（poised concept）理念的片段库，以促进片段的后续优化29，并推动了公开片段库组成的实践。该平台已证明了良好维护的基础设施和标准化操作流程的重要性，本文对此进行了详细阐述，并使得评估其他片段库57,58、比较不同片段库48以及指导协作性EUOpenscreen-DRIVE片段库的设计成为可能59,60。

基于片段的药物发现（Fragment-Based Drug Discovery, FBDD）是一种广泛使用的先导化合物发现策略。自25年前提出以来，该策略已成功推动四种药物进入临床应用，并有超过40种分子进入临床试验阶段1,2,3。片段是一类分子量通常不超过300 Da的小型化学实体，因其化学结构复杂性较低而被选用，可为开发具有优异理化性质且配体效率高的强效抑制剂提供良好的起点。由于片段体积较小，相较于更大、更接近药物或先导化合物的分子库，它们能更全面地探测蛋白质的结合空间，从而揭示结合热点以及潜在的变构位点。结合结构信息，片段可提供蛋白质与配体之间潜在分子相互作用的详细图谱。然而，这些片段通常与靶标蛋白的结合较弱，因此可靠地检测和验证其结合行为需要一系列稳健且灵敏的生物物理筛选方法，例如表面等离子共振（Surface Plasmon Resonance, SPR）、核磁共振（Nuclear Magnetic Resonance, NMR）或等温滴定 calorimetry（Isothermal Titration Calorimetry, ITC）4,5。
X射线晶体学是片段筛选（FBDD）工具包中的关键组成部分：其灵敏度足以识别弱结合配体，并能直接提供分子水平上相互作用的结构信息。该方法与其他生物物理筛选技术相辅相成，通常对于将片段命中化合物推进至先导化合物至关重要；其应用依赖于高质量的晶体体系，即结晶过程需具有高度可重复性，且理想情况下晶体衍射分辨率应优于2.8 Å。
从历史上看，无论是在学术界还是工业界，使用晶体学作为主要的片段筛选方法都非常困难6,7,8。相比之下，同步辐射光源在机器人技术、自动化9,10,11以及探测器技术12,13方面实现了数量级的提升，并结合数据处理中计算能力与算法的同步快速发展14,15,16，如今可在数秒内完成完整的衍射数据采集，并实现大量样品的全自动无人操作，这一技术最初由LillyCAT7开创，随后在MASSIF17,18（欧洲同步辐射装置（ESRF））得到进一步发展。这促使同步辐射设施开发出高度流程化的平台，使基于晶体的片段筛选作为主要筛选手段得以面向广泛的用户群体开放使用（Diamond光源的XChem；EMBL/ESRF的CrystalDirect19；柏林亥姆霍兹中心的BESSY20；MaxIV的FragMax21）。
本文记录了XChem平台用于X射线晶体学片段筛选的完整实验流程，涵盖从样品制备到获得三维建模命中化合物最终结构结果的全过程。该流程（图1）需要开发新的晶体识别22、浸泡23和收获24方法，以及数据管理软件25和一种用于识别片段的算法方法26，后者目前已在学术界广泛应用。晶体收获技术现已被一家厂商商业化（参见材料表），而相关工具的公开可用性也使其他同步辐射光源能够借鉴并建立类似的平台21。当前正在进行的项目包括通过Fragalysis平台开展的数据分析、模型完善和数据共享27。样品制备实验室紧邻I04-1光束线，便于将数百个冷冻样品快速转移至光束线，且I04-1的专用机时可实现快速的X射线反馈，从而指导整个筛选工作的推进。
XChem 是 Diamond 用户计划的重要组成部分，每年开放两次申请（4 月初和 10 月）。同行评审流程经与学术界和工业界药物发现领域的专家协商后不断优化。除了需要具备扎实的科学依据外，申请流程28还要求申请人不仅对晶体系统的成熟度进行自我评估，还需评估其在生物化学及正交生物物理方法方面的专业知识，以及通过后续化学手段推进筛选命中化合物的能力。为适应多学科用户群体的需求，访问模式也已逐步发展完善：
第一层级（单个项目）适用于处于探索阶段的项目，无需具备验证工具（生物物理或生化工具）及后续研究策略。若项目获得通过，将被授予较少的机时班次，足以完成概念验证。
第二层级（单个项目）适用于经过充分验证的项目，要求已具备下游工具和后续研究策略。若获批准，该项目将被分配足够的同步辐射机时，以完成完整的片段筛选实验。单个项目（第一层级或第二层级）须在分配周期的6个月内完成（分配周期为4月至9月或10月至次年3月）。
区块分配组 (Block Allocation Group, BAG) 适用于由多个研究组和项目组成的联合体，要求该联合体内具备健全的靶标筛选与优先级确定流程，并拥有明确的后续研究路径。每个 BAG 必须至少拥有一名完全接受过 XChem 培训的专家（超级用户），负责协调与 Diamond 工作人员的协作，并对 BAG 成员进行培训。分配的机时班次数量取决于 BAG 内具有科学价值的项目数量，并将根据 BAG 提交的报告在每个分配周期内重新评估。该访问权限有效期为两年。
XChem 实验分为三个阶段，每个阶段均设有决策点：溶剂耐受性测试、预筛和主筛（图2）。溶剂耐受性测试用于确定浸泡参数，即晶体系统可耐受的溶剂（如DMSO、乙二醇或其他必要冷冻保护剂）浓度及其耐受时间。溶剂浓度通常设置为5%-30%，至少考察两个时间点。收集衍射数据，并与晶体系统的本底衍射数据进行比较，以确定下一阶段的浸泡条件。在预筛阶段，使用溶剂测试中确定的条件对100-150个化合物进行浸泡，目的是确认晶体在这些条件下能否耐受化合物的存在。如有需要，可在已含有片段的液滴中随后加入冷冻保护剂。成功的标准是80%或以上的晶体能够良好存活，并产生质量良好且一致的衍射数据；若未达标，通常需通过调整浸泡时间或溶剂浓度来优化浸泡条件。预筛成功后，即可采用最终确定的参数开展实验中其余化合物的处理。
DSI-poised 化合物库（见材料表）专为利用“预激活化学”（poised chemistry）29 实现快速后续研究而设计，是本设施的核心化合物库。该库化合物以 500 mM 的浓度溶于 DMSO 中供用户使用。学术用户还可获取合作者提供的其他化合物库（总计超过 2,000 种化合物），浓度为 100–500 mM，溶剂为 DMSO（完整列表可参见网站28）。对于不能耐受 DMSO 的晶体体系，大部分化合物也提供乙二醇溶液形式。用户也可自带化合物库，但须确保其微孔板与声波液体处理系统兼容（见材料表）。
对于实验的全部三个步骤（溶剂表征、预筛选或全筛），以下样品制备流程均相同（图3）：通过成像并利用 TeXRank22 对结晶液滴进行靶向定位，以选择化合物加样位置；使用声波液体分配系统向液滴中分配溶剂和化合物23；利用 Crystal shifter 高效收集晶体24；以及将样品信息上传至光束线数据库（ISPyB）。当前用于实验设计与执行的界面是一个基于 Excel 的应用程序（SoakDB），该程序可为平台上的各种设备生成必要的输入文件，并在 SQLite 数据库中跟踪和记录所有结果。在整个流程的多个阶段均使用条形码扫描仪协助样品追踪，相关数据亦被添加至数据库中。
使用I04-1线站的专用机时，以无人值守模式收集衍射数据。提供两种中心定位模式，即光学定位和基于X射线的定位17。对于针状和棒状晶体，建议采用X射线定位；而对于较粗大的晶体，通常可使用光学模式，该模式速度更快，因此可在规定的机时内收集更多样品。根据晶体的分辨率（进入平台前已确定），数据收集的总曝光时间可选择60秒或15秒。溶剂测试阶段的数据收集通常可为I04-1线站的最佳参数组合提供依据。
大量数据分析通过XChemExplorer（XCE）25进行管理，也可使用XCE启动基于PanDDA26的命中识别步骤。XCE是一种数据管理和工作流程工具，支持对蛋白质-配体结构进行大规模分析（图4）；它可读取在Diamond Light Source收集数据后产生的各种自动处理结果（包括DIALS16、Xia214、AutoPROC30和STARANISO31），并根据数据质量及与参考模型的相似性自动选择其中一种结果。该参考模型必须能代表用于XChem筛选的晶体体系，并且必须包含仅用溶剂浸泡晶体时可见的所有水分子或其他溶剂分子，以及所有辅因子、配体和替代构象。参考模型的质量将直接影响后续模型构建和精修阶段所需的工作量。PanDDA用于分析所有数据并识别结合位点。它将各结构与参考结构对齐，计算统计图谱，识别事件，并生成事件图谱26,32。在PanDDA的分析范式中，无需也不建议构建完整的晶体学模型；需要建模的仅是片段结合处的蛋白局部结构（即结合态模型），因此只需根据事件图谱专注于构建配体及其周围的残基和溶剂分子即可32。

<table><tbody><tr><td>DSI-预激活文库</td><td>Enamine</td><td>DSI-896</td><td>片段文库</td></tr><tr><td>Echo 550 和 650 系列</td><td>Beckman-Coulter</td><td></td><td>声波移液系统</td></tr><tr><td>Echo 微孔板</td><td>Beckman-Coulter</td><td>001-12380; 001-8768; 001-6025</td><td>1536 孔和 384 孔微孔板</td></tr><tr><td>Shifter</td><td>Oxford Lab Technology</td><td></td><td>收获装置</td></tr><tr><td>带摆动转子的微孔板离心机</td><td>Sigma</td><td>型号 11121</td><td>微孔板离心机</td></tr><tr><td>3-drops 结晶板</td><td>Swissci</td><td>3W96T-UVP</td><td>结晶板</td></tr><tr><td>Formulatrix 微孔板成像仪及 Rockmaker 软件</td><td>Formulatrix</td><td></td><td>结晶板成像设备</td></tr></tbody></table>

在钻石光源xchem设施实现高效的片段筛选

Achieving Efficient Fragment Screening at XChem Facility at Diamond Light Source

在基于片段的药物发现中，会针对目标蛋白筛选数百个甚至数千个小分子化合物（通常小于约300 Da），以鉴定出可进一步开发为高效候选药物的化学实体。由于这些化合物分子量较小，与蛋白的相互作用较弱，因此筛选方法必须具有高度灵敏性；此外，获得结构信息对于将这些初筛命中物优化为具有先导化合物特征的分子通常至关重要。因此，蛋白质晶体学一直是金标准技术，但历史上由于技术难度较高，难以作为初筛手段被广泛采用。
XChem 的初步实验于 2014 年完成演示，随后与学术界和工业界合作者共同开展试验，以验证该流程的可行性。此后，通过大量的研究工作和大量的同步辐射机时，优化了样品制备流程，建立了具备快速后续研究潜力的片段分子库，实现了 I04-1 光束线的自动化并提升了其无人值守数据采集能力，同时开发了用于数据管理、数据分析和苗头化合物识别的新工具。
XChem 现已成为一个用于大规模晶体学片段筛选的设施，支持从晶体到结构提交的完整流程，并向全球的学术界和工业界用户开放。自2016年以来，经过同行评审的学术用户计划已积极发展，旨在容纳尽可能广泛的科研项目，包括经过充分验证的项目以及探索性项目。学术访问权限通过每半年一次的同行评审提案征集进行分配，而企业专属项目则由Diamond同步辐射光源的工业联络组负责安排。该工作流程已常规应用于来自多种治疗领域的百余个靶点，能够有效识别弱结合配体（命中率为1%–30%），这些配体不仅可作为化合物设计的高质量起点，还能提供关于结合位点的大量结构信息。在新冠疫情期间，该流程展现出强大的适应能力，持续开展了针对SARS-CoV-2靶点的筛选工作，其中包括主蛋白酶在3周内完成的快速筛选周期。

通过X射线晶体学进行片段筛选的XChem流程已得到显著优化，推动了其在科学界的应用（图5）。该流程已在超过150个筛选项目中得到验证，命中率介于1%至30%之间47,48,49,50,51,52，并获得了众多重复使用者的认可。在流程早期即排除不适合的晶体系统（分辨率低、结晶或衍射质量不稳定）或无法耐受DMSO或乙二醇的晶体系统，从而节省时间、人力和资源。成功的筛选项目可提供靶标蛋白上潜在相互作用位点的三维图谱；一个典型的例子是SARS-CoV-2主要蛋白酶的XChem筛选结果（图6）。通常，片段命中位点出现在以下位置：(a) 已知的功能位点，如酶的活性位点和亚口袋48；(b) 潜在的别构位点，例如蛋白质-蛋白质相互作用区域53；(c) 晶体堆积界面，通常被视为假阳性（图6）。此类结构数据通常为将片段命中化合物合并、连接或扩展为类先导小分子提供了基础1,3。
<img alt="药物发现工作流程：晶体成像、化合物分配、数据收集、苗头化合物鉴定。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62414/62414fig01.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图1"> 
图1：XChem 管道流程。 该平台以示意图形式展示了从项目提案到样品制备、数据收集及苗头化合物鉴定的全过程。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62414/62414fig01large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>
<img alt="晶体学筛选流程图，包含衍射测试结果和结构模型。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62414/62414fig02.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图 2"> 
图 2：筛选策略。 该工作流程标明了每个关键节点的目的、实验要求以及决策点。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62414/62414fig02large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="晶体学工作流程：晶体成像、液滴定位、化合物分配、样品分析。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62414/62414fig03.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图 3"> 
图 3：样品制备工作流程。 样品制备的关键步骤如图所示，每个步骤的信息均被记录在 SQLite 数据库中。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62414/62414fig03large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="晶体学流程图：批量分子置换、PanDDA 分析、苗头化合物鉴定。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62414/62414fig04.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图 4"> 
图 4：使用 XCE 进行数据分析。 数据分析中的关键步骤通过工作流程图表示，并标注了相关软件包。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62414/62414fig04large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="柱状图显示了2015年至2020年的样本数量和研究提案，突出了趋势。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62414/62414fig05.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Figure 5"> 
图5：XChem用户计划的发展历程：该图表展示了用户计划从2015年到2019年的增长与巩固过程，包括2019年BAGs的建立，以及平台在2020年COVID-19大流行期间展现出的韧性。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62414/62414fig05large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>
<img alt="蛋白质结构示意图，突出显示分子相互作用、酶结合位点和生物分子分析。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62414/62414fig06.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图6"> 
图6：XChem片段筛选的代表性结果。 SARS-CoV-2主蛋白酶（Mpro）二聚体以表面形式展示，其中活性位点命中化合物显示为黄色，潜在的别构位点命中化合物显示为洋红色，表面或晶体堆积伪影显示为绿色。该图使用Chimera软件及来自G_1002156组沉积的Mpro PDB条目生成。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62414/62414fig06large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>

本文介绍了基于晶体的片段筛选的完整XChem流程，从申请使用权限开始，到后续所有步骤直至数据发布。

在钻石光源XChem设施实现高效的片段筛选

在基于片段的药物发现中，会针对目标蛋白筛选数百个甚至数千个小于约300 Da的化合物，以鉴定出...

位于 Diamond Light Source 的 XChem 设施提供常规的、大规模晶体学片段筛选服务，支持从晶体到数据提交的整个流程。X 射线晶体学是基于片段的药物发现（FBDD）工具包中的关键组成部分。该技术具有足够的灵敏度，可识别弱结合配体，并直接提供分子水平上相互作用的结构信息。基于片段的药物发现是先导化合物发现中广泛使用的一种策略。该方法已有六种药物获批用于临床，并有超过50种分子进入临床试验。XChem平台在效率和进步方面相较于传统浸泡方法、数据收集和分析方法的优势，通过可视化方式展现最为明显。首先选择晶体和化合物的位置。在电脑上打开 TextRank，然后从右下角的列表中或通过在左上角的框中输入条形码来选择晶体板。选择正确的图像格式和单孔视图。在寻找实验所需合适晶体的过程中，当浏览液滴图像时，若需向液滴中添加溶剂或化合物且避免触碰晶体，应在液滴内远离晶体的位置单击鼠标右键。打开 Echo 软件，选择“新建”以使用声波移液器分配溶液。选择正确的源孔板和液体类型。确保选择正确的板类型作为目标板。然后勾选自定义选项并继续。选择导入，并选取相应的批处理文件。然后按照软件提示完成导入步骤。使用板图检查待分配的溶液及其目标位置。随后根据弹出的提示运行程序。将源板中的溶液加入选定的结晶液滴中。将该板放入培养箱中孵育所需时间。使用半自动晶体收获装置收获晶体时，按下启动工作流程按钮，移至第一个选定的孔位。如果晶体仍然完好，将其装入环中并迅速浸入液氮，放置于列表中第一个样品托的位置一。从界面中选择该晶体的适当描述。如果液滴为化合物浸泡样品，需记录该化合物的状态描述。如果晶体成功装样，请选择“mounted”；否则，选择“fail”。晶体收获完成后，将载样托盘送至条形码扫描仪，依次放入支架中，逐个扫描托盘和载样针的条形码。扫描完成后，为托盘盖上盖子，并将其存放在液氮储存杜瓦瓶中。为了重新收集偏心的样品，请查看 ISPyB 中的样品更换器视图，并按自动处理分辨率（AP 分辨率）排序，以从绿色到红色的颜色梯度对样品进行分级。单击样品，检查是否存在红色或黄色的样品。然后检查晶体快照，确认晶体是否已被居中定位。要通过 XChem Explorer 或 XCE 获取并分析 Diamond 的自动处理结果，请在终端中进入 processing 子文件夹，并使用别名 XCE 打开 XChem Explorer。在“概览”选项卡中，选择“从数据源更新表格”按钮，以刷新实验数据的摘要。在“设置”选项卡下，选择数据采集目录，然后打开“数据集”选项卡。从“选择目标”下拉菜单中选择目标，然后从数据集下拉菜单中选择“从自动处理获取新结果”，并点击运行。若要使用 Dimple 计算初始电子密度图，请打开“电子密度图”标签页，从下拉菜单中选择参考模型，选择所需的数据集，然后对选定的 MTZ 文件运行 Dimple。若要生成配体限制文件，请选择所需的数据集，然后从“电子密度图与限制文件”下拉菜单中选择为选定化合物创建 SCF、PDB 或 PNG 文件。为了使用Panda识别命中结果，请选择Pandas选项卡，确保输出目录已正确定义，然后从命中识别下拉菜单中运行panda.analyze。要分析Panda识别出的命中结果，请运行panda.analyze。从“命中识别”下拉菜单中进行检查。使用Panda控制面板打开Coot。加载Dimple生成的平均密度图和2mFo-DFc图，以便与事件图和模型进行比较。一旦完成配体拟合，在切换到其他事件之前，请单击“将配体与模型合并”并保存模型，以避免丢失对结合态模型所做的任何更改。使用事件注释字段对结合事件进行标注，并使用记录位点信息功能标注结合位点。当所有可行的配体均根据事件图完成建模、合并和保存后，关闭 panda.inspect。将Panda检测模型导出回项目目录，并对选定的数据集启动初步的精修，此时精修结果将在精修选项卡中可见。用于X射线晶体学片段筛选的XChem分析流程已得到极大优化，推动了其在科学界的应用。该图表展示了从2015年至2019年用户计划的使用情况与整合进展，包括2019年区块分配组的建立，以及平台在2020年COVID-19大流行期间展现出的稳定性。成功的筛选可获得靶蛋白上潜在相互作用位点的三维图谱。一个典型结果是 SARS-CoV-2 主蛋白酶的 XChem 筛选，其中酶的活性位点和亚口袋等已知关注位点以黄色显示。假定的变构位点（例如参与蛋白质-蛋白质相互作用的位点）以洋红色显示，通常被视为假阳性的晶体堆积界面以绿色显示。历史上，将晶体学作为主要的片段筛选方法一直存在困难。本研究记录了从样品制备到最终结构解析的 XChem 管道全流程方案。晶体学片段筛选补充了其他生物物理技术，通常对于将片段命中化合物推进至先导化合物至关重要。该方法可应用于任何药物发现靶点类别。

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用于VMXm光束线微晶样品制备的工作流程

本文介绍了一种用于在 Diamond Light Source 的 I23 光束线上进行长波长大分子 X...

样品制备与转移方案：在 Diamond Light Source 同步辐射光源 I23 光束线上进行真空内长波长晶体学实验

监测目标蛋白熔解温度的变化即热移位分析（thermal shift assay, TSA）是一种用于筛选包含数百种化合物的片段库的高效方法。本文介绍了一种采用机器人辅助纳米微分扫描荧光法（nano-DSF）的TSA实验方案，通过监测内在色氨酸荧光和光背向散射进行片段筛选。...

基于片段的先导化合物发现中用于筛选的纳米差示扫描荧光法

本文介绍了如何在欧洲分子生物学实验室格勒诺布尔分站（EMBL...

格勒诺布尔 EMBL HTX 设施中的自动化晶体学流程

我们介绍一种利用哈韦尔研究复合体（Research Complex at Harwell）中的结晶设施进行蛋白质结晶的实验方案，以及后续的 原位 在钻石光源同步辐射装置的多功能大分子晶体学线站对晶体板中的晶体进行X射线晶体学数据收集 原位 (VMXi)...

结晶与 原位 使用哈威尔结晶设施和钻石光源 VMXi 光束线在室温下收集数据

了解XChem设施在Diamond Light Source实现高效片段筛选的完整流程，涵盖从样品制备到结构解析的X射线晶体学方法。该技术为基于片段的药物发现提供关键结构信息，帮助识别潜在结合位点并加速先导化合物开发。

在钻石光源XChem设施实现高效的片段筛选

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