Name: 单颗粒冷冻电子显微镜:从样品到结构 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-05-29T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 52 s
Description: 学习单颗粒冷冻电子显微镜技术，掌握从样品制备到数据采集的完整流程，了解远程网格筛选和结构生物学研究方法。该技术适用于膜蛋白、病毒等大分子复合物的高分辨率结构解析。

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本工作由欧洲委员会“地平线2020”计划资助的 iNEXT-Discovery（资助号 871037）支持。J B. R. White 由惠康信托基金（215064/Z/18/Z）资助。FEI Titan Krios 电子显微镜由利兹大学（UoL ABSL 奖项）和惠康信托基金（108466/Z/15/Z）资助。我们感谢 M Iadanza 提供其显微图像分析脚本的使用。我们感谢钻石光源中心（Diamond Light Source）提供位于英国国家电子生物成像中心（eBIC）的冷冻电镜设施的使用权限与支持，该设施由惠康信托基金、医学研究理事会（MRC）和生物技术和生物科学研究理事会（BBRSC）资助。

未报告任何利益冲突。

在本方案中，我们描述了一种适用于可进行常规单颗粒分析（SPA）样品的基本流程。尽管这种使用滤纸 blotting 制备薄层并实现玻璃态冷冻的方法在迄今为止绝大多数 SPA 项目中已被证实是成功的，但它仍存在若干缺点。这些问题包括样品浪费、形成薄层和冷冻样品所需时间较长（数秒级）、文献报道的不可重复性27，以及使用滤纸去除多余液体可能带来的负面影响50。近年来，已开发出新技术以提高薄层制备的可重复性51, 52。此外，其他技术的发展也缩短了样品施加至玻璃态冷冻之间的时间间隔53,54,55。尽管在撰写本文时，基于滤纸的薄层制备方法仍是 SPA 冷冻电镜样品制备中最普遍使用的技术，但这些新兴技术可能在网格玻璃化效率与可重复性方面带来多种优势，同时为引入新的实验维度创造机会，例如时间分辨能力以及在玻璃化前实现快速混合。
目前，大多数用户进行载网筛选的过程是一种定性方法，通常先获取低倍率的图谱，然后在载网上采集高倍率图像以评估颗粒分布情况。尽管这种方法对某些类型的样品已足够可靠，但仅凭肉眼判断样品是否符合研究人员预期（例如是否存在优势取向）仍可能存在困难，特别是对于较小的样品（&#60;200 kDa）或低分辨率形貌难以辨识是否存在多种颗粒分布的情况。对于某些项目而言，仅凭观察甚至无法确定样品是否符合目标，例如配体是否结合，或样品筛选旨在确认一个小的（如10 kDa）亚基是否仍与复合物结合。针对此类项目，若能结合“短时”0.5–1小时的数据采集，并通过全自动化的数据分析流程，快速完成图像处理、2D分类甚至3D分类与优化，将有助于高效判断是否值得进行更长时间的数据采集。目前这类自动化流程仍在开发中，尚未广泛实施，但其在提升冷冻电镜载网筛选效率方面具有巨大潜力，尤其适用于具有挑战性的样品。
直接电子探测器的改进，以及显微镜技术的优化与图像处理技术的进步（如图像偏移数据采集）相结合，显著提高了数据采集过程中所获得图像的通量和质量。数据采集速率的提升凸显了在获取大量TB级数据之前，对冷冻电镜载网进行彻底筛选的必要性。
冷冻电镜单颗粒分析（CryoEM SPA）已成为真正主流的结构生物学技术，在许多情况下更是某些类型样品（如异质性和不稳定的大型分子复合物）的首选方法。尽管本方案仅概述了SPA的基本流程，但其中涉及的每个环节（载网玻璃化与筛选、冷冻电镜成像及图像处理）本身都是值得深入研究的独立课题，应在开展SPA项目时予以充分探索。随着样品制备和显微成像技术的进步，以及新的图像处理算法和方法的不断涌现，SPA流程将持续发展，助力研究人员深入理解复杂的生物系统。

单颗粒冷冻电镜 
要从分子层面理解生命，我们必须了解其结构。目前已有多种技术可用于研究蛋白质结构，例如核磁共振（NMR）、X射线晶体学、质谱分析以及电子显微镜（EM）。迄今为止，大多数提交至蛋白质数据库（PDB）的结构是通过X射线晶体学解析的。然而，自2012年左右起，冷冻电子显微镜（cryoEM）逐渐成为蛋白质结构测定的主流技术，其应用迅速增长。截至2020年12月，提交至电子显微镜数据库（EMDB）的EM图谱总数为13,421份，而2012年仅为1,566份（图1，www.ebi.co.uk）。2012年，基于cryoEM密度图建模并提交至PDB的原子坐标结构仅有67个，而截至2020年12月，已提交的结构达到2,309个，增长了35倍。这种在cryoEM密度图质量和数量上的显著提升，有时被称为“分辨率革命”1，其背后原因是多个领域技术进步的共同推动：包括用于成像的新型相机——直接电子探测器的开发、新软件的出现，以及更稳定的&#160;显微镜2,3,4。
<img alt="图1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62415/62415fig01.jpg" /> 
图1：2012年至2020年12月期间向EMDB提交的数据累计数量。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62415/62415fig01large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>
单颗粒分析（SPA）是一种强大的工具，可通过解析分离复合物的高分辨率结构，为多种类型的样本提供生物学见解5, 6，包括病毒7,8、膜蛋白9, 10、螺旋组装体11以及其他动态且异质的大分子复合物12, 13，其大小跨越多个数量级（从39 kDa14, 15到数兆道尔顿）。本文描述了一种从样本制备到结构解析的冷冻电镜单颗粒分析标准流程方案。
在启动该流程之前，应对纯化后的样品进行生化分析，以评估其在后续步骤中取得成功的可能性。制备合适的样品可以说是进行单颗粒冷冻电镜（SPA）最大的障碍，特别是对于瞬时存在且具有异质性（包括组成和构象上的异质性）的复合物而言。大分子复合物样品应尽可能不含污染物，浓度需足够高，以确保每张冷冻电镜图像中能获得大量颗粒，并且缓冲液成分应适合冷冻电镜分析。某些缓冲液成分，包括蔗糖、甘油以及高浓度（约 > 350 mM，具体取决于样品大小、性质及其他缓冲液成分）的盐类，可能干扰玻璃化过程或降低图像的信噪比，从而阻碍结构解析16。
通常，至少应使用尺寸排阻色谱（SEC）和SDS-PAGE凝胶分析来评估样品纯度17, 18，但在进行冷冻电镜（cryoEM）分析之前，圆二色光谱、功能测定、尺寸排阻色谱联用多角度光散射（SEC-MALS）以及热稳定性测定等方法也均为大分子复合物样品定性分析的有用工具。然而，这些生化分析的结果可能难以揭示样品在结构上的异质性及其在冷冻电镜载网上行为的表现。因此，负染电镜被常规用作一种快速、经济且强大的工具，用于评估样品的组成和构象异质性，从而有助于确定纯化过程中哪个洗脱组分最具前景，或用于筛选不同的缓冲液组成19, 20。一旦确定了有前景的样品，即可进入单颗粒冷冻电镜（SPA cryoEM）流程。需要注意的是，负染结果并不总是与后续冷冻电镜观察结果一致；有时样品在负染中表现不佳，但在冷冻电镜的玻璃态冰层中却有所改善。相反，有时样品在负染过程中表现极佳，但在进入冷冻电镜阶段时仍需进行大量进一步优化。然而，在大多数情况下，负染仍是一个有效的质量控制步骤。
玻璃化冷冻 
电子显微镜真空系统内的严苛环境会导致未固定的生物样品发生脱水和辐射损伤21。因此，为了以接近天然的状态对样品进行成像，必须在成像前对生物样品进行保存。对于纯化的生物大分子复合物样品，玻璃化冷冻是首选的制备方法，可在利用冷冻电镜（cryoEM）观察其结构的同时，保留复合物的原子级细节。玻璃化冷冻作为样品制备方法的发现，是生物样品电子显微技术的一项根本性进步，杜博歇（Dubochet）因此荣获2017年诺贝尔化学奖。样品的玻璃化冷冻过程包括在冷冻电镜载网支撑膜上形成一层极薄的溶液层，其厚度通常仅为数十纳米，并将目标样品悬浮于其中。随后，该薄层在约-175 °C的液态乙烷等冷冻剂中被极速冷冻。冷冻速率可达约106 °C/s，足够快以形成非晶态（即玻璃态）冰，从而将样品包埋于一层薄而固态的冰膜之中22。
首先需要考虑的变量是所选择的冷冻电镜载网支撑膜23。电镜载网通常由带有穿孔（规则或不规则）的无定形碳膜构成，并附着于支撑结构之上。该支撑结构通常为直径3.05 mm的圆形金属载网，多由铜制成，但也可使用其他金属，如金或钼（后者具有理想的热膨胀性能24）。有时会在载网上额外覆盖一层薄而连续的支撑材料，例如石墨烯、氧化石墨烯或一层较薄（约1–2 nm）的无定形碳膜。尽管迄今为止报道的绝大多数结构均使用标准冷冻电镜载网（最常见的是400–200目铜网，带有穿孔碳膜（如1.2 µm圆形孔洞，间隔1.3 µm（r1.2/1.3），或2 µm孔洞间隔2 µm碳区（r2/2）），且存在多种不同图案），但已有研究报道了具有更高导电性并能减少样品漂移的新型载网技术25。所选载网需经过辉光放电/等离子清洗处理，以使其表面亲水，便于样品加载26。
辉光放电处理后，下一步是形成薄冰膜。最常用的方法是使用滤纸从载网上去除多余的液体以形成该薄冰膜。虽然此步骤可手动操作，但目前已有多种商用冷冻投入仪可供选择，包括Vitrobot Mk IV（Thermo Fisher Scientific）、EM GP II（Leica）和CP3（Gatan）。使用这些设备时，将约3–5 µL溶液样品滴加到电镜载网上，随后用滤纸吸去多余液体。载网表面形成一层薄冰膜后，迅速浸入由液氮（LN2）冷却至约-175 °C的液态乙烷中进行冷冻。冷冻完成后，载网需始终保持在玻璃化转变温度以下（-137 °C），直至成像前及成像过程中均不得升温。
样品筛选与数据采集 
在冷冻电镜载网玻璃化后，下一步是对载网进行筛选，以评估其质量，并确定该载网是否适合进行高分辨率数据采集。理想的冷冻电镜载网应具有非晶态冰（而非结晶冰），冰层厚度应刚好足以容纳样品最长维度，从而确保周围冰层对最终图像的噪声贡献尽可能小。冰层中的颗粒应具有与生物化学性质一致的大小和（若已知）形状，理想情况下应为单一分散状态，并且颗粒取向呈随机分布。最后，载网上应存在足够多的高质量区域，以满足预期的数据采集时长需求。根据样品的不同，可能需要经过多次反复的玻璃化和筛选，才能获得最佳载网。幸运而又不幸的是，存在大量可经验性测试的变量，可用于改变冷冻电镜载网上颗粒的分布情况（详见文献16,27综述）。本文中展示了一个膜蛋白项目10的代表性结果。
一旦确定了合适的载网，即可开始数据采集。目前有多种用于生物样品的冷冻透射电子显微镜型号，均已优化为可自动采集高分辨率数据。通常在300 kV或200 kV系统上进行数据采集。可使用包括EPU（Thermo Fisher Scientific）28、Leginon29、JADAS30&#160;和SerialEM31, 32在内的软件实现自动化数据采集。借助现代探测器进行自动化数据采集，通常在24小时内可产生数太字节（TB）的原始数据（平均数据集大小约为4 TB）。
由于全球大部分地区（撰写本文时为2020年12月）实施了与COVID-19相关的限制措施，许多显微镜平台已转向提供远程访问服务。一旦载网被装入显微镜的自动进样器，即可进行远程数据采集。
图像处理与模型构建 
数据采集过程通常持续0.5至4天，而后续的图像处理则可能耗时数周甚至数月，具体取决于计算资源的可用性。初始图像处理步骤（即运动校正和对比度传递函数（CTF）估计）通常采用实时处理方式完成。 33, 34对于后续处理，有大量可用的软件套件。颗粒从显微照片中被“挑选”并提取出来35, 36提取颗粒后，通常需对颗粒进行多轮分类（包括二维（2D）和三维（3D）分类，和/或针对特定感兴趣区域的聚焦分类），以获得一组均一的颗粒子集。该均一颗粒子集随后被平均合并，以生成三维重构图。在此之后，数据通常会进一步校正，以获得尽可能高质量的重构图，例如通过CTF精修和畸变校正等方法。37&#160;和贝叶斯优化38&#160;该图像处理的结果是获得目标生物样本的三维冷冻电镜图谱。在300 kV显微镜系统上，使用质量足够的载网进行“标准”自动化单颗粒实验，通常可达到的分辨率为10 &#197; 和 2 &#197; 取决于蛋白质复合物的大小和柔性。在理想样品中，分辨率可达约 1.2 &#197; 现已通过 SPA 工作流程达到5尽管本方案详细描述了获得电镜密度图的步骤，但一旦获得该密度图，便可进一步通过拟合并精修蛋白质模型来解析其结构（如果分辨率足够高） &#60; 3.5 &#197;）或建筑物 从头合成39与结构测定实验相关的数据可存入在线公共数据库，包括电子显微镜密度图（Electron Microscopy Data Bank）40，所得原子坐标（Protein Data Bank）41&#160;以及原始数据集（电子显微镜公共图像档案）42.
在本实验方案中，以牙龈卟啉单胞菌（Porphyromonas gingivalis）的外膜蛋白复合物RagAB（约340 kDa）作为大分子复合物的示例10（EMPIAR-10543）。对于初次接触冷冻电镜（cryoEM）的研究人员，可通过iNEXT Discovery和Instruct等资助获取计划，在经过同行评审的前提下，获得从样品制备到结构解析全过程的技术支持。

<table><tbody><tr><td>钝头镊子</td><td>Agar Scientific</td><td>AGT5022</td><td></td></tr><tr><td>冷冻电镜圆形储存盒</td><td>Agar Scientific</td><td>AGG3736</td><td></td></tr><tr><td>冷冻电镜自动网格盒</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>1084591</td><td></td></tr><tr><td>冷冻电镜载网</td><td>Quantifoil</td><td>N1-C14nCu30-01</td><td></td></tr><tr><td>乙烷气体</td><td>Boc</td><td>270595-F</td><td></td></tr><tr><td>液氮&amp;nbsp;泡沫杜瓦瓶</td><td>Agar Scientific</td><td>AG81760-500</td><td></td></tr><tr><td>液氮&amp;nbsp;储存杜瓦瓶</td><td>Worthington industries</td><td>HC 34</td><td></td></tr><tr><td>移液器</td><td>Gilson</td><td>10082012</td><td></td></tr><tr><td>移液器吸头</td><td>Star labs</td><td>s1111-1706</td><td></td></tr><tr><td>注射器</td><td>BD</td><td>BD 300869</td><td></td></tr><tr><td>II型实验室用水</td><td>Suez</td><td>select fusion</td><td></td></tr><tr><td>Vitrobot</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>1086439</td><td></td></tr><tr><td>Vitrobot滤纸</td><td>Whatman</td><td>1001-055</td><td></td></tr><tr><td>Vitrobot泡沫塑料容器组件</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>1086439</td><td></td></tr><tr><td>Vitrobot镊子</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>72882-D</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;软件&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>EPU</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>2.8.1.10REL</td><td></td></tr><tr><td>TEM服务器</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>6.15.3.22415REL</td><td></td></tr><tr><td>Tia</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>5.0.0.2896REL</td><td></td></tr><tr><td>Titan Krios显微镜</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>Titan Krios G2</td><td></td></tr></tbody></table>

单颗粒冷冻电子显微镜：从样品到结构

Single Particle Cryo-Electron Microscopy: From Sample to Structure

冷冻电子显微镜（cryoEM）是一种通过单颗粒分析（SPA）测定大分子复合物结构的强有力技术。整个流程包括：i）将样品在冷冻电镜载网上支撑的薄冰层中进行玻璃化；ii）对样品进行筛选，以评估颗粒分布和冰层质量；iii）若载网符合要求，则采集用于分析的单颗粒数据集；以及 iv）图像处理以获得电镜密度图。本方案概述了上述每一步骤，重点介绍用户在工作流程中可调整的变量以及常见问题的排查方法。随着远程操控显微镜在许多机构中成为常规操作，本文还将介绍成像方案的若干改进措施，以帮助用户在无法直接接触显微镜的情况下高效地完成操作与成像。

在筛选过程中，可在图谱阶段丢弃不合适的载网，因为在低倍率下已能分辨出不适合进行数据采集的特征。例如，载网出现明显的机械损伤，大部分网格方格破裂（图2A），或载网呈现“干燥”状态，缺乏玻璃态冰（图2B）。此类载网通常可通过观察识别：网格方格的边缘显得锐利且清晰。在大多数使用冷冻 plunge 装置制备的载网中，均可观察到冰层厚度的梯度变化（图2C、D）。颗粒分布情况会因目标样本的不同而随冰层厚度发生显著变化，因此建议筛选多个网格方格以评估颗粒分布。EPU 软件在图谱筛选步骤中已提供工具，帮助用户识别冰层厚度相似或不同的网格方格，这对初次检查冷冻电镜载网的用户尤为有帮助（图2E、F）。
<img alt="图2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62415/62415fig02.jpg" /> 
图2：筛选实验中的低倍镜“图谱”拼接示例。A一个遭受严重损坏的网格，大多数网格方格已断裂——不适合用于样本收集。 B无玻璃态冰的干燥载网——不适合用于数据收集。 C显示冰梯度的网格，其中约 50% 的网格区域可用。 D) 具有约 33% 可用网格面积的冰梯度。两者 C 和 D，如果可用的网格区域具有适合采集的冰层厚度，并且有足够的采集区域以满足最短采集时间（例如 24 小时）的要求，则适合进行数据采集。 E) 一个包含不同冰层厚度范围的图谱示例。F) 与 E 相同的图谱，但由 EPU 软件根据冰层厚度对网格方格进行分类并着色。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62415/62415fig02large.jpg" target="_blank">请点击此处以查看此图的放大版本。</a>
在筛选颗粒分布时，应确保成像参数（如放大倍数和总电子剂量）与数据采集过程中预期使用的参数相似，以准确反映预期结果。在筛选过程中，理想的颗粒分布应为单一分散状态，并可见多种颗粒取向（根据样本特性及对颗粒形态的已有认知，这一点可能较难判断）（图3A）。冰层厚度应尽可能薄，但需足以容纳颗粒的最大尺寸；若冰层过薄，在电子束照射下可能发生熔化，导致显微图像中出现过度漂移，应避免使用具有此类特征的区域（图3B）。根据综合经验，当缓冲液中含有去污剂时，最常观察到此类现象。这可能导致孔洞中心区域的冰层极薄&#160;，从而使颗粒被物理性排斥并推向边缘。该现象如图3C所示，但在本例中并不严重，这些图像仍可有效用于数据集的构建。最后，冰层必须呈玻璃态；在数据收集中应排除任何载网（或多个载网）上大多数或全部图像显示为晶态冰的区域（图3D）。通常，非玻璃态冰多出现在载网方格的边缘。读者可进一步参考有关载网玻璃化过程中可调节变量的详细综述16，以及颗粒在薄膜环境中行为特征的相关描述46, 47&#160;以获取更多信息。
<img alt="图3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62415/62415fig03.jpg" /> 
图3：显示不同颗粒分布的代表性显微照片。A) 单分散颗粒的理想分布，呈现多种取向。B) 孔洞中央冰层过薄，在电子束照射下发生形变，导致显微照片中出现过度运动。当缓冲液中含有去垢剂时，此现象最为常见。C) 当孔洞中心冰层较薄时，会因物理排斥使颗粒无法进入中心区域，导致颗粒向孔边缘聚集。此种情况虽未严重到使图像无法使用，但提示应尝试筛选稍厚一些的区域。D) 冰层非玻璃态，不应在此类显微照片所示区域收集数据。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62415/62415fig03large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
实时图像处理有助于及时发现数据采集过程中的错误和问题，因此在条件允许的情况下始终建议使用。例如，显微照片中出现过度运动可能表明自动进样器的涡轮泵处于工作状态，或正在采集的数据来自存在裂纹的网格区域，其中冰层在电子束照射下发生显著移动，提示应跳过该网格区域。实时CTF估计可识别出施加了正焦距（而非离焦）的情况（此时使用CTF估计程序及相关参数来寻找此类焦点），并可确定使用Volta相位板时的相位偏移量48&#160;用于实时图像处理的流程通常包含数据的图形化摘要图4A以便用户能够快速评估显微照片质量，并判断是否需要调整数据采集参数。
从显微照片中选择颗粒时，需避免将污染或载网支持膜等“假阳性”特征误选为颗粒，该过程可能需要优化。然而，诸如 crYOLO 等颗粒挑选工具通常使用默认参数即可对数据进行有效的初步筛选（图 4B），从而推进至二维分类平均步骤，在此步骤中可更易于评估数据质量以及后续分析成功的可能性。对于大多数项目，对约 >10,000 个颗粒进行二维分类后，应开始出现显示二级结构细节的分类结果。若要推进至三维重构，二维分类阶段通常应揭示出代表颗粒多种取向的类别。若发现颗粒存在优势取向，则可能需要进行更多轮次的样品制备16，或在样品倾斜状态下进一步采集数据49。所有显示二级结构细节的分类均应被选中用于后续三维分析，而“垃圾”颗粒则予以剔除（图 4C）。
<img alt="图4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62415/62415fig04.jpg" /> 
图4：初始图像处理步骤。A) “实时”图像处理脚本的输出结果。B) 示例显微照片（左侧），其中使用 crYOLO 通用模型自动挑选出的颗粒被准确识别（右侧，颗粒由红色方框标出）。比例尺（白色）为 50 nm。C) 二维分类结果，红色方框内为被剔除的类别，绿色方框内为选中用于后续处理的颗粒类别。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62415/62415fig04large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
一小部分颗粒可用于生成初始模型（图5A）。该初始模型随后可作为三维分类与精细结构解析的起始模型。以RagAB为例，数据集中包含三种不同的构象异构体，这些异构体可在三维分类过程中被区分开来（图5B）。归属于每一类别的颗粒可被独立处理，并用于优化电子显微镜密度图，进而进行进一步的结构解析与模型构建。
<img alt="图5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62415/62415fig05.jpg" /> 
图5：生成三维电镜密度图。A) 使用RELION生成的典型初始模型。B) 分为5类的三维分类结果，显示颗粒被分为三种不同的构象状态：开放-开放（绿色）、开放-闭合（蓝色）、闭合-闭合（紫色）。C) 掩模创建流程。三维精修得到的图谱（左）应在Chimera中进行可视化，然后使用体积查看器确定图谱中无断裂或噪声密度时的最低阈值（中）。将该阈值作为初始二值化阈值输入RELION的掩模创建任务中。右侧显示的是生成的掩模示例（灰色）。D) RagAB开放-闭合状态的高分辨率电镜密度图（EMD-10245），经局部分辨率（Å）滤波并着色。&#160;<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62415/62415fig05large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>

利用冷冻电镜（cryoEM）解析大分子复合物的结构已成为某些类别蛋白质和复合物的常规方法。本文概述了该流程（包括样品制备、筛选、数据采集与处理），并引导读者参考更详细的资源，以针对更具挑战性的样品调整相关变量。

冷冻电子显微镜技术（cryoEM）是一种通过单颗粒分析（SPA）方法测定大分子复合物结构的强大技术。

单颗粒冷冻电镜分析已成为结构生物学家工具箱中的一项常规技术，适用于多种样品，包括膜蛋白、淀粉样纤维、核酸结合蛋白和病毒。一旦完成样品制备并将载网装入显微镜，在许多冷冻电镜设施（如 Astbury 生物结构实验室和 eBIC）中即可远程进行数据采集。结构解析成功的主要障碍通常出现在样品制备和载网筛选阶段，此过程有时需要多次重复。在此，我们将演示远程网格筛选和单颗粒数据采集。在显微镜用户界面的自动进样器选项卡中，使用箭头退出选项对话框，然后按下库存按钮。系统将依次检查盒式容器中的每个位置，以确定是否存在样品盒。库存将按顺序在每个插槽上运行。当所有已占用的插槽均被映射后，库存将停止。高亮显示要转移到显微镜列的网格，然后单击加载。当载网成功加载到样品台上后，槽位标签将由蓝色变为黄色。要对载网进行筛选，请打开EPU软件。在准备页面中，选择采集光学参数和设置，然后从下拉菜单中选择图谱预设。选择合适的电子束设置预设，然后按“设置”以将参数应用到显微镜。按下按钮打开镜筒阀门并插入荧光屏。检查是否可见电子束，且其扩散程度和中心位置是否足以覆盖探测器。如有必要，使用操纵杆或虚拟手控面板控制载物台在 X 和 Y 方向上的移动，以导航至网格较薄的区域。抬起荧光屏，然后在 EPU 中点击预览按钮进行成像。在 EPU 中，进入图谱页面并点击新建会话。选择 MRC 图像格式，输入用于保存筛选会话的合适文件夹名称和存储位置，然后点击应用。从左侧菜单中选择“筛选”。勾选每个网格旁边的复选框以获取图谱拼接图像，然后在 EPU 中启动筛选流程。每个被选中的网格都将生成一幅图谱，完成后将列出可用的网格区域。可通过在筛选页面上选中每个图谱来查看。完成后，检查收集到的图谱，确定适合在更高放大倍数下评估样品质量的载网。在 EPU 筛选菜单中选中选定的载网，然后点击加载样品。在图谱筛选菜单中，选择当前加载的网格，通过在网格图像上的目标位置右键单击并选择“将载物台移至此处”，将载物台移动至包含填充孔的网格方格。返回 EPU 准备页面，选择该网格方格预设。打开 EPU 自动功能页面，使用网格方格预设运行“通过载物台倾斜进行自动齐焦”，将样品移至齐焦高度。在EPU样品制备过程中，获取一个新的网格方格预览图像。注意不同孔洞中灰度值的差异，这反映了冰层厚度的不同。通过右键点击并选择“将载物台移动至此”，将载物台移至目标孔洞上方。选择孔或等中心高度预设，然后点击预览。选择数据采集预设，并设置一个便于识别颗粒的放大倍数。将散焦偏移量设为负三到五微米。重复执行步骤，以重新评估网格上不同冰层厚度的颗粒分布、取向及污染情况。根据显微镜的可用性，可直接继续进行数据采集，或从显微镜中取出载网以供后续采集使用，包括在其他地点进行采集。若筛查过程中未获得图谱，可通过设置图谱参数并选择载网来采集图谱。获取图谱并点击网格位置以查看输出结果。图谱完成后，根据项目的实验需求定义每个光束设置预设。执行图像偏移校准。通过选择EPU页面上的会话设置，然后选择新建会话或从首选项新建，来建立EPU会话。选择新建会话后，将弹出一个窗口，提供使用先前设置的选项。设置将自动从上一个EPU会话加载到当前会话中。或者，在首选项中选择新建，并选取一个保存了首选项的文件，以将这些信息预加载到当前 EPU 中。在会话名称中填写具有说明性的名称。在类型中选择手动。选择采集模式时，若可使用且需要无像差的图像偏移采集，则选择精确的孔中心定位或快速采集。选择所需的图像格式，然后选择存储文件夹，EPU 将创建一个以会话名称命名的目录。根据所使用的网格孔间距选择相应的网格，然后按应用。选择一个初始网格方格并设置采集模板。进入方格选择界面。如果所有方格均为绿色，请点击左上角的“取消全选”。通过右键点击并选择“打开切片”来打开切片。点击“选择”后，再右键点击并选择“将载台移动至网格方格”，以添加或选择一个网格方格。进入孔选择界面，然后按下“自动居中”。等待网格方格图像拍摄完成。如果自动功能失败，可能是由于高度明显不准确。此时可在网格方格放大倍率下，通过荧光屏手动调节。为测量孔径大小，移动并调整黄色圆圈，使其覆盖孔洞，并确保其大小和间距正确。点击“查找孔洞”按钮。检查孔洞是否已被正确识别。如果不符合要求，请更改孔的尺寸，然后再次点击“查找孔”。如果此过程持续失败，可考虑在网格方格放大倍数下选择更小的孔数或更亮的光斑尺寸。使用右侧的滤冰质量直方图来调整孔的选择。这有助于排除厚冰和薄冰区域。此设置将在本次会话中后续选择的网格区域中继续保留。使用顶部“选择”菜单中的工具优化钻孔位置的选择。例如，单击“移除靠近栅格条的孔”。转到模板定义并点击采集。单击查找并居中孔洞。将阶段偏移后的延迟和图像偏移后的延迟时间更改为一到五秒，然后（如果可用）检查最大图像偏移值是否符合预期。点击添加采集区域，然后在图像上任意位置点击。将采集区域移动至所需位置。在右上方添加离焦范围。膜蛋白项目的典型离焦范围为负0.8至负3微米。然后添加其他采集区域，排列时应确保各采集区域不会被电子束重复照射。单击添加自动对焦区域，然后在图像上任意位置单击。将自动对焦区域移至孔洞周围的碳膜上。使用AFIS时的标准操作是在完成居中后进行自动对焦，或每隔5至15微米进行一次自动对焦，具体频率取决于方格区域内Z轴高度的变化情况。单击添加漂移测量区域。每个网格方格进行一次漂移测量，标准设置为阈值0.05纳米/秒。漂移测量区域可与自动对焦区域直接重叠。确保漂移测量区域和自动对焦区域均不与采集区域重叠。返回到方格选择界面，在网格上选择用于采集的方格。根据采集区域的数量和预期的数据采集速率，预估所需的采集区域数目。当所有目标方格均被选中后，点击“准备所有方格”。每个方格采集完成后，在网格方格之间切换，并使用选择画笔精细调整孔位。将样品台移动至样品上方的指定位置，利用自动功能设定齐焦高度。按照前文及正文中的描述，使用显微镜软件进行显微镜的对中校准。在重新插入并居中物镜光阑以及使用 EPU 校正物镜像散之前，先在自动功能中执行无像散对准。确保两项对准均收敛至合适的数值。在启动自动采集运行之前，确保自动进样器涡轮泵已关闭，并根据需要插入物镜光阑。在自动采集过程中，按下“开始运行”以启动自动数据采集。使用本方案，可在图谱阶段筛选并丢弃破损或干燥的载网。大多数载网上可观察到冰层梯度现象。在筛选过程中，理想的颗粒分布应为单一分散状态，并可见多种颗粒取向。若冰层过薄，在电子束照射下可能融化，导致显微照片中出现过度运动。当缓冲液中含有去垢剂时，此现象尤为常见。冰必须呈玻璃态，因此排除了大多数图像显示为结晶冰的网格区域。数据的图形化摘要被用于评估显微照片质量，并判断是否需要对数据采集进行调整。粒子挑选工具（如 crYOLO）对数据的初步处理效果良好，可推进至二维分类平均步骤。应选择能够显示二级结构细节的类别进行三维分析，而应剔除无用颗粒。可使用部分颗粒生成初始模型，用于三维分类与精修。以 RagAB 为例，该数据集包含三种不同的构象异构体，可在三维分类过程中将其分离。需要牢记的是，数据采集以及后续图像分析步骤的成功，依赖于在筛选阶段获得并鉴定出优化良好的载网。一旦获得三维冷冻电镜密度图，便可进一步通过拟合和优化蛋白质模型，或从头搭建原子模型来进行解析。冷冻电镜单颗粒分析技术使得许多此前无法实现的靶标结构得以解析。值得注意的是，这些工作流程最近已被用于解析与 COVID-19 相关的大分子结构。

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