单颗粒冷冻电子显微镜：从样品到结构

单颗粒冷冻电镜分析已成为结构生物学家工具箱中的一项常规技术，适用于多种样品，包括膜蛋白、淀粉样纤维、核酸结合蛋白和病毒。一旦完成样品制备并将载网装入显微镜，在许多冷冻电镜设施（如 Astbury 生物结构实验室和 eBIC）中即可远程进行数据采集。结构解析成功的主要障碍通常出现在样品制备和载网筛选阶段，此过程有时需要多次重复。

在此，我们将演示远程网格筛选和单颗粒数据采集。在显微镜用户界面的自动进样器选项卡中，使用箭头退出选项对话框，然后按下库存按钮。系统将依次检查盒式容器中的每个位置，以确定是否存在样品盒。

库存将按顺序在每个插槽上运行。当所有已占用的插槽均被映射后，库存将停止。高亮显示要转移到显微镜列的网格，然后单击加载。

当载网成功加载到样品台上后，槽位标签将由蓝色变为黄色。要对载网进行筛选，请打开EPU软件。在准备页面中，选择采集光学参数和设置，然后从下拉菜单中选择图谱预设。

选择合适的电子束设置预设，然后按“设置”以将参数应用到显微镜。按下按钮打开镜筒阀门并插入荧光屏。检查是否可见电子束，且其扩散程度和中心位置是否足以覆盖探测器。

如有必要，使用操纵杆或虚拟手控面板控制载物台在 X 和 Y 方向上的移动，以导航至网格较薄的区域。抬起荧光屏，然后在 EPU 中点击预览按钮进行成像。在 EPU 中，进入图谱页面并点击新建会话。选择 MRC 图像格式，输入用于保存筛选会话的合适文件夹名称和存储位置，然后点击应用。

从左侧菜单中选择“筛选”。勾选每个网格旁边的复选框以获取图谱拼接图像，然后在 EPU 中启动筛选流程。每个被选中的网格都将生成一幅图谱，完成后将列出可用的网格区域。

可通过在筛选页面上选中每个图谱来查看。完成后，检查收集到的图谱，确定适合在更高放大倍数下评估样品质量的载网。在 EPU 筛选菜单中选中选定的载网，然后点击加载样品。

在图谱筛选菜单中，选择当前加载的网格，通过在网格图像上的目标位置右键单击并选择“将载物台移至此处”，将载物台移动至包含填充孔的网格方格。返回 EPU 准备页面，选择该网格方格预设。打开 EPU 自动功能页面，使用网格方格预设运行“通过载物台倾斜进行自动齐焦”，将样品移至齐焦高度。

在EPU样品制备过程中，获取一个新的网格方格预览图像。注意不同孔洞中灰度值的差异，这反映了冰层厚度的不同。通过右键点击并选择“将载物台移动至此”，将载物台移至目标孔洞上方。

选择孔或等中心高度预设，然后点击预览。选择数据采集预设，并设置一个便于识别颗粒的放大倍数。将散焦偏移量设为负三到五微米。

重复执行步骤，以重新评估网格上不同冰层厚度的颗粒分布、取向及污染情况。根据显微镜的可用性，可直接继续进行数据采集，或从显微镜中取出载网以供后续采集使用，包括在其他地点进行采集。若筛查过程中未获得图谱，可通过设置图谱参数并选择载网来采集图谱。

获取图谱并点击网格位置以查看输出结果。图谱完成后，根据项目的实验需求定义每个光束设置预设。执行图像偏移校准。

通过选择EPU页面上的会话设置，然后选择新建会话或从首选项新建，来建立EPU会话。选择新建会话后，将弹出一个窗口，提供使用先前设置的选项。设置将自动从上一个EPU会话加载到当前会话中。

或者，在首选项中选择新建，并选取一个保存了首选项的文件，以将这些信息预加载到当前 EPU 中。在会话名称中填写具有说明性的名称。在类型中选择手动。

选择采集模式时，若可使用且需要无像差的图像偏移采集，则选择精确的孔中心定位或快速采集。选择所需的图像格式，然后选择存储文件夹，EPU 将创建一个以会话名称命名的目录。根据所使用的网格孔间距选择相应的网格，然后按应用。

选择一个初始网格方格并设置采集模板。进入方格选择界面。如果所有方格均为绿色，请点击左上角的“取消全选”。

通过右键点击并选择“打开切片”来打开切片。点击“选择”后，再右键点击并选择“将载台移动至网格方格”，以添加或选择一个网格方格。进入孔选择界面，然后按下“自动居中”。

等待网格方格图像拍摄完成。如果自动功能失败，可能是由于高度明显不准确。此时可在网格方格放大倍率下，通过荧光屏手动调节。

为测量孔径大小，移动并调整黄色圆圈，使其覆盖孔洞，并确保其大小和间距正确。点击“查找孔洞”按钮。检查孔洞是否已被正确识别。

如果不符合要求，请更改孔的尺寸，然后再次点击“查找孔”。如果此过程持续失败，可考虑在网格方格放大倍数下选择更小的孔数或更亮的光斑尺寸。使用右侧的滤冰质量直方图来调整孔的选择。

这有助于排除厚冰和薄冰区域。此设置将在本次会话中后续选择的网格区域中继续保留。使用顶部“选择”菜单中的工具优化钻孔位置的选择。

例如，单击“移除靠近栅格条的孔”。转到模板定义并点击采集。单击查找并居中孔洞。

将阶段偏移后的延迟和图像偏移后的延迟时间更改为一到五秒，然后（如果可用）检查最大图像偏移值是否符合预期。点击添加采集区域，然后在图像上任意位置点击。将采集区域移动至所需位置。

在右上方添加离焦范围。膜蛋白项目的典型离焦范围为负0.8至负3微米。然后添加其他采集区域，排列时应确保各采集区域不会被电子束重复照射。单击添加自动对焦区域，然后在图像上任意位置单击。

将自动对焦区域移至孔洞周围的碳膜上。使用AFIS时的标准操作是在完成居中后进行自动对焦，或每隔5至15微米进行一次自动对焦，具体频率取决于方格区域内Z轴高度的变化情况。单击添加漂移测量区域。

每个网格方格进行一次漂移测量，标准设置为阈值0.05纳米/秒。漂移测量区域可与自动对焦区域直接重叠。确保漂移测量区域和自动对焦区域均不与采集区域重叠。

返回到方格选择界面，在网格上选择用于采集的方格。根据采集区域的数量和预期的数据采集速率，预估所需的采集区域数目。当所有目标方格均被选中后，点击“准备所有方格”。

每个方格采集完成后，在网格方格之间切换，并使用选择画笔精细调整孔位。将样品台移动至样品上方的指定位置，利用自动功能设定齐焦高度。按照前文及正文中的描述，使用显微镜软件进行显微镜的对中校准。

在重新插入并居中物镜光阑以及使用 EPU 校正物镜像散之前，先在自动功能中执行无像散对准。确保两项对准均收敛至合适的数值。在启动自动采集运行之前，确保自动进样器涡轮泵已关闭，并根据需要插入物镜光阑。

在自动采集过程中，按下“开始运行”以启动自动数据采集。使用本方案，可在图谱阶段筛选并丢弃破损或干燥的载网。大多数载网上可观察到冰层梯度现象。

在筛选过程中，理想的颗粒分布应为单一分散状态，并可见多种颗粒取向。若冰层过薄，在电子束照射下可能融化，导致显微照片中出现过度运动。当缓冲液中含有去垢剂时，此现象尤为常见。

冰必须呈玻璃态，因此排除了大多数图像显示为结晶冰的网格区域。数据的图形化摘要被用于评估显微照片质量，并判断是否需要对数据采集进行调整。粒子挑选工具（如 crYOLO）对数据的初步处理效果良好，可推进至二维分类平均步骤。

应选择能够显示二级结构细节的类别进行三维分析，而应剔除无用颗粒。可使用部分颗粒生成初始模型，用于三维分类与精修。以 RagAB 为例，该数据集包含三种不同的构象异构体，可在三维分类过程中将其分离。

需要牢记的是，数据采集以及后续图像分析步骤的成功，依赖于在筛选阶段获得并鉴定出优化良好的载网。一旦获得三维冷冻电镜密度图，便可进一步通过拟合和优化蛋白质模型，或从头搭建原子模型来进行解析。冷冻电镜单颗粒分析技术使得许多此前无法实现的靶标结构得以解析。

值得注意的是，这些工作流程最近已被用于解析与 COVID-19 相关的大分子结构。