Name: 斑马鱼神经母细胞瘤转移模型 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-03-14T15:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 20 s
Description: 了解利用MYCN和LMO1过表达构建斑马鱼神经母细胞瘤转移模型的方法。该模型支持实时活体成像，可追踪肿瘤细胞扩散至肾脏、鳃和心脏等远端器官，为研究转移机制和药物筛选提供平台。

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本研究工作获得了美国国家癌症研究所资助项目 R01 CA240323（S.Z.）；美国国防部（DoD）资助项目 W81XWH-17-1-0498（S.Z.）；癌症研究V基金会V学者奖（S.Z.）；梅奥生物医学发现中心平台资助（S.Z.）；以及梅奥诊所癌症中心和个体化医学中心的支持（S.Z.）。

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作者声明不存在任何竞争性经济利益。

斑马鱼在过去的几十年中已被广泛用于研究，尤其是在癌症研究领域，这显然得益于其易于饲养、繁殖能力强以及在诸多方面具有的显著优势 体内 成像1,28斑马鱼模型由于其体外受精和体外发育的特性，易于进行胚胎操作，可与大鼠、小鼠等哺乳动物模型生物相辅相成，适用于大规模的遗传学研究1,2,3此外，斑马鱼基因组与人类基因组具有高度相似性。通过将斑马鱼基因组的详细注释与人类参考基因组进行比较，约70%的人类基因已被证实存在对应的斑马鱼直系同源基因。29此外，斑马鱼在研究中的其他应用已拓展至药物发现以及作为个体化癌症治疗的患者替身模型30,31越来越多的研究表明，在斑马鱼中...

斑马鱼已被广泛应用于多个研究领域，尤其是在癌症研究中。该模型具有诸多优势，例如繁殖能力强、维护成本低，以及能够多途径可视化肿瘤生长和转移过程，这些特点使斑马鱼成为研究肿瘤发生和转移的细胞与分子基础的有力工具。近年来，大规模基因组作图、转基因、基因过表达或敲除、细胞移植以及化学筛选等新技术极大地增强了斑马鱼模型的研究能力1。在过去几年中，已开发出多种斑马鱼品系，用于研究包括白血病、黑色素瘤、横纹肌肉瘤和肝细胞癌在内的多种人类癌症的肿瘤发生与转移过程2,3,4,5。此外，首个神经母细胞瘤（NB）的斑马鱼模型是通过在多巴胺-β-羟化酶（dβh）启动子的调控下，在外周交感神经系统（PSNS）中过表达致癌基因MYCN而构建的。利用该模型，进一步证明了活化的ALK可与MYCN协同作用，加速肿瘤的发生并提高肿瘤的外显率in vivo6。
神经母细胞瘤（NB）起源于神经嵴细胞的交感肾上腺谱系，是儿童中一种高度转移性的癌症7。NB导致约10%的儿童癌症相关死亡8。在诊断时通常已广泛转移，临床上表现为主要起源于交感神经节链和周围神经系统（PSNS）肾上腺髓质的肿瘤9,10。MYCN基因扩增通常与NB患者预后不良相关11,12。此外，LMO1已被确定为高危NB病例中的关键易感基因13,14。研究发现，在斑马鱼模型中，MYCN和LMO1在PSNS中的转基因共表达不仅促进NB的早期发病，还可诱导肿瘤广泛转移至与高危NB患者常见的转移部位相似的组织和器官13。最近，在另一种新型斑马鱼NB模型中也观察到类似的转移表型，该模型在dβh启动子调控下同时过表达MYCN和编码RNA结合蛋白的Lin28B16。
斑马鱼中的稳定转基因方法常用于研究目的基因的过表达是否会影响正常发育及疾病发病机制14,15该技术已成功用于证明多个基因和信号通路在神经母细胞瘤发生中的重要作用6,16,17,18,19,20本文将介绍如何构建过表达两者的转基因鱼系 MYCN 和 LMO1 在PSNS中构建了模型，并证明了这两个癌基因的协同作用可加速神经母细胞瘤（NB）的肿瘤发生及转移进程13首先，使用过表达的转基因品系 EGFP-MYCN 在……的控制下 dβh 启动子（指定为 MYCN 线）是通过注射开发的 dβh-EGFP-MYCN 将构建体注入野生型（WT）AB品系胚胎的单细胞期，具体操作如前所述6,17. 一个独立的转基因品系，该品系过表达 LMO1 在PSNS（指定 LMO1 线) 是通过共注射两种DNA构建体开发的， dβh-LMO1 和 dβh-mCherry，于单细胞阶段注射到野生型胚胎中13已有研究表明，共注射的双DNA载体可共同整合到鱼类基因组中；因此， LMO1 和 mCherry 在转基因动物的PSNS细胞中共同表达。一旦注射的F0胚胎达到性成熟，便与野生型鱼进行杂交，以鉴定出携带转基因整合的阳性鱼。简而言之，首先通过荧光显微镜对F1后代进行筛选 mCherry PSNS 细胞中的表达。生殖系整合的 LMO1 在mCherry阳性鱼中通过基因组PCR和测序进一步确认。在成功鉴定每个转基因品系后，杂合子后代的 MYCN 和 LMO1 转基因鱼相互交配，以培育出可同时表达两种外源基因的复合鱼系 MYCN 和 LMO1 （指定） MYCN；LMO1 线。荷瘤 MYCN；LMO1 每两周通过荧光显微镜监测鱼类，以观察原发部位远端区域（即间肾腺区域，IRG，相当于人类肾上腺的斑马鱼组织）是否存在转移性肿瘤的证据。13. 为确认肿瘤的转移情况 MYCN；LMO1 对鱼类进行了组织学和免疫组织化学分析。

<table><tbody><tr><td>3,3&amp;rsquo;-二氨基联苯胺（DAB）Vector试剂盒</td><td>Vector</td><td>SK-4100</td><td></td></tr><tr><td>乙酸</td><td>Fisher Scientific / Acros Organic</td><td>64-19-7</td><td></td></tr><tr><td>琼脂糖GP2</td><td>Midwest Scientific</td><td>009012-36-6</td><td></td></tr><tr><td>抗酪氨酸羟化酶（TH）抗体</td><td>Pel-Freez</td><td>P40101</td><td></td></tr><tr><td>亲和素/生物素封闭试剂盒</td><td>Vector</td><td>SP-2001</td><td></td></tr><tr><td>BOND Intense R 检测试剂</td><td>Leica Biosystems</td><td>DS9263</td><td></td></tr><tr><td>BOND一抗稀释液</td><td>Leica Biosystems Newcastle, Ltd.</td><td>AR9352</td><td></td></tr><tr><td>BOND-MAX IHC仪器</td><td>Leica Biosystems Newcastle, Ltd.</td><td>N/A</td><td>全自动免疫组化染色系统</td></tr><tr><td>CH211-270H11 BAC克隆</td><td>BACPAC资源中心（BRFC）</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>配备DP71相机的复式显微镜</td><td>Olympus</td><td>AX70</td><td></td></tr><tr><td>Cytoseal XYL（基于二甲苯的封片介质）</td><td>Richard-Allan Scientific</td><td>8312-4</td><td></td></tr><tr><td>伊红</td><td>Leica</td><td>3801601</td><td>即用型（无需配制）</td></tr><tr><td>乙醇</td><td>Carolina</td><td>86-1263</td><td></td></tr><tr><td>Expand长片段PCR系统</td><td>Roche Applied Science, IN</td><td>11681834001</td><td></td></tr><tr><td>Gateway BP Clonase II酶混合物</td><td>Invitrogen, CA</td><td>11789-020</td><td></td></tr><tr><td>Gateway LR Clonase II酶混合物</td><td>Invitrogen, CA</td><td>11791-100</td><td></td></tr><tr><td>山羊抗兔二抗（生物素标记）</td><td>Dako</td><td>E0432</td><td></td></tr><tr><td>改良哈里斯苏木精溶液</td><td>Sigma Aldrich Chemical Company Inc. / SAFC</td><td>HHS-32-1L</td><td></td></tr><tr><td>HRP亲和素D</td><td>Vector</td><td>A-2004</td><td></td></tr><tr><td>盐酸</td><td>Aqua Solutions</td><td>4360-1L</td><td></td></tr><tr><td>过氧化氢，3%</td><td>Fisher Scientific</td><td>H324-500</td><td></td></tr><tr><td>I-SceI酶</td><td>New England Biolabs, MA</td><td>R0694L</td><td></td></tr><tr><td>硫酸卡那霉素</td><td>Teknova, Inc.</td><td>K2150</td><td></td></tr><tr><td>Kimberly-Clark Professional Kimtech Science Kimwipes纸巾</td><td>Fisher Scientific</td><td>34133</td><td></td></tr><tr><td>碳酸锂</td><td>Sigma Aldrich Chemical Company Inc. / SAFC</td><td>554-13-2</td><td></td></tr><tr><td>用于切片的切片机</td><td>Leica Biosystems</td><td>RM2255</td><td></td></tr><tr><td>One Shot TOP10化学感受态&amp;nbsp;E. coli</td><td>Invitrogen</td><td>C404006</td><td></td></tr><tr><td>p3E-polyA</td><td>&amp;nbsp;犹他大学Chi-Bin Chien博士</td><td>N/A</td><td>慷慨馈赠&lt;br/&gt;（请访问网页 http://tol2kit.genetics.utah.edu/index.php/Main_Page 获取材料，该材料按说明免费分发。）</td></tr><tr><td>石蜡</td><td>Surgipath Paraplast</td><td>39603002</td><td>石蜡到石蜡</td></tr><tr><td>多聚甲醛</td><td>Alfa Aesar</td><td>A11313</td><td></td></tr><tr><td>pDEST载体（含I-SceI识别位点的改良目的载体）</td><td>德国卡尔斯鲁厄理工学院C. Grabher博士</td><td>N/A</td><td>慷慨馈赠</td></tr><tr><td>pDONR 221 gateway供体载体</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>12536-017</td><td></td></tr><tr><td>pDONRP4-P1R供体载体</td><td>&amp;nbsp;犹他大学Chi-Bin Chien博士</td><td>N/A</td><td>慷慨馈赠</td></tr><tr><td>酚红，0.5%</td><td>Sigma Aldrich</td><td>&amp;nbsp;P0290</td><td></td></tr><tr><td>磷酸盐缓冲液（PBS），10X</td><td>BioRad</td><td>1610780</td><td></td></tr><tr><td>苦味酸-天狼星红染色试剂盒</td><td>Polysciences</td><td>24901-250</td><td></td></tr><tr><td>pME-mCherry</td><td>Addgene</td><td>26028</td><td></td></tr><tr><td>蛋白酶K，重组，PCR级</td><td>Roche</td><td>21712520</td><td></td></tr><tr><td>QIAprep Spin MiniPrep试剂盒</td><td>Qiagen</td><td>27104</td><td></td></tr><tr><td>RDO快速脱钙剂</td><td>Apex Engineering</td><td>RDO04</td><td></td></tr><tr><td>叠氮化钠（NaN3）</td><td>Sigma Aldrich</td><td>26628-22-8</td><td></td></tr><tr><td>体视荧光显微镜</td><td>Leica</td><td>MZ10F</td><td></td></tr><tr><td>配备数字成像相机DS-U1的立体荧光显微镜</td><td>Nikon</td><td>SMZ-1500</td><td></td></tr><tr><td>Taq DNA聚合酶</td><td>New England Biolabs, MA</td><td>M0273L</td><td></td></tr><tr><td>Tissue-Tek VIP&amp;reg;&amp;nbsp;6 AI真空浸润处理仪</td><td>Sakura</td><td>N/A</td><td>型号 #: VIP-6-A1</td></tr><tr><td>Tricaine-S</td><td>Western Chemical Incorporated</td><td>20513</td><td></td></tr><tr><td>二甲苯</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>X3P1GAL</td><td></td></tr></tbody></table>

神经母细胞瘤转移的斑马鱼模型

Zebrafish Model of Neuroblastoma Metastasis

斑马鱼已成为研究人类疾病，尤其是癌症的重要动物模型。结合在斑马鱼建模中广泛应用的高效转基因和基因组编辑技术，以及其易于饲养、繁殖力高和强大的活体成像能力，斑马鱼成为研究转移过程及其细胞与分子基础的宝贵模型系统 体内首个斑马鱼神经母细胞瘤（NB）转移模型是通过过表达两个癌基因建立的， MYCN 和 LMO1，由多巴胺-β-羟化酶（dopamine-beta-hydroxylase,dβh）启动子。共过表达 MYCN 和 LMO1 导致神经母细胞瘤发生的潜伏期缩短、外显率增加，以及肿瘤细胞远处转移的加速。该新模型稳定重现了人类转移性神经母细胞瘤的多个关键特征，包括临床相关且与转移相关的遗传学改变，以及转移的自然自发性发生。 体内；以及转移的保守位点。因此，斑马鱼模型在解析肿瘤转移这一复杂过程方面具有独特优势 体内.

为了确定是否 LMO1 协同作用于 MYCN 影响NB发病机制，驱动表达以下任一的转基因构建体 LMO1 (d&#946;h:LMO1 和 d&#946;h:mCherry）或 MYCN (d&#946;h:EGFP-MYCN 在受控条件下的PSNS细胞中 d&#946;h 启动子被注射到斑马鱼胚胎中13如图所示 图1A在获得稳定转基因品系并验证其基因型后，将杂合子 MYCN 和 LMO1 鱼类进行杂交。其后代按以下方式分选： MYCN （EGFP+）或 LMO1 分别在受精后1天或3-4天（mCherry+）表达。 MYCN 过表达已被证明可抑制 PSNS 的发育6因此， EGFP-MYCN 在1 dpf时，非PSNS多巴胺能神经元细...

本文介绍了在神经母细胞瘤的斑马鱼模型中实时开发、表征和追踪肿瘤转移的方法，特别是针对MYCN和LMO1过表达的转基因斑马鱼品系，该品系可自发产生转移。

斑马鱼已成为研究人类疾病，尤其是癌症的重要动物模型。随着强大的转基因和基因组编辑技术的发展……

这些方法被用于建立首个神经母细胞瘤转移的斑马鱼模型，并证明该模型能够真实再现高危神经母细胞瘤患者中观察到的多种转移特征。该转移性斑马鱼模型的主要优势在于可对肿瘤扩散进行实时体内成像，从而更深入地理解转移发生的时间，以及可能的发生机制。该技术并非神经母细胞瘤所特有。只要能够识别并追踪肿瘤细胞，该技术便可应用于多种癌症的斑马鱼模型，具有广泛的应用前景。首先，通过杂交 MYCN 和 LMO1 转基因品系，建立一个同时过表达 MYCN 和 LMO1 的杂合转基因鱼系。受精后一天，使用体视荧光显微镜根据EGFP表达情况对杂交后代进行分选，EGFP阳性表现为可见的EGFP荧光点。分选后，将筛选出的胚胎分别移入不同的培养皿中，并将培养皿标记为MYCN阳性或MYCN阴性。在受精后三至四天，对两组胚胎分别进行LMO1表达的观察与分选。在颈上神经节和非PSNS多巴胺能神经元细胞中寻找红色荧光斑点，尤其是在后脑的延髓部位。在胚胎受精后五天之前完成筛选。随后将分选后的鱼按四种不同基因型分离为四组，并标记为仅MYCN、仅LMO1、同时含有MYCN和LMO1以及野生型。根据标准实验方案，在相同条件下进行培养。使用体视荧光显微镜观察肿瘤，用金属刮铲轻轻翻动鱼体两侧，以观察肿瘤情况。在鉴定出可能携带肿瘤的鱼后，将其分离至单独的养殖缸中，并做好相应标记，标记内容应包括出生日期、肿瘤筛查日期以及基因型。在受精后六周，重复之前的步骤，筛选携带肿瘤的鱼和不携带肿瘤的鱼，以确认此前已筛选个体中肿瘤的存在，或识别新出现的可能携带肿瘤的鱼。观察荧光阳性肿块是否持续存在或体积增大，以确认肿瘤携带个体。在鉴定出携带肿瘤的鱼后，每两周监测一次肿瘤细胞迁移的迹象，迁移表现为远离原发性肿瘤发生部位的微小EGFP或mCherry阳性肿瘤病灶。根据需要将这些鱼隔离至不同的鱼缸中，并做好相应标记以提示可能的转移情况。在解析LMO1鱼中杂合的MYCN基因后，在分选其子代时发现，受精后一天，EGFP标记的MYCN表达在非PSNS多巴胺能神经元细胞中尤为显著。相比之下，LMO1的表达在PSNS细胞和非PSNS多巴胺能神经元细胞中均较为显著。在同时过表达MYCN和LMO1的双转基因鱼中，除原发肿瘤部位外，在远端器官组织中检测到荧光阳性的肿瘤病灶，而在仅表达MYCN的转基因鱼中则未观察到此类病灶。手术切片的苏木精-伊红（H&E）染色显示，原发肿瘤起源于肾间腺区域，该区域相当于人类的肾上腺，是神经母细胞瘤患者原发疾病最常见的发生部位。在肾间腺以外的多个区域均检测到肿瘤病灶，包括肾脏远端、眼眶、鳃、脾脏以及心脏心房腔的内壁。已确认原发肿瘤及所有转移部位的肿瘤细胞中PSNS神经母细胞谱系。与仅表达MYCN的肿瘤相比，MYCN LMO1肿瘤中PSR染色的胶原纤维数量显著增加且纤维增厚。采用该方法后，可进行药物筛选并测试新型癌症疗法，这有望推动开发用于预防和治疗转移性癌症的替代性药物。

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癌症研究

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