玉米叶蝉（Peregrinus maidis）胚胎的显微注射用于CRISPR/Cas9基因组编辑

迄今为止，CRISPR 技术仅在少数半翅目昆虫中得到应用。本文所述的实验方案可帮助研究人员在其他半翅目物种中应用 CRISPR 技术及种系转化。该方案专为对干燥敏感的昆虫胚胎而开发。

该方案中的许多步骤有望在其他昆虫物种中改善实验结果。能够创制转基因飞虱为新型防控方法开辟了道路，例如培育无法再传播病毒的昆虫。该技术将对研究其他害虫（如西方花蓟马）的基因功能产生革命性影响。

我们已将这种CRISPR技术成功应用于蓟马胚胎，并取得了令人鼓舞的结果。我们发现，在该系统中进行实践操作对于成功至关重要。若能常规实施本文所述方法，应可在多种实验条件下实现灵活应用。

为了制作一个用于容纳成年玉米蚜（Peregrinus maidis）昆虫的饲养室，需在一只一盎司容量的杯子底部打一个孔，并在孔上粘贴筛网以实现空气交换。在选择一周龄成年雌性昆虫时，先用吸虫器将种群转移至15毫升锥形管中静置一小时，随后将昆虫短暂置于冰上冷却。通过观察腹部腹面是否存在产卵器来鉴别雌性个体，产卵器通常比腹部其余部分颜色更深。

将收集到的雌性个体转移至杯中。当挑选出15只雌性个体后，用一块5 cm × 5 cm的石蜡膜密封杯口。在膜上加入400 µL的10%蔗糖溶液，然后将另一块5 cm × 5 cm的石蜡膜覆盖在溶液上方。

将成虫培养室置于装有产卵培养基的卵收集皿上，确保塑料石蜡膜一侧直接接触产卵培养基，并用塑料保鲜膜包裹整个产卵室，注意不要覆盖通气孔。随后，将培养室置于25°C、70%湿度、14小时光照/10小时黑暗的条件下。进行胚胎收集时，在所需的产卵时间段结束后，取一条尺寸为1 × 15 mm的双面胶带，粘贴至一块22 × 30 mm的盖玻片上，然后将该盖玻片放置于产卵室的产卵培养基表面。

使用细毛刷和解剖显微镜，将单个半透明的胚胎从琼脂表面转移到双面胶带上。当挑选出约25个胚胎后，将香蕉形的胚胎侧向排列，使其较粗的一端粘附在胶带上。进行胚胎显微注射前，首先在加湿培养罩内的解剖显微镜下，将盖玻片放置于盛有1%琼脂的100 mm × 15 mm培养皿中，使盖玻片表面与琼脂齐平。

为检查注射压力，将石英注射针的针尖放入一滴水中，并启动注射循环。确认压力设置后，从盖玻片左侧开始，将针插入一个胚胎较大的一端。将注射溶液注入卵内，然后迅速抽出针头。

所有卵注射完成后，将盖玻片放置于新的1%琼脂培养皿表面，并将培养皿放入湿度孵育盒中。六天后，使用洁净水和细刷将存活的胚胎转移至含有湿润滤纸的35 mm × 10 mm培养皿中。用塑料封口膜密封培养皿，并将孵化盒置于25 °C恒温培养箱中。

孵化后六到八天，使用细毛刷将新孵化的一龄若虫转移到装有叶片碎片的培养皿中，并用塑料封口膜密封培养皿。在25摄氏度条件下培养48小时后，用细毛刷将所有两天龄的若虫转移至含有玉米植株的饲养笼中。若获得具有明显表型的注射个体且数量充足，应将这些昆虫单独饲养，以最大化下一代中目标性状的获得率。

在适当的温度和湿度条件下饲养昆虫，并根据需要定期将其转移到新鲜的玉米植株上，同时定期筛选后代中预期的表型，将表现出目标表型的个体单独放入笼中，以建立纯合品系。在此代表性分析中，四周内共从645只雌虫收集到6,483枚卵。雌虫通常在两天后开始产卵，在第4至第6天产下大部分卵，到第9天时产卵活动逐渐减缓。

Cas9九次注射不影响P.maidis的发育，因为注射缓冲液、添加Cas9的注射缓冲液以及添加Cas9和三种向导RNA的注射缓冲液处理的胚胎发育速率相似。缓冲液组和Cas9对照组的孵化率也相似。然而，接受三种向导RNA混合物的个体孵化率通常相对较低。

在此代表性实验中，71例注射了向导RNA的发育个体中，有23例表现出不同程度的色素缺失，其中9例成功孵化，敲除率约为30%。三向导RNA混合物预计可从white基因座中删除约180个碱基对，该结果在从注射个体中分离的基因组DNA扩增出的PCR产物及其相应的测序数据中均得到证实。我们建议使用斜面针头以尽量减少注射造成的创伤。若发现胚胎在注射后出现泄漏现象，请检查针头尖端以获得更佳效果。

持续练习可提高胚胎存活率。迄今为止，尚无关于半翅目昆虫种系转化的公开报道。然而，我们已利用本方案成功构建了表达Cas9的飞虱品系。

总体而言，对半翅目昆虫进行种系转化的能力为多种遗传性害虫管理策略开辟了道路，从而减少杀虫剂的使用。