Name: 显微镜注射玉米飞虱、 游隼、用于CRISPR/Cas9基因组编辑的胚胎 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-03-26T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 27 s
Description: 学习利用CRISPR/Cas9技术对玉米飞虱（Peregrinus maidis）胚胎进行显微注射，实现基因敲除与稳定遗传修饰。该方法适用于半翅目昆虫功能基因组学与害虫防控研究。

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北卡罗来纳州立大学昆虫学与植物病理学系是支持美国国防高级研究计划局（DARPA）“昆虫盟友计划”的团队之一。文中表达的观点、意见和/或研究成果仅代表作者立场，不应被解释为代表美国国防部或美国政府的官方观点或政策。作者声明无利益冲突。MDL、DR 和 AEW 提出研究项目，并负责项目资金获取、项目管理及资源提供。FC、WK、NG 和 MDL 构思并设计了显微注射实验；OH 构思并设计了产卵方法。FC 和 WK 实施实验；FC 和 WK 分析实验结果；FC、WK、NG 和 MDL 共同撰写论文。作者特别感谢 Kyle Sozanski 和 Victoria Barnett 在维持 P. maidis 种群培养方面提供的帮助。

1. P. maidis 成虫的群体水平饲养
<ol>
	<li>每个饲养笼每周至少种植四盆玉米，每盆播种3-4粒。在无昆虫环境中培养。</li>
	<li>当植株生长至约5周龄时，将其放入30 cm × 30 cm × 60 cm的饲养笼中。</li>
	<li>从科研实验室或野外获取足够数量的P. maidis成虫（约500只），并将其放入防虫笼内，同时提供9-12株玉米植株（3-4盆）。</li>
	<li>将种群维持在昆虫饲养培养箱中，温度为25 °C（± 1 °C），相对湿度至少70%，光照周期为14小时光照:10小时黑暗。</li>
	<li>为建立年龄校准的种群，在产卵四天后移除所有初始成虫，使在笼内产下的胚胎自然孵化并正常发育。</li>
	<li>使用吸虫器收集5周龄的P. maidis成虫（图1），转移至新鲜玉米植株上进行每周继代培养。随后将成虫释放到装有新鲜玉米植株的洁净饲养笼中。为持续获得用于实验的年轻成虫，需每周准备新的年龄校准饲养笼。</li>
	<li>每天对饲养笼内的花盆浇水两次。定期修剪茎秆，清除腐烂的植物残体，并根据需要更换新的玉米植株。 
	&#8203;注意：若维护得当，一个种群可维持约5周（即，足够使在笼内产卵的胚胎发育为成虫）。</li>
</ol>
2. 基于琼脂糖的产卵室
<ol>
	<li>通过将1% w/v的琼脂糖水溶液倒入洁净的100 mm × 15 mm培养皿中制备卵收集皿（产卵基质）。待其凝固后，将产卵基质于4 °C保存。</li>
	<li>配制10% w/v的蔗糖溶液用于成虫饲喂。蔗糖溶液可于-20 °C保存一个月。</li>
	<li>通过在1盎司杯底部（见材料表）打孔，并在孔上粘贴筛网以实现气体交换，制成容纳成虫的容器（图2）。</li>
	<li>将塑料石蜡膜裁剪成5 cm × 5 cm的正方形；每个杯预留两片。</li>
	<li>从经过年龄校准的P. maidis种群中收集约15只1周龄的成年雌虫。选择雌虫时，观察腹部腹面，寻找通常比腹部其余部分颜色更深的产卵器（图3）。若需设置多个产卵容器，可将成虫暂时存放于15&#160;mL锥形管中，最多存放一小时。在性别鉴定前，先将昆虫短暂置于冰上冷却，再转移至成虫容器中。 
	注：此操作无需显微镜。已充分取食和交配的成年雌虫通常腹部比雄虫更大，且更为温顺，因此可更方便地从群体中挑选。</li>
	<li>将雌虫转移至成虫容器中，并用一层塑料石蜡膜均匀拉伸至原尺寸的3–4倍后密封杯口（图4A,B）。</li>
	<li>在塑料石蜡膜密封层顶部加入400 µL的10% w/v蔗糖溶液，再覆盖第二层塑料石蜡膜，拉伸方式与第一层完全相同（图4C,D）。 
	&#8203;注：双层拉伸的塑料石蜡膜形成的夹层可对蔗糖溶液施加压力，这对成虫取食至关重要，但不会阻碍雌虫将产卵器完全刺入产卵基质中。</li>
	<li>将成虫容器倒置于卵收集皿上，使塑料石蜡膜一侧直接接触产卵基质，并用保鲜膜包裹整个产卵装置，注意不要覆盖通气孔，以确保气体交换（图5）。</li>
	<li>将每个产卵装置置于25 °C、70%湿度、14:10光暗周期条件下培养。</li>
	<li>每天更换一次塑料石蜡膜夹层及10% w/v蔗糖溶液，并清除杯内积聚的水分。</li>
</ol>
3. 在高湿度环境中收集和排列胚胎
<ol>
	<li>在加湿空间或加湿罩（加湿罩；图6）中建立基于体视显微镜的显微注射系统，以确保在整个显微注射过程中工作环境的湿度至少达到70%。</li>
	<li>在所需的产卵时间段后，检查产卵培养基中的卵。此操作应在加湿罩或其他高湿度环境中进行。 
	注意：通常使用的产卵时间段为过夜，即从下午6点至上午10点，持续约16小时。</li>
	<li>若发现卵产在琼脂糖内，使用精细镊子小心将其挖出，并放置于琼脂糖表面以保持湿润（图7A）。</li>
	<li>在22 mm × 30 mm的盖玻片上贴一条1 mm × 15 mm的双面胶带（图7B）。将盖玻片有胶带的一面朝上放置于产卵培养基上（图7C）。</li>
	<li>用细毛刷逐个拾取琼脂表面的卵，并转移至双面胶带上。剔除完全呈白色或表面有黑色斑点的卵。健康的卵应呈半透明状。</li>
	<li>将香蕉形的卵侧放，使较粗的一端粘附在双面胶带上（图7D）。 
	&#8203;注意：始终将卵保持在高湿度环境中，例如在底部铺有一层1%琼脂的培养皿中。</li>
</ol>
4. CRISPR 试剂和注射针的制备
<ol>
	<li>使用 Flaming/Brown 型微电极拉制仪拉制石英针。</li>
	<li>使用微电极斜面仪对石英针进行斜面处理。</li>
	<li>使用双面胶带将拉制好的针固定在透明容器（如培养皿）中，待用。</li>
	<li>通过将 0.5 µL Cas9 蛋白（5 µg/µL 储存液）与 0.5 µL sgRNA（4 µg/µL 储存液；参见材料表）及 1 µL 酚红缓冲液混合，得到终体积为 5 µL 的注射溶液。为沉淀可能堵塞针头的颗粒，短暂涡旋溶液，并以最大速度离心 3 分钟。</li>
	<li>从针尾部填充注射针，注意使注射混合物靠近针尖的锥形末端。如有气泡，需从针尖处去除。</li>
	<li>小心将填充好的针插入针夹持器中，并拧紧不锈钢卡箍，以确保在显微注射过程中针固定牢固。</li>
	<li>通过使用湿润的细毛笔轻轻刷拭斜面针尖，同时利用注射系统向针内输送短暂的气压脉冲，从而在针尖产生稳定的注射液流。 
	&#8203;注意：当注射混合物能够以少量从针尖流出时，表明针已准备好用于注射。</li>
</ol>
5. 显微注射及注射后护理
<ol>
	<li>通过将洁净的100 mm × 15 mm培养皿填充1%琼脂，制备显微注射平台，形成与培养皿顶部齐平的均匀琼脂层。</li>
	<li>将预先准备好的、带有约25个胚胎的盖玻片放置在琼脂平台上（图8A). 
	注意：所有注射步骤必须在加湿的培养罩内（约70%湿度）进行。</li>
	<li>通过将针尖置于水滴中并启动注射循环，检查注射压力。 
	注意：如果压力设置正确，应有少量注射液分散到水中图8B).</li>
	<li>将针头插入胚胎较大的一端，从盖玻片的左侧进针（图8C将注射液注入卵内，然后迅速拔出针头。</li>
	<li>所有卵注射完毕后，将盖玻片置于新的1%琼脂培养皿表面，并将培养皿转移至湿度 chamber（图9).</li>
</ol>
6. 胚胎的孵育与孵化
<ol>
	<li>将孵化室置于25 °C培养箱中培养6天。</li>
	<li>使用洁净水和细毛刷将存活的胚胎转移至底部铺有湿润滤纸的35 mm × 10 mm培养皿中。用塑料封口膜密封培养皿，并在25 °C条件下继续培养，使胚胎孵化。自注射后第6天起开始观察胚胎存活情况。 
	注意：一龄若虫大约在第8天开始孵化。</li>
	<li>使用细毛刷将若虫转移至含有植物叶片切段的培养皿中。盖上皿盖，并用塑料封口膜密封。</li>
	<li>将密封的培养皿连同孵化出的若虫一起在25 °C条件下于叶片切段上继续培养48小时。</li>
	<li>使用细毛刷将一批注射后孵化的2日龄若虫转移至含有玉米植株的饲养笼中。若具有明显表型的注射个体数量足够，应将其单独饲养以最大化目标性状在下一代中的保留；否则，对所有注射个体进行群体交配。 
	注意：将孵化出的若虫轻轻放置于玉米植株的心叶部位，以提供庇护并确保其微环境具有适宜的湿度。</li>
	<li>按照上述条件饲养昆虫，确保适宜的温度、湿度，并定期更换至新鲜的玉米植株。</li>
	<li>对后代进行目标表型筛选。将表现出期望表型的个体单独放入饲养笼中，以建立纯合品系。</li>
</ol>

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</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

产卵质量与营养 
最近，研究与Nilaparvata lugens近缘物种的科研人员直接从叶片上获取用于显微注射的卵，并将注射后的卵保留在叶组织中直至孵化17。尽管这种基于叶片的方法为胚胎发育提供了更自然的环境，但也增加了感染风险以及在取卵过程中对卵造成损伤的可能性。本文所介绍的人工产卵系统则提供了更均一的环境，并降低了因操作导致卵损伤的概率。通过在周五设置产卵杯，大多数产出的卵可在正常工作周内收集完毕，有利于开展显微注射工作的研究人员。然而，该方法的一个局限在于，10%蔗糖溶液饮食中缺乏营养，最终会影响昆虫的健康状况，通常雌虫在产卵杯中仅存活约10天即开始大量死亡。卵的质量在6天后也开始下降，表现为死卵或外观不健康的卵数量增加。因此，选择用于显微注射的卵时必须谨慎，并且雌虫不应保留超过6天。
存活率与湿度 
有两个因素对于胚胎在显微注射过程中的存活至关重要。P. maidis 胚胎操作中最困难的部分是在将其从产卵基质中取出后以及整个显微注射过程中防止其脱水。由于卵通常产在植物组织内部，缺乏足够的卵壳来防止水分流失。即使在加湿的通风橱中，整批卵也可能因脱水而死亡。然而，过高的湿度同样会影响显微注射，例如水分在双面胶带或显微镜镜片上积聚时。不幸的是，在显微注射过程中通常很难察觉卵是否脱水，它们往往在操作时外观正常，直到2至3天后才变得完全透明，且不再表现出任何发育迹象。
针头质量似乎也在存活率中起着重要作用。针头应具有斜面，以尽量减少对卵的不必要损伤。当针头堵塞时，通常可通过启动注射器的清洗功能，同时用湿润的画笔轻轻擦拭针头尖端（见步骤4.7），使针头恢复至可用状态。尽管如此，建议每次仅向每根针头中加入极少量的注射液（约0.25 µL），并每隔几张载玻片（约50–60枚卵）更换一次新针头，以确保整个注射过程中针头质量始终得到保障。
成功获得基因敲除表型 
为了成功转化生殖细胞，通常需要在细胞化之前尽早进行胚胎显微注射。根据昆虫物种的不同，完成显微注射的时间窗口可能仅有数小时，也可能长达一整天14,15,20。目前尚不清楚P. maidis胚胎的细胞化发生时间。&#160;在产卵后4小时（pel）至16小时（pel）的不同发育阶段胚胎中均测试了Cas9介导的基因敲除，并在所有实验中均观察到了预期的表型，表明所有显微注射均在细胞化前窗口期内完成。
选择甘蔗红蜡蝉（P. maidis）中眼色基因 white 的同源基因，是因为其基因敲除表型具有细胞自主性，预期可在显微注射个体中易于筛选。事实上，正如预期，接受含 Cas9 和向导 RNA 混合物注射的胚胎中，嵌合型和完全型基因敲除个体均能被明确识别。然而，所有完全敲除的注射个体均未能孵化，对存活注射个体进行大规模交配也未能获得白眼后代。尽管如此，研究人员已通过靶向另一个基因成功建立了突变品系（Klobasa 等，正在进行中）。这表明，未能建立 white 突变品系的原因，极有可能是由于脱靶效应（即，Cas9 在基因组其他位置切割了重要区域）导致产生紧密连锁的致死突变，或由于 white 基因在 P. maidis 中具有未预期的关键生物学功能。
表型和分子数据（图8 和 图9）证实，在注射的胚胎样本中，white 基因座发生了显著的基因敲除，导致该基因功能完全丧失。此外，尽管在某些物种中 white 基因的突变是可存活的，但已有研究表明 white 基因活性降低可能具有不利影响21,22。尽管如此，脱靶效应仍不能完全排除。预测可能的脱靶位点需要准确的基因组序列数据23，而目前 P. maidis 的基因组资源尚不完善，暂时无法实现这一分析。然而，借助这些新方法，可以更有信心地对其他靶基因进行测试，甚至可推进更传统的转基因技术，以期为这种危害严重的害虫开发新的遗传工具。

玉米叶蝉 Peregrinus maidis 是&#160;玉米的一种重要经济害虫1,2,3它们在利用刺吸式口器取食以及通过将胚胎直接产入植物组织进行繁殖时，都会对植物造成直接的物理损伤。2,4尽管这些昆虫对作物有多种直接损害途径，但其对作物健康影响最大的方面是间接的，即作为玉米花叶病毒（MMV）和玉米条纹病毒的传播媒介5,6MMV 能够在人体内复制 P. maidis 载体，使病毒能够在单个昆虫体内终身持续存在，从而能够持续将病毒传播给新的寄主植物7,8最常见的控制方法 P. maidis，因此它传播的病毒也属于杀虫剂。
遗憾的是，这些产品的管理不当已导致靶标害虫产生抗性，并造成环境污染9。因此，亟需开发新的策略以减少此类昆虫/病毒复合害虫造成的作物损失。先前的研究表明，RNA干扰（RNAi）可作为防治P. maidis的有效手段，因为该害虫即使通过摄食双链RNA（dsRNA）也能发生基因表达的下调10。然而，在田间最有效的dsRNA施用方式是通过昆虫取食的植物进行传递；但由此可能导致作物仍易受昆虫所携带病毒的侵染。随着CRISPR/Cas9基因组编辑技术的出现，新的害虫防控策略成为可能，包括基于Cas9的基因驱动技术11,12，该技术可用于减少害虫种群规模，或以对所传播病毒具有抗性的个体替代原有种群。
然而，任何类型基因驱动系统的开发与应用都需要建立转基因技术。这类方法在进行RNAi实验时并非必需 P. maidis 因为双链RNA（dsRNA）和/或小干扰RNA（siRNA）被认为能够穿过细胞膜，这源于RNA干扰（RNAi）的高效性 P. maidis10,13这一点对于传统转基因技术或基于Cas9的基因编辑所使用的DNA和/或蛋白质同样成立，而这些技术正是构建携带基因驱动昆虫的前期手段。为了实现基因编辑或其他形式的种系转化，这些DNA和蛋白质理想情况下需在昆虫胚胎细胞化之前，于合胞体胚盘阶段显微注射到胚胎中。时机至关重要，因为合胞体阶段是发育过程中最早的时期之一。14,15。当 P. maidis 雌性偏好在植物组织中产卵，提取足量的卵前胚胎用于显微注射可能费力且耗时。因此，研究人员开发了新的技术以快速收集并进行显微注射 P. maidis 细胞化之前的胚胎。

<table><tbody><tr><td>1 盎司容器</td><td>Dart</td><td>P100N</td><td>用于产卵装置的成虫容器</td></tr><tr><td>15 mL 圆底离心管</td><td>Olympus</td><td>Genesee 28-103</td><td>用作真空抽吸装置中的收集管</td></tr><tr><td>15 mL 圆底离心管</td><td>Olympus</td><td>Genesee 28-106</td><td>用于配制10%蔗糖溶液，以及在筛选前冷藏时盛放成虫</td></tr><tr><td>手动抽吸器</td><td>Bioquip</td><td>1135A</td><td>用于操作飞虱</td></tr><tr><td>真空抽吸器</td><td>Fischer Technical</td><td>LAV-3</td><td>用于抽吸大量昆虫</td></tr><tr><td>蓝光光谱LED灯</td><td>Home Depot</td><td>GLP24FS/19W/LED</td><td>为飞虱取食的盆栽玉米植株提供生长光照</td></tr><tr><td>Cas9</td><td>TrueCut Cas9 Protein v2</td><td>A36498</td><td>用于切割飞虱基因的内切酶</td></tr><tr><td>透明乙烯基软管</td><td>Home Depot</td><td>3/8 英寸内径 × 1/2 英寸外径 × 10 英尺</td><td>连接真空抽吸装置中收集管与泵</td></tr><tr><td>玉米飞虱</td><td>北卡罗来纳州立大学</td><td>N/A</td><td>请向Anna Whitfield博士实验室申请获取</td></tr><tr><td>脱脂棉球</td><td>Genesee</td><td>51-101</td><td>在真空抽吸装置的收集管中用作过滤器/昆虫捕获装置</td></tr><tr><td>双面胶带</td><td>Scotch双面胶带</td><td>NA</td><td>用于固定显微注射用的卵</td></tr><tr><td>Early Sunglow 玉米</td><td>Park Seed Company</td><td>05093-PK-N</td><td>用于饲养飞虱的玉米品种</td></tr><tr><td>epTIPS 微量加样尖</td><td>Eppendorf</td><td>C2554691</td><td>用于后填充进样针的加样尖</td></tr><tr><td>Femtojet 显微注射系统</td><td>Eppendorf</td><td>5247</td><td>控制注射压力（根据针头孔径大小设定为12–20 psi）</td></tr><tr><td>Nutri-Fly 果蝇琼脂培养基</td><td>Genesee</td><td>66-103</td><td>除产卵皿外所有用途的基质</td></tr><tr><td>精细镊子</td><td>Bioquip</td><td>4731</td><td>用于卵的操作</td></tr><tr><td>通用型LE琼脂糖</td><td>Apex</td><td>20-102</td><td>产卵皿中的基质（产卵介质）</td></tr><tr><td>向导RNA 1 - GGUUCAUCGCAAAAUAGCAG</td><td>Synthego</td><td>CRISPRevolution sgRNA EZ试剂盒（1.5 nmol）</td><td>靶向飞虱 &lt;em&gt;white &lt;/em&gt;基因的RNA向导</td></tr><tr><td>向导RNA 2 - UCUGAAAUCACUGGCCAAUA</td><td>Synthego</td><td>CRISPRevolution sgRNA EZ试剂盒（1.5 nmol）</td><td>靶向飞虱 &lt;em&gt;white &lt;/em&gt;基因的RNA向导</td></tr><tr><td>向导RNA 3 - GAGGGCAGAGUCGCUUUCUU</td><td>Synthego</td><td>CRISPRevolution sgRNA EZ试剂盒（1.5 nmol）</td><td>靶向飞虱 &lt;em&gt;white &lt;/em&gt;基因的RNA向导</td></tr><tr><td>加湿器</td><td>Homedics</td><td>UHE-CM45</td><td>为加湿罩提供湿度环境</td></tr><tr><td>湿度培养箱</td><td>Billups-Rothenberg</td><td>MIC-101</td><td>用于孵化前存放已注射的胚胎</td></tr><tr><td>昆虫饲养笼</td><td>Bioquip（定制）</td><td>容量接近1450 L（前部为塑料材质，侧面为网状织物）</td><td>用于玉米植株上飞虱的饲养</td></tr><tr><td>激光拉针仪</td><td>Sutter Instruments</td><td>P-2000/G</td><td>用于制备显微注射针（加热温度 = 700，FIL = 4，VEL = 40，DEL = 170，PUL = 160）</td></tr><tr><td>Leica M165 FC 荧光体视显微镜</td><td>Leica</td><td>M165 FC</td><td>用于飞虱筛选</td></tr><tr><td>显微注射显微镜</td><td>Leica</td><td>MZ12-5</td><td>配备XY载物台的显微注射专用显微镜</td></tr><tr><td>显微操作器</td><td>Narishige</td><td>MN-151</td><td>用于定位显微注射针</td></tr><tr><td>微量移液管斜面研磨仪</td><td>Sutter Instruments</td><td>FG-BV10-D</td><td>用于研磨注射针斜面（使用“细”级研磨板，角度为20&amp;deg;）</td></tr><tr><td>显微镜载物台</td><td>AmScope</td><td>GT100 X-Y 滑动台</td><td>用于在显微镜下定位和移动胚胎</td></tr><tr><td>微型画笔</td><td>Testor #2 8733</td><td>三支装 281206</td><td>用于胚胎操作的精细画笔</td></tr><tr><td>注射针夹持器</td><td>Narishige</td><td>HI-7</td><td>用于固定显微注射针</td></tr><tr><td>Percival 培养箱</td><td>Percival</td><td>I41VLH3C8</td><td>用于饲养注射后的个体直至孵化</td></tr><tr><td>培养皿（100 × 15 mm）</td><td>VWR</td><td>89038-968</td><td>用于制作产卵用琼脂皿</td></tr><tr><td>pGEM-T Easy 载体系统I克隆试剂盒</td><td>Promega</td><td>A1360</td><td>用于克隆 &lt;em&gt;Pm white&lt;/em&gt; 靶位点</td></tr><tr><td>酚红</td><td>Sigma</td><td>143-78-8</td><td>显微注射缓冲液</td></tr><tr><td>普通显微镜载玻片或盖玻片</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-549-3</td><td>用于固定显微注射用的卵</td></tr><tr><td>质粒DNA中量提取试剂盒</td><td>Zymo</td><td>D4200</td><td>用于纯化可用于注射的质粒DNA</td></tr><tr><td>塑料石蜡膜</td><td>Pechiney Plastic Packaging</td><td>PM-996</td><td>卷装尺寸：4 英寸 × 125 英尺</td></tr><tr><td>保鲜膜</td><td>Glad ClingWrap 保鲜膜</td><td>NA</td><td>包裹整个产卵室</td></tr><tr><td>引物 - PmW CRISPR 检测 F1 - AAGGAATTTCTGGAGGTGAAA</td><td>IDT</td><td>25 nmole DNA 寡核苷酸</td><td>用于扩增 &lt;em&gt;Pm white&lt;/em&gt; 基因靶位点区域的第一轮引物</td></tr><tr><td>引物 - PmW CRISPR 检测 R1 - GATTCCTCGCTGTTGGGT</td><td>IDT</td><td>25 nmole DNA 寡核苷酸</td><td>用于扩增 &lt;em&gt;Pm white&lt;/em&gt; 基因靶位点区域的第一轮引物</td></tr><tr><td>引物 - PmW CRISPR 检测 F3 - TCACAGACCCTGGTGCTAATC</td><td>IDT</td><td>25 nmole DNA 寡核苷酸</td><td>用于扩增 &lt;em&gt;Pm white&lt;/em&gt; 基因靶位点区域的第二轮引物</td></tr><tr><td>引物 - PmW CRISPR 检测 R3 - GTCCACAATCCACACTTCTGA</td><td>IDT</td><td>25 nmole DNA 寡核苷酸</td><td>用于扩增 &lt;em&gt;Pm white&lt;/em&gt; 基因靶位点区域的第二轮引物</td></tr><tr><td>石英毛细管</td><td>Sutter Instruments</td><td>QF100-50-10</td><td>用于制作显微注射针（外径1 mm，内径0.7 mm，长度10 cm）</td></tr><tr><td>筛网（白色欧根纱织物）</td><td>Joann Fabrics</td><td>16023889</td><td>用于覆盖成虫容器</td></tr><tr><td>Sparkleen 清洁剂</td><td>Fisher Scientific</td><td>04-320-4</td><td>用于清洗器皿</td></tr><tr><td>蔗糖</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP220-1</td><td>用于配制10%蔗糖溶液</td></tr></tbody></table>

玉米叶蝉（peregrinus maidis）胚胎的显微注射用于crispr/cas9基因组编辑

Microinjection of Corn Planthopper, Peregrinus maidis, Embryos for CRISPR/Cas9 Genome Editing

玉米叶蝉 Peregrinus maidis 是&#160;玉米的一种害虫，也是多种玉米病毒的传播媒介。先前发表的方法描述了在 P. maidis 通过向若虫和成虫显微注射双链RNA（dsRNAs）实现。尽管RNAi技术具有强大功能，但通过该方法产生的表型是 transient 的，且不具有长期的孟德尔遗传特性。因此， P. maidis 工具箱需要扩展以包含功能基因组学工具，从而能够产生稳定的突变品系，为研究人员针对这一具有重要经济意义的害虫开发新的防控方法提供可能。然而，与用于RNA干扰的dsRNA不同，基于CRISPR/Cas9的基因组编辑和种系转化所使用的组分难以穿过细胞膜。因此，必须在胚胎细胞化之前将质粒DNA、RNA和/或蛋白质显微注射到胚胎中，使得注射时机成为成功的关键因素。为此，已开发出一种基于琼脂糖的产卵方法，以便从 P. maidis 以相对较短的时间间隔采集雌性个体。本文提供了收集和显微注射合子期前胚胎的详细方案 P. maidis 将胚胎与CRISPR组分（已与引导RNA形成复合物的Cas9核酸酶）共同孵育，以及基于Cas9的基因敲除结果 P. maidis 眼色基因， 白色，现予以介绍。尽管这些方案描述了CRISPR/Cas9基因组编辑在 P. maidis，它们也可用于产生转基因生物 P. maidis 通过简单改变注射溶液的成分，即可实现种系转化。

P. maidis 雌虫在产卵时需要摄食，产卵室经过专门设计，可让其在保护性介质中产卵，同时便于回收卵。利用该方法，可回收到足量的合子期前胚胎，用于DNA、RNA和/或蛋白质的显微注射。成年P. maidis 雌虫通常将卵产在玉米植株的叶片组织内，这使得在短时间内获取足够数量的卵具有挑战性，因为需要进行大量的叶片解剖。人工产卵环境为克服这些问题提供了有效解决方案。如表1所示，在4周内共从645只雌虫收集到6,483枚卵。雌虫通常在第2天开始产卵，第4至第6天为产卵高峰期。到第9天时，产卵活动逐渐减缓。每个产卵室均在周五设置，并从周日开始至下一周的周日每天检查卵的产出情况。按照此时间安排，可在工作日内收集到大部分卵，便于开展显微注射实验。
该产卵系统首次实际应用是利用Cas9介导的基因敲除来测试其有效性 P. maidis 眼色基因的直系同源物， 白色 (Pmw) 作为靶标。Pmw 中的突变 白色 已知在其他昆虫物种中会导致显著的眼部色素丧失，且White基因具有细胞自主性，因此可在注射个体中直接检测到突变表型。16,17为了提高即使是很小的突变也可能导致功能丧失的概率，设计的向导RNA靶向切割ATP结合盒区域，该区域对White蛋白功能至关重要16. P. maidis 胚胎分别注射了20%酚红（注射缓冲液）或含有Cas9（终浓度为800 ng/μL）的注射缓冲液µL （Cas9对照），或在注射缓冲液中加入Cas9及三种向导RNA，浓度为400 ng/µL 每个。将三种引导RNA组合于同一注射混合物中，旨在通过产生大片段缺失以及弥补单个引导RNA可能无法有效切割的风险，进一步提高突变体产生的几率。各处理组的发育速率相当（表 2），注射个体中有50-60%表现出发育迹象。缓冲液对照组和Cas9对照组的孵化率也相近；然而，接受三向导RNA混合物注射的个体孵化率相对较低。目前尚不清楚存活率降低是否是由于基因缺失所致 白色 功能或三向导混合物非预期后果的结果，例如脱靶效应（见讨论部分）。然而，所有完全丧失眼色素的个体中均未发现即，完全敲除）孵化，且注射个体的后代均未出现白眼表型。Cas9介导的基因突变的靶向效率通过两种方式验证：首先，对注射后的个体进行眼色素缺失表型的筛选。
在71只注射了向导RNA后发育的个体中，有23只表现出不同程度的色素缺失（图10），其中9只成功孵化，敲除率≥32%。在两种对照处理中均未观察到眼色素的缺失。其次，通过聚合酶链式反应（PCR）18和测序19确认了染色体突变。由于未能获得稳定的突变品系，因此从注射了三向导RNA混合物或缓冲液的胚胎池中提取基因组DNA进行分析。预期三向导RNA混合物可从white基因座中删除约180个碱基对。这一结果可通过从注射个体中分离的基因组DNA扩增出的PCR产物及其相应的测序数据观察到（图11）。这些综合证据表明，胚胎在细胞化发生之前即已被注射。 
<img alt="真空过滤装置：真空泵、塑料管、15 mL离心管、用于液体过滤的棉球。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62417/62417fig01.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图1"> 
图1吸液器 一种有效的吸液器可通过将真空泵经塑料管连接到15 mL塑料锥形管的入口处组装而成。应小心地从锥形管底部移除约0.5 cm部分。在锥形管内、塑料管开口上方放置一团棉花，以捕获 P. maidis 将收集到的成虫与真空泵隔离，避免接触。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62417/62417fig01large.jpg" target="_blank">请点击此处以查看此图的放大版本。</a>
<img alt="使用滤膜和密封装置自制空气采样器；逐步构建过程。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62417/62417fig02.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图 2"> 
图 2：成虫饲养容器的构建。（A）所需材料（从左上角顺时针方向）：筛网、热熔胶枪、剃刀刀片、1 oz 容器。（B）应在 1 oz 容器底部切出一个大孔，并裁剪一块刚好能覆盖该孔的方形筛网。（C）然后使用热熔胶将筛网粘合在孔上。（D）待胶水固化后，应去除多余的网片。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62417/62417fig02large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="性别二态性示意图；带有标记的雄性和雌性昆虫腹部及产卵器。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62417/62417fig03.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图3"> 
图3：P. maidis 成虫的性别鉴定。图中显示了 P. maidis 成虫的雄性（左）和雌性（右）腹面。雌虫腹部可见的产卵器是判断个体性别的最明显特征。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62417/62417fig03large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="聚合物防水处理，柔性薄膜疏水性测试；实验装置，水接触角。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62417/62417fig04.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图 4"> 
图 4：将成虫密封入容器中。（A）一块 5 cm × 5 cm 的塑料石蜡膜。（B）应将该膜均匀拉伸至原始尺寸的 3–4 倍。（C）将成虫放入成虫容器后，应将拉伸后的膜覆盖在容器开口上以固定成虫。随后在膜上放置一滴 400 µL 的 10% w/v 蔗糖溶液。（D）为给成虫提供足够的摄食压力，应取另一块 5 cm × 5 cm 的塑料石蜡膜，同样拉伸后覆盖在蔗糖液滴上。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62417/62417fig04large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="用于产卵实验的昆虫培养皿装置示意图，包含石蜡膜层和蔗糖喂养设置。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62417/62417fig05.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图 5"> 
图 5：产卵培养皿的组装方法。（A）所需材料（从左上角顺时针方向）：塑料封口膜、已装有成虫的成虫饲养容器、含1%琼脂糖的培养皿（产卵基质）。（B）应将成虫饲养容器放置在琼脂糖表面，并在产卵基质上直接覆盖一层塑料封口膜/10%蔗糖“三明治”结构。（C）使用塑料封口膜将成虫饲养容器固定在产卵基质上，以防止基质过快干燥。（D）操作时应注意避免遮挡成虫饲养容器的通气网面，以确保空气交换可继续进行。（E）产卵培养皿的结构示意图。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62417/62417fig05large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="用于实验室光学分析的显微镜装置；包括带有照明系统的体视显微镜。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62417/62417fig06.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图6"> 
图6：加湿罩。 在注射显微镜周围设置了一个配备加湿器的罩子，以减少空气流动，并在操作胚胎时维持湿度。工作人员进入后可将罩子的挡板折叠覆盖入口，以帮助维持适当的湿度水平。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62417/62417fig06large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="胚胎放置过程；显微镜图像显示镊子、产卵培养基和盖玻片的使用。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62417/62417fig07.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Figure 7"> 
图7：收集胚胎以准备显微注射。（A）已沉积在产卵培养基中的胚胎。使用一对精细镊子将胚胎从培养基中取出，并放置在其表面。（B）一块尺寸为1 mm × 15 mm的双面胶条，贴于22 mm × 30 mm的盖玻片上。（C）可将盖玻片置于产卵培养基上，以便将胚胎从培养基表面转移至盖玻片上的胶条处。（D）P. maidis 胚胎呈香蕉形，一端较窄，另一端较宽（示例胚胎中，窄端以红色箭头指示，宽端以黄色箭头指示）。胚胎的宽端应贴附于胶条上。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62417/62417fig07large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="用于发育生物学研究的胚胎显微注射装置，包含注射针、琼脂平台和盖玻片。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62417/62417fig08.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图8"> 
图8：注射。（A）注射平台是一个装满1%琼脂的培养皿。用于固定胚胎的带有胶带条的盖玻片应直接放置在注射平台表面。（B）在对胚胎进行注射前，应通过将少量注射溶液注入水滴中来测试注射压力。此方法也可在注射过程中的任何时间用于检查针头是否堵塞。（C）应将注射针插入胚胎较大的一端进行注射。若注射成功，应可观察到注射溶液进入胚胎。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62417/62417fig08large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="含琼脂和盖玻片的培养皿装置；干燥实验舱。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62417/62417fig09.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Figure 9"> 
图9：显微注射后的护理。（A）当盖玻片上的所有胚胎完成显微注射后，应将该盖玻片放入一个新的含有1%琼脂糖的培养皿中。（B）随后可将带有盖玻片的培养皿置于湿度培养箱（如图所示）中，直至胚胎孵化。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62417/62417fig09large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="显示解剖学差异和特征的幼虫与成虫显微图像，插图突出显示细节。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62417/62417fig10.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图10"> 
图10：Pmw 基因敲除表型。（A）同龄对照组与（B）Pmw 基因敲除胚胎，黑色箭头指示发育中的眼睛。图 B 中的胚胎呈嵌合状态，可见一条小范围的色素条带。（C）同龄对照组与（D）Pmw 基因敲除孵化幼体，插图显示眼睛的不同观察角度。图 D 中的孵化幼体同样为嵌合体。主图中白色箭头指向色素缺失区域。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62417/62417fig10large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="基因编辑；DNA序列分析；电泳结果；突变鉴定；遗传学研究" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62417/62417fig11.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图11"> 
图11: Pmw 敲除序列 (A按比例模型 Pmw mRNA，以500 bp为间隔标记，并标示gRNA结合位点的位置：G1，蓝色；G2，黄色；G3，粉色。在此处产生的任何移码突变都将破坏大部分翻译产物。B) gRNA 位点的基因组上下文，均位于单一外显子内（加粗大写文本）。引导序列结合位点以与上文相同的颜色高亮显示 A，PAMs 用下划线标出。跨度约为 300 bp。外显子的框内翻译以大写单字母缩写形式显示在上方。两种眼色素转运蛋白特异性的基序已标出。Walker B 功能域的 CDEPT 基序用紫色框标出，H-loop 结构域的 IHQP 基序用绿色框标出。这两个结构域对 ATP 转运蛋白功能至关重要。C）该 Pmw 通过两轮PCR扩增目标区域。第二轮PCR产物通过凝胶电泳检测，以观察因成功移除向导序列间区域而产生的大小偏移。泳道：L = 100 bp DNA标记；1 = PCR水阴性对照；2 = 注射缓冲液的卵；3–4 = 两组分别注射三种向导RNA混合物的卵。只有接受三种向导RNA混合物的胚胎同时出现野生型条带（红色箭头）和完全切除后的条带（白色箭头）。D为了确认下方条带（白色箭头）的身份，对该DNA进行纯化、克隆并测序。第一行为野生型序列，其余两行为两个克隆的序列。另有三个克隆与底部序列一致。蓝色高亮显示Guide 1的结合位点，粉色高亮显示Guide 3的结合位点。在两个等位基因中，这两个引导序列之间的整个区域均已被删除。缩写： Pmw = Peregrinus maidis 白色型 基因；gRNA = 向导RNA；PAM = 原间隔序列邻近基序；ATP = 三磷酸腺苷；PCR = 聚合酶链式反应；WT = 野生型；KO = 基因敲除 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62417/62417fig11large.jpg" target="_blank">请点击此处以查看此图的放大版本。</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td rowspan="2">组别</td>
			<td rowspan="2">杯数</td>
			<td rowspan="2">每杯雌虫数量</td>
			<td colspan="8">产卵数</td>
			<td rowspan="2">总产卵数</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>第2天</td>
			<td>第3天</td>
			<td>第4天</td>
			<td>第5天</td>
			<td>第6天</td>
			<td>第7天</td>
			<td>第8天</td>
			<td>第9天</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1</td>
			<td>10</td>
			<td>15</td>
			<td>0</td>
			<td>26</td>
			<td>166</td>
			<td>355</td>
			<td>530</td>
			<td>193</td>
			<td>91</td>
			<td>37</td>
			<td>1398</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2</td>
			<td>15</td>
			<td>15</td>
			<td>22</td>
			<td>238</td>
			<td>489</td>
			<td>699</td>
			<td>520</td>
			<td>379</td>
			<td>203</td>
			<td>58</td>
			<td>2608</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3</td>
			<td>8</td>
			<td>15</td>
			<td>0</td>
			<td>57</td>
			<td>230</td>
			<td>190</td>
			<td>116</td>
			<td>80</td>
			<td>34</td>
			<td>1</td>
			<td>708</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4</td>
			<td>10</td>
			<td>15</td>
			<td>0</td>
			<td>226</td>
			<td>446</td>
			<td>519</td>
			<td>301</td>
			<td>179</td>
			<td>24</td>
			<td>15</td>
			<td>1710</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>总计</td>
			<td>43</td>
			<td>15</td>
			<td>23</td>
			<td>547</td>
			<td>1331</td>
			<td>1763</td>
			<td>1467</td>
			<td>831</td>
			<td>352</td>
			<td>111</td>
			<td>6483</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表1：人工产卵环境中的代表性卵收集结果。 显示了四组卵收集杯的数据，卵的数量统计从设置后的第二天开始，持续到第九天。
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>注射处理</td>
			<td>总注射数</td>
			<td>总发育数</td>
			<td>总孵化数</td>
			<td>发育率 (%)</td>
			<td>孵化率 (%)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>缓冲液</td>
			<td>39</td>
			<td>20</td>
			<td>12</td>
			<td>51</td>
			<td>31</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cas9</td>
			<td>39</td>
			<td>24</td>
			<td>14</td>
			<td>61</td>
			<td>36</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cas9 +Pmw gRNA</td>
			<td>121</td>
			<td>71</td>
			<td>28</td>
			<td>59</td>
			<td>28</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表2：三种不同注射混合物的注射后存活率和基因敲除率。

本文提供了用于采集和显微注射玉米叶蝉的合子前胚胎的实验方案，旨在通过基于CRISPR/Cas9的基因组编辑技术对其基因组进行修饰，或通过种系转化插入带有标记的转座元件。

玉米叶蝉（Peregrinus maidis）胚胎的显微注射用于CRISPR/Cas9基因组编辑

玉米叶蝉（Peregrinus maidis）是一种玉米害虫，也是多种玉米病毒的传播媒介。已有文献报道的方法描述了……

迄今为止，CRISPR 技术仅在少数半翅目昆虫中得到应用。本文所述的实验方案可帮助研究人员在其他半翅目物种中应用 CRISPR 技术及种系转化。该方案专为对干燥敏感的昆虫胚胎而开发。该方案中的许多步骤有望在其他昆虫物种中改善实验结果。能够创制转基因飞虱为新型防控方法开辟了道路，例如培育无法再传播病毒的昆虫。该技术将对研究其他害虫（如西方花蓟马）的基因功能产生革命性影响。我们已将这种CRISPR技术成功应用于蓟马胚胎，并取得了令人鼓舞的结果。我们发现，在该系统中进行实践操作对于成功至关重要。若能常规实施本文所述方法，应可在多种实验条件下实现灵活应用。为了制作一个用于容纳成年玉米蚜（Peregrinus maidis）昆虫的饲养室，需在一只一盎司容量的杯子底部打一个孔，并在孔上粘贴筛网以实现空气交换。在选择一周龄成年雌性昆虫时，先用吸虫器将种群转移至15毫升锥形管中静置一小时，随后将昆虫短暂置于冰上冷却。通过观察腹部腹面是否存在产卵器来鉴别雌性个体，产卵器通常比腹部其余部分颜色更深。将收集到的雌性个体转移至杯中。当挑选出15只雌性个体后，用一块5 cm × 5 cm的石蜡膜密封杯口。在膜上加入400 µL的10%蔗糖溶液，然后将另一块5 cm × 5 cm的石蜡膜覆盖在溶液上方。将成虫培养室置于装有产卵培养基的卵收集皿上，确保塑料石蜡膜一侧直接接触产卵培养基，并用塑料保鲜膜包裹整个产卵室，注意不要覆盖通气孔。随后，将培养室置于25°C、70%湿度、14小时光照/10小时黑暗的条件下。进行胚胎收集时，在所需的产卵时间段结束后，取一条尺寸为1 × 15 mm的双面胶带，粘贴至一块22 × 30 mm的盖玻片上，然后将该盖玻片放置于产卵室的产卵培养基表面。使用细毛刷和解剖显微镜，将单个半透明的胚胎从琼脂表面转移到双面胶带上。当挑选出约25个胚胎后，将香蕉形的胚胎侧向排列，使其较粗的一端粘附在胶带上。进行胚胎显微注射前，首先在加湿培养罩内的解剖显微镜下，将盖玻片放置于盛有1%琼脂的100 mm × 15 mm培养皿中，使盖玻片表面与琼脂齐平。为检查注射压力，将石英注射针的针尖放入一滴水中，并启动注射循环。确认压力设置后，从盖玻片左侧开始，将针插入一个胚胎较大的一端。将注射溶液注入卵内，然后迅速抽出针头。所有卵注射完成后，将盖玻片放置于新的1%琼脂培养皿表面，并将培养皿放入湿度孵育盒中。六天后，使用洁净水和细刷将存活的胚胎转移至含有湿润滤纸的35 mm × 10 mm培养皿中。用塑料封口膜密封培养皿，并将孵化盒置于25 °C恒温培养箱中。 孵化后六到八天，使用细毛刷将新孵化的一龄若虫转移到装有叶片碎片的培养皿中，并用塑料封口膜密封培养皿。在25摄氏度条件下培养48小时后，用细毛刷将所有两天龄的若虫转移至含有玉米植株的饲养笼中。若获得具有明显表型的注射个体且数量充足，应将这些昆虫单独饲养，以最大化下一代中目标性状的获得率。在适当的温度和湿度条件下饲养昆虫，并根据需要定期将其转移到新鲜的玉米植株上，同时定期筛选后代中预期的表型，将表现出目标表型的个体单独放入笼中，以建立纯合品系。在此代表性分析中，四周内共从645只雌虫收集到6,483枚卵。雌虫通常在两天后开始产卵，在第4至第6天产下大部分卵，到第9天时产卵活动逐渐减缓。Cas9九次注射不影响P.maidis的发育，因为注射缓冲液、添加Cas9的注射缓冲液以及添加Cas9和三种向导RNA的注射缓冲液处理的胚胎发育速率相似。缓冲液组和Cas9对照组的孵化率也相似。然而，接受三种向导RNA混合物的个体孵化率通常相对较低。在此代表性实验中，71例注射了向导RNA的发育个体中，有23例表现出不同程度的色素缺失，其中9例成功孵化，敲除率约为30%。三向导RNA混合物预计可从white基因座中删除约180个碱基对，该结果在从注射个体中分离的基因组DNA扩增出的PCR产物及其相应的测序数据中均得到证实。我们建议使用斜面针头以尽量减少注射造成的创伤。若发现胚胎在注射后出现泄漏现象，请检查针头尖端以获得更佳效果。持续练习可提高胚胎存活率。迄今为止，尚无关于半翅目昆虫种系转化的公开报道。然而，我们已利用本方案成功构建了表达Cas9的飞虱品系。总体而言，对半翅目昆虫进行种系转化的能力为多种遗传性害虫管理策略开辟了道路，从而减少杀虫剂的使用。

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