使用染色质免疫沉淀测序方法对中国稻瘟菌Magnaporthe oryzae进行全基因组组蛋白修饰分布分析

该方法有助于阐明在植物病理学中，通过表观遗传修饰调控候选靶基因的分子机制。染色质免疫沉淀测序技术能够高效检测全基因组中与组蛋白和转录因子相互作用的DNA片段。与其他方法相比，该技术可提高检测效率和分辨率。

使用100微升移液器，向燕麦番茄琼脂平板中加入100微升液体完全培养基。用接种环刮取野生型菌株和敲除菌株的菌丝体，收集菌丝体碎片并转移至250毫升液体完全培养基中。

用500毫升0.7摩尔氯化钠溶液清洗真菌菌丝。然后收集真菌菌丝体并称重。每1克真菌菌丝体加入约1毫升裂解酶渗透溶液。

将菌丝置于28摄氏度下振荡处理3至4小时，转速为150 RPM。用50毫升0.7摩尔氯化钠溶液洗涤处理后的菌丝。离心样品并小心弃去上清液。

将原生质体重新悬浮于20毫升0.7摩尔氯化钠溶液中。向含有原生质体的2毫升氯化钠缓冲液中逐滴加入55微升37%甲醛，进行交联，直至终浓度为1%。为淬灭未反应的甲醛，向每管中加入20微升10倍甘氨酸。离心后小心弃去上清液。

将沉淀物重悬于1毫升0.7摩尔氯化钠溶液中。离心后小心弃去上清液，再将沉淀物重悬于750微升RIPA裂解缓冲液中。加入37.5微升20倍蛋白酶抑制剂。

使用超声波均质器对染色质进行超声剪切，持续八分钟。样品经超声破碎后，取部分样品作为输入（input），其中包含超声处理后释放的所有DNA和蛋白质。为分析DNA片段的长度，超声处理后进行1%琼脂糖凝胶电泳。

离心后，将离心所得上清液转移至1.5毫升离心管中，并于-80°C保存备用。在进行免疫沉淀（IP）实验前，用1倍RIPA缓冲液将每份染色质样品按1:10的比例稀释。用移液器将50 µL超顺磁性蛋白磁珠加入2毫升离心管中。

将离心管置于磁力架上，使磁珠沉淀，然后移除上清液。向离心管中加入一毫升预冷的1倍RIPA缓冲液，洗涤超顺磁性蛋白珠三次。

将离心管置于磁力架上，移除上清液。向每根离心管中加入100 µL 1× RIPA缓冲液。向离心管中加入30 µL染色质样品、100 µL超顺磁性蛋白磁珠和4 µL H3K4me3抗体，充分混匀。

将样品置于旋转摇床上，在4°C、30 × g 条件下孵育过夜。通过将磁性蛋白珠-抗体-染色质复合物重新悬浮于1 mL 1× RIPA缓冲液中，洗涤该复合物。随后用1 mL低盐免疫复合物洗涤缓冲液洗涤样品，再用1 mL高盐免疫复合物洗涤缓冲液洗涤。最后用1 mL氯化锂缓冲液冲洗磁珠，并去除上清液。

然后向离心管中加入1毫升TE缓冲液。再次将离心管中加入1毫升TE缓冲液，并用移液器吸除上清液。向每个离心管中加入100微升洗脱缓冲液。

在65摄氏度下进行洗脱，持续15分钟。在4摄氏度下以10,000 ×g离心1分钟，收集上清液至新的离心管中。向所有管中加入8 µL 5 M氯化钠，于65摄氏度孵育4至5小时或过夜，以逆转DNA与蛋白质的交联。

加入1 µL RNase A，37 °C孵育30分钟。向每管中加入4 µL蛋白酶K，在45 °C孵育1至2小时。向离心管中加入550 µL酚-氯仿-异戊醇混合液。

在10,000 × g条件下离心15分钟，吸除上清液。向管中加入1/10体积的3摩尔乙酸钠溶液、2.5体积的无水乙醇以及3微升的糖原。将样品置于负20摄氏度冰箱中过夜，以进行沉淀。

第二天，离心试管并弃去上清液。用1毫升新配制的75%乙醇在10,000 × g条件下洗涤沉淀3次。加入50 µL无菌去离子水以充分溶解沉淀。使用DNA末端修复试剂盒并按照文稿中所述说明对DNA末端进行修复，以生成平末端DNA。

为了在三端添加腺嘌呤碱基，将30微升DNA、2微升水、5微升10倍Taq缓冲液、10微升1毫摩尔dATP以及3微升Taq DNA聚合酶加入一个0.2毫升PCR离心管中。混合后，在PCR仪中于72摄氏度反应10分钟。通过将10微升DNA、9.9微升水、2.5微升T4 DNA连接酶缓冲液、0.1微升接头寡核苷酸混合物以及2.5微升T4 DNA连接酶加入一个0.2毫升PCR离心管中，进行接头连接反应。

将试管在16摄氏度下孵育四小时。为使用PCR引物扩增DNA，向一个0.2微升PCR离心管中加入10.5微升DNA、12.5微升两倍高保真预混液、1微升PCR引物PE 1.0和1微升PCR引物PE 2.0，并充分混匀。

mobre2、mospp1 和 moswd2 缺失突变体在其功能靶区域的 H3K4me3 信号显著降低。与野生型菌株 P131 相比，mobre2、mospp1 和 moswd2 缺失突变体中富集的 H3K4me3 染色质免疫沉淀测序读段信号大幅减少。按照此流程，可进一步进行芯片杂交（chip on chip）和芯片定量 PCR（chip qPCR）分析。

它们通常用于筛选蛋白质的下游靶基因，并在已知的基因组结合位点处研究蛋白质与DNA的相互作用。