使用麦格纳波特奥里扎伊的色度免疫沉淀测序方法对希斯通修饰分布进行全基因组分析
June 2nd, 2021
在这里，我们提出了一个协议，以分析全基因组分布的色石修改，它可以识别新的目标基因在M.oryzae和其他丝状真菌的发病机制。
这种方法可以帮助阐明在植物病理学真菌发病过程中通过表观遗传修饰调节候选目标基因的分子机制。色度素免疫沉淀测序技术可以有效地检测与整个基因组中的组织素和转录因子相互作用的DNA片段。与其他方法相比，它可以提高效率和分辨率。
首先，使用100微升移液器在燕麦番茄阿格尔板中加入100微升液体完全介质。使用接种循环，刮野生类型菌株和淘汰菌株的肌膜。收集肌裂碎片，并将其转移到250毫升的液体完全介质。
用500毫升0.7摩尔氯化钠溶液清洗真菌水眠。然后收集真菌真菌，并称量它。每克真菌肌塞添加约一毫升裂解酶渗透溶液。
将水眠放在28摄氏度下三到四个小时，在150 RPM处摇晃。用50毫升0.7摩尔氯化钠溶液清洗切片水眠。将样品离心，小心丢弃超高纳特。
将前列座重新悬挂在 20 毫升 0.7 摩尔氯化钠溶液中。加入55微升37%甲醛滴到两毫升氯化钠缓冲器含有前列腺素的交叉连接，直到最终浓度为1%以淬火未反应的甲醛，在每根管子中加入20微升10倍甘油。离心后小心丢弃超高纳特。
将颗粒重新悬挂在 0.7 摩尔氯化钠溶液的一毫升中。离心后小心丢弃超高纳特，并将颗粒重新悬挂在 RIPA 缓冲器的 750 微升中。加入37.5微升20倍蛋白酶抑制剂。
使用超声波同质化器通过声波剪切染色素8分钟。样品被超声波分解后，取出部分样品作为输入，其中包含样品被声波化后释放的所有DNA和蛋白质。要分析DNA片段的长度，在声波化后运行1%的玫瑰凝胶电泳。
离心后，将离心超离心剂转移到1.5毫升离心机管中，并储存在负80摄氏度下供以后使用。在进行 IP 实验之前，用 RIPA 缓冲器的一倍将每个染色质样本稀释为 1 比 10。派佩特50微升的超级准磁蛋白珠成两毫升离心机管。
将管子放在磁架上，让磁珠沉淀。然后取出超那剂。在管子中加入一毫升预冷的 RIPA 缓冲器，并洗三次超级准磁蛋白珠。
将管子放在磁架上，取出超高分子。在每个管子中加入 100 个 1 倍 RIPA 缓冲器的微升。在管中加入30微升染色素样品、100微升超准磁蛋白珠和4个H3K4me3抗体微升，混合均良好。
将样品放在旋转摇床上，在摄氏4度、30倍G.的高温下在一夜之间孵育它们。 通过将珠子重新悬浮在一毫升的RIPA缓冲器中，洗净超级准磁蛋白珠抗体和染色质复合物。用一毫升低盐免疫复合洗涤缓冲器清洗样品，然后用一毫升高盐免疫复合洗涤缓冲器清洗样品。用一毫升氯化锂缓冲器冲洗珠子，取出超高分子。
然后在管子中加入一毫升的 TE 缓冲器。再次用一毫升的TE缓冲器放置管子，用移液器取出超强的管子。在每个离心机管中加入100微升的弹性缓冲器。
在65摄氏度下进行15分钟的放射。离心机在摄氏1万倍时在4摄氏度下离心一分钟，并将超高离心剂收集到新的离心机管中。在所有管子中加入8个5摩尔氯化钠的微升，在65摄氏度下孵育4至5小时或过夜，以扭转DNA蛋白的交叉联系。
加入一微升Rnase A，在37摄氏度下孵育30分钟。在每个管子中加入四微升蛋白酶K，在45摄氏度下孵育一至两个小时。在离心机管中加入550微升的氯甲酸酯和同酰醇混合物。
离心机 15 分钟， 10， 0 倍 G， 并吸气超纳特。在管中加入1/10卷三摩尔醋酸钠溶液、2.5卷绝对乙醇和三微升糖原。将样品放在负20摄氏度的冰箱中过夜，以便降水。
第二天，离心管并丢弃超纳特。用一毫升新鲜制备的75%乙醇用1万倍G.添加50微升无菌去离子水，以充分溶解沉淀物，将颗粒清洗三次。修复DNA端，使用DNA端修复套件生成钝端DNA，并在文本手稿中提及的说明。
要在三个主要端添加腺苷基，在 0.2 微升 PCR 离心机管中加入 30 微升 DNA、2 个水微升、5 个 10 倍 Taq 缓冲器、1 个 1 毫摩尔 dATP 微升和 3 个 Taq DNA 聚合酶微升。混合它们，在 72 摄氏度的 PCR 机器中反应 10 分钟。通过将 10 微升 DNA、9.9 微升水、2.5 微升 T4 DNA 韧带缓冲器、0.1 微升适配器寡头混合和 2.5 微升 T4 DNA 利加在 0.2 微升 PCR 离心机管中混合，执行链接器结结。
在16摄氏度下孵育管子4小时。要使用 PCR 引数放大 DNA，添加 10.5 微升 DNA，12.5 微升的两倍高保真主组合。PCR 引引器 PE 1.0 的微升和 PCR 引漆 PE 2.0 到 0.2 微升 PCR 离心机管的微升，混合良好。
mobre2、mospp1 和 moswd2 删除突变体的 H3K4me3 信号在其功能目标区域显著减少。与野生型菌株P131相比，富集H3K4me3染色质免疫沉淀测序的信号在mobre2、mospp1和moswd2中读取，删除突变体的信号大为减少。在此程序之后，可以执行芯片上的芯片和芯片 qPCR。
它们通常用于筛选蛋白质的下游目标基因，并在已知的基因组结合点研究蛋白质DNA相互作用。
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概述
本文介绍了一种用于分析曲谷菌和其他丝状真菌中组蛋白修饰的全基因组分布的协议。该方法旨在阐明通过真菌致病过程中的表观遗传修饰调控候选目标基因的分子机制。
关键研究组成部分
科学领域
- 真菌致病学
- 表观遗传学
- 基因组分析
背景
- 组蛋白修饰在基因调控中起着至关重要的作用。
- 了解这些修饰可以识别与疾病相关的新目标基因。
- 染色质免疫沉淀测序（ChIP-seq）是此类分析的强大工具。
- 像曲谷菌这样的真菌病原体影响植物健康和产量。
研究目的
- 分析丝状真菌中的组蛋白修饰。
- 识别与真菌致病相关的新目标基因。
- 提高对植物病原体表观遗传调控的理解。
使用的方法
- 染色质免疫沉淀测序技术。
- 燕麦番茄Agger平板的制备。
- 野生型和敲除株的接种。
- 将菌丝体收集并转移到液体完全培养基中。
主要结果
- 高效检测与组蛋白相互作用的DNA片段。
- 与其他方法相比，分辨率和效率有所提高。
- 在曲谷菌中识别候选目标基因。
- 对真菌致病过程中的表观遗传调控有新的认识。
结论
- 该协议增强了对组蛋白修饰的理解。
- 为未来对真菌病原体的研究提供了框架。
- 在植物病理学和疾病管理方面的潜在应用。
常见问题
Executive Industry Relevance
Understanding epigenetic regulation of virulence genes in fungal pathogens like Magnaporthe oryzae provides mechanistic insights for target validation in antifungal discovery. Genome-wide mapping of histone modifications enables hypothesis testing of epigenetic drivers of pathogenesis, supporting predictive confidence in target selection. This approach aids in de-risking early-stage programs by linking chromatin states to functional gene expression in disease-relevant systems.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Interrogates therapeutic hypotheses by linking histone methylation patterns to functional target genes in fungal pathogenesis.
- Operational Value: Enables biological de-risking through genome-wide resolution of chromatin modifications associated with virulence.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Prepares validated biological systems for downstream screening by identifying epigenetically regulated target loci.
- Operational Value: Supports assay standardization through reproducible ChIP-seq workflows for histone modification profiling.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Connects epigenetic modifications to disease relevance in filamentous fungi, informing translational biomarker alignment.
- Operational Value: Facilitates preclinical continuity by providing a platform for mechanistic de-risking of antifungal targets.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from target identification to lead optimization by delivering epigenetic context for gene regulation in pathogens.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification through genome-wide histone modification mapping.
- Screening: Enhances assay readiness by defining epigenetically active genomic regions for compound screening.
- Analytics: Generates quantitative ChIP-seq readouts that enable comparison of histone enrichment across strains and conditions.
- Translational Research: Links epigenetic states to phenotypic outcomes in fungal pathogenesis, supporting risk-adjusted advancement.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for epigenetic profiling across filamentous fungi in antifungal programs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence in target validation through mechanistic insight into epigenetic regulation of virulence genes.
- Operational Value: Standardization and scalability of chromatin profiling for cross-project consistency.
- Strategic Value: Improved go/no-go decisions by reducing biological uncertainty in target selection.
- Portfolio Impact: Risk-adjusted prioritization of targets based on epigenetic evidence of functional relevance.
Implementation Considerations
- Requires expertise in fungal culture, chromatin preparation, and sequencing library preparation.
- Depends on access to sonication, immunoprecipitation, and high-throughput sequencing infrastructure.
- Necessitates cross-team standardization of protocols for histone modification analysis across strains.
- Involves adaptation considerations for different fungal species and antibody validation for histone marks.
- Includes practical limitations such as antibody specificity and chromatin shearing efficiency affecting data quality.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:04
Introduction
0:39
Preparation of Protoplasts from M. oryzae
1:48
In Vivo Crosslinking and Sonication
3:22
IP of Crosslinked Protein/DNA
4:23
Collecting and Rinsing the IP Products
5:04
Elution and Reverse Crosslinking of Protein/DNA Complexes
5:56
Purification and Recovery of DNA
6:51
DNA Repair and Solexa Library Construction
8:23
Results: Chromatin Immunoprecipitation Sequencing Method for Genome-wide Histone Modification Analysi
8:53
Conclusion
