利用尺寸排阻色谱分析细菌外膜囊泡的异质性

尺寸排阻色谱法是一种用于分离大小不均一的细菌囊泡亚群以及去除细菌上清液中核酸和蛋白质的有效方法。与其他分离技术（包括密度梯度超速离心法）相比，尺寸排阻色谱法成本更低、速度更快且可重复性更高。我们已利用伴放线聚集杆菌（A.actinomycetemcomitans）囊泡验证了该方法的潜力，但预计该方法也可适用于其他大小不均一的细菌囊泡群体。

务必对所有缓冲液和珠子溶液进行充分脱气，并缓慢移液，避免引入气泡，同时移液速度需足够快，以确保珠子均匀沉降而不会干燥。开始时，用玻璃棒混匀凝胶过滤介质的储存瓶，将足以填满层析柱体积外加约50%过量的介质倒入玻璃瓶中。静置使珠子沉降，然后倾去上清液。

将珠子重悬于洗脱缓冲液中，得到终浓度约为70%凝胶和30%缓冲液的溶液，并在真空条件下脱气。将层析柱垂直固定在铁架台上，先用洗脱缓冲液充满层析柱以润湿管壁，然后排出缓冲液至仅剩约1厘米高度。随后，小心地用移液器将凝胶珠加入层析柱中，同时持续排出多余的缓冲液，防止珠子沉降，直至柱床填充至柱储液器底部下方约两厘米的高度。

上样前，在真空条件下对洗脱缓冲液进行脱气处理。用约两倍柱体积的洗脱缓冲液冲洗层析柱。当缓冲液流至凝胶层顶端时，小心地将2毫升浓度为100至200纳摩尔/升的外膜囊泡样品加至凝胶层上方，避免扰动凝胶表面，并让样品进入凝胶。

缓慢将洗脱缓冲液加入柱子中，注意不要扰动凝胶层，并在柱子下方放置一个50毫升的收集管。为防止柱子干燥，需同时向柱子顶部添加洗脱缓冲液。收集20毫升洗脱液后，在柱子下方放置一排1.5毫升的收集管。

每管收集总共96个一毫升的组分。在收集样品的同时，持续向柱中添加洗脱缓冲液。清洗柱时，先将一个柱体积的0.1摩尔氢氧化钠溶液通过柱，随后用两个柱体积的洗脱缓冲液冲洗。

为测定脂质浓度，将每种组分各50微升移入96孔板中。向每个孔中加入2.5微升亲脂性染料。15秒后，测定荧光强度。

为了测定目标蛋白的浓度，将每种组分各100微升加入ELISA免疫板的各个孔中。在25摄氏度下孵育3小时后，倾去板内液体。每次用200微升ELISA洗涤缓冲液洗涤，共洗涤5次，每次洗涤后均需倾去板内液体。

每孔加入 200 µL 封闭缓冲液，在 25 °C 下孵育 1 小时。孵育结束后，倾去孔内液体，每孔加入 100 µL 溶于封闭缓冲液中的一抗，于 4 °C 过夜孵育。次日，倾去孔内液体，用 ELISA 洗涤缓冲液洗涤 5 次，操作如示。

最后一次洗涤后，每孔加入100 µL ELISA洗涤缓冲液中的二抗，于25°C孵育1小时。孵育结束后，按前述方法洗涤平板，每孔加入100 µL TMB溶液，室温孵育15至30分钟。当出现蓝色时，每孔加入50 µL终止液，并在450 nm处测定吸光度。

在对伴放线放线杆菌（A. actinomycetemcomitans）培养上清液进行尺寸排阻层析纯化后，观察到两个明显的脂质峰，分别对应于该菌株产生的大尺寸和小尺寸外膜囊泡。对样品组分进行ELISA分析显示，毒素主要与大尺寸外膜囊泡亚群相关。免疫印迹分析结果趋势相似，但背景噪声较高，表明该方法的灵敏度低于ELISA。

如所观察到的，该色谱技术能够从外膜囊泡的制备物中去除大量游离蛋白。然而需要注意的是，总蛋白浓度并不一定与特定蛋白的浓度相关。在柱子的装填和运行过程中，必须格外小心，以避免产生气泡，并防止柱子干燥。

在尺寸排阻色谱分离外膜囊泡后，可进行动态光散射、粒子追踪和双显微镜分析，以确定分离得到的外膜囊泡的大小及其他特性。