利用夹心式冷冻装置进行快速冷冻以实现电子显微镜中生物样本良好超微结构保存

为了观察细胞精美的天然超微结构，必须通过快速冷冻对细胞进行固定。夹心冷冻法是冷冻细胞而不形成冰晶的最佳方法之一。本方案演示了夹心冷冻装置的使用，并描述了夹心冷冻后对冷冻置换样品制备超薄切片的步骤。

开始准备液态丙烷：将三明治式冷冻装置（SFD）的液氮容器中注入液氮。通过细喷嘴通入丙烷气体，向液态丙烷容器中充入液态丙烷。使用冷却的金属棒以加速丙烷的凝固。

为制备平面型和篮状型铜片，将铜片放置于载玻片上，无字母面朝上，使用离子溅射仪在10帕、400伏、1毫安条件下进行辉光放电处理30秒，使铜片表面具有亲水性。将细胞悬液转移至2毫升离心管中，在室温下以2,900 ×g离心10秒。弃去上清液，重悬沉淀以获得浓稠的细胞悬液。

取少量或约 0.02 微升的细胞悬液置于铜片上。用另一片铜片覆盖，并用镊子夹起铜片。用细金属棒在固体丙烷中心压出一个凹槽。

将镊子放入SFD中，并通过推动装置的注射按钮迅速冷冻。将使用过的镊子浸入室温水中，使其升温，以便冷冻后续样品。使用经2.5%戊二醛、pH 7.4的0.1摩尔磷酸盐缓冲液固定的动物和人体组织。

在体视显微镜下，用剃须刀片将组织切成 0.1 至 0.2 毫米厚的切片。在篮状铜盘上滴加少量戊二醛溶液，然后用镊子将一块组织放入铜盘上的戊二醛溶液中，并用平头铜盘覆盖。按照之前演示的方法，将载有组织的铜盘迅速浸入 SFD 的液态丙烷中进行快速冷冻。

将样品盘转移至工作用液氮浴中。使用已在液氮中预冷的镊子将样品盘彼此分离，以暴露样品。将带有细胞的样品盘放入一个玻璃小瓶中，瓶内装有一毫升含有2%四氧化锇的丙酮溶液，该溶液已置于液氮中并凝固。

将载片转移至超低温冰箱中，在零下80摄氏度条件下保存两到四天，以完成细胞的冷冻置换。通过以下步骤将样品逐渐恢复至室温：在零下20摄氏度孵育两小时，再在4摄氏度孵育两小时，最后在室温下孵育15分钟。将载片转移至装有1毫升丙酮的2毫升塑料管中。

使用搅拌器在一次性塑料容器中混合试剂，制备环氧树脂。在室温下依次用含30%树脂的丙酮溶液、60%树脂和90%树脂各处理1小时，然后在37摄氏度下将90%树脂更换为100%树脂并过夜。最后，将样品包埋于硅胶包埋模具中的100%树脂中，并在60摄氏度下聚合24小时。

从硅胶包埋模具中取出聚合后的块状样品，并在样品块上标记标本编号。使用剃刀片将铜片从样品块上取下，然后在体视显微镜下使用超声修块刀片和剃刀片对样品块表面包埋的标本进行修整。接着，将胶带贴在切片机的样品块夹头和样品夹持器上，并在边界处将胶带切断。

从超薄切片机上取下样品块，置于体视显微镜下，用剃刀刀片进一步修整至 0.2 毫米 × 0.3 毫米。在载网表面涂上氯丁橡胶使其具有粘性。将样品块重新放回超薄切片机，对齐已贴胶带的部分。

用塑料罩盖住超薄切片机，切下50至70纳米厚的切片。使用环圈收集切片，将其置于经氯丁橡胶处理的300或400目铜网上，然后干燥。

将带有切片的载网置于半片硅胶管的凹槽中。将样本浸入醋酸铀溶液中染色三分钟。收集使用过的醋酸铀溶液，并将其储存于注射器中。

用流水冲洗半管中的样品，然后将样品在柠檬酸铅中浸泡三分钟。对于酵母和真菌样品，将载网置于滤纸上，用镊子夹起，在水面上覆盖等离子体聚合的萘膜。将载网插入电子显微镜的样品台，再将样品台插入电子显微镜，在100千伏下进行观察。

在电子显微镜下观察大肠杆菌（E.coli）和酿酒酵母（S.cerevisiae）的超薄切片，显示出自然形态和清晰的图像。采用表面冷冻干燥法（SFD）快速冷冻的培养细胞超薄切片在电子显微镜下观察，其图像清晰且呈现自然形态。人皮肤超薄切片的图像非常清晰，同样显示出自然形态。

采用SFD快速冷冻乙型肝炎病毒核心颗粒，并通过冷冻电子显微镜进行观察。需要牢记最重要的一点是，应将极少量的细胞样品施加于铜盘上，以防止冷冻过程中形成冰晶。通过预先用戊二醛固定动物组织，可实现约200微米深度的良好冷冻效果，该深度与高压冷冻所达到的深度相当。

该技术为研究人员以低成本便捷地观察细胞精美的天然超微结构铺平了道路。