使用荧光染料，罗达明B，研究雄性 伊蚊 的交配竞争力
2021年5月7日
在这里，我们提出了一个协议，研究雄性 伊蚊 的交配竞争力使用荧光染料作为标记。雌性蚊子接触有标记和无标记的雄性进行交配。交配后，在荧光显微镜下检查他们的精子，以确定他们的交配伙伴。
该协议衡量雄性蚊子交配的竞争力，这是男性释放蚊子种群抑制计划的先决条件。此健身标准作为质量控制和菌株评估的一部分进行评估。这种方法可将实验时间缩短90%，并允许直接比较两条无菌或沃尔巴契亚感染线之间的交配竞争力。
执行此程序的将是艾琳·李和吴伟马克。首先，根据蚊子的大小差异，在幼虫阶段对雄性蚊子进行。每组蚊子，将100只雄性幼虫转移到预先标记的笼子中，用于蔗糖喂养或罗达明B蔗糖喂养。
将雌性幼崽分小批量放入每笼40至50只。伊马戈人出现后，检查笼子是否有雄性蚊子。要准备 0.2% 罗达明 B 蔗糖溶液，每 100 毫升 10% 蔗糖溶液溶解 200 毫克罗达明 B 粉末。
混合好，以确保所有的粉末溶解。准备20个含糖的糖喂食瓶和一个芯子。将 10 毫升 10% 蔗糖加入 10 个喂食瓶中，为其他 10 个喂食瓶添加 10 毫升 0.2% 罗达明 B 蔗糖溶液。
将五个喂食瓶放入每个准备好的雄性笼子中，让雄性蚊子在交配实验前喂食三天。打开汞燃烧器灯和立体显微镜。让汞燃烧灯的光源稳定10分钟。
然后设置红色荧光蛋白的荧光过滤器。一次将少量蚊子吸进口腔吸气器的玻璃管中。通过玻璃管，在荧光立体显微镜下观察雄性蚊子的身体。
实验只使用标有罗达明B的雄性蚊子。转移集 雄性蚊子放入12个纸杯中，用网固定。将每杯10只蔗糖喂养的雄性蚊子放入6杯中，将每杯10只罗达明B蔗糖喂给雄性蚊子放入其他6杯。
重复此步骤设置 B 雄性蚊子。设置 12 个笼子进行交配分析。在6个笼子中，每只都包括10组标有罗丹B标记的A型雄性蚊子，10只未标记的B型雄性蚊子，以及10只处女野生型雌性蚊子。
在其他6个笼子中，包括10只未标记的A型雄性蚊子、10只罗丹B型B型雄性蚊子和10只处女野生型雌性蚊子。标记这些笼子，以清楚地区分两个交配组合。根据标签将各自的雄性杯子放在交配笼中。
取下网，轻轻敲击杯子，将雄性从杯子中挤出。小心地从笼子里取出纸杯和网，确保没有蚊子从笼子里逃出来。让雄性蚊子在交配笼中适应至少一个小时。
使用口服吸气器，将处女野生型雌性蚊子转移到12个纸杯中，每个纸杯内含有10只蚊子。雄性蚊子的适应期结束后，将一杯雌性蚊子转移到每个交配笼中，并取出网。轻轻地将杯子挤出，鼓励剩余的雌性蚊子离开杯子，然后小心地从笼子里取出纸杯和网，以确保没有蚊子从笼子里逃出。
允许交配进行三个小时，然后用机械吸气器将所有蚊子从每个笼子中取出，从而终止交配实验。冷麻醉在冰上的蚊子至少五分钟。当蚊子完全麻醉时，轻轻地捡起雌性蚊子，放在一个单独的纸杯里，用网固定。
将各自的标签从交配笼转移到杯子上，从而标记纸杯。为了给雌性精子打分，在立体显微镜下解剖之前，在冰上对雌性蚊子进行至少五分钟的冷麻醉。在立体显微镜下解剖雌性蚊子。
在显微镜下检查精子。如果女性没有授精，所有三个精子都将是空的，如果授精，两到三个精子将充满运动精子。对于受精个体，通过在装有RFP1过滤器的荧光立体显微镜下检查，确定精子是否含有含有罗丹B标记的开创性液体。
如果精子中充满了未标有罗达明B的开创性液体，则不观察到荧光。另一方面，如果精子中含有罗达明B标记的开创性液体，它会荧光橙色。这种交配竞争力测定的目的是确定经过几代近亲繁殖后，男配体能是否会下降。
进行了交配竞争力检测的实验三重切片，授精数据显示于此。野生型雌性由近亲繁殖或外生雄性授精，具有互惠标记。结果表明，近亲繁殖或异雄性受精的女性比例不受罗达明 B 标记的影响。
与外向雄配的女性比例明显高于所有三个复制体中的近亲繁殖雄性，这表明近亲繁殖可能导致交配体能下降。准备额外的雌性蚊子笼子很重要。不要使用被雄性蚊子污染的笼子里的女性蚊子，因为受精前的女性会使所有数据无效。
除了基于实验室的交配竞争力分析外，该程序可用于标记释放-捕获实验，以研究昆虫交配生物学、种群动态及其分散性。
概述
本研究提出了一种评估雄性埃及凯氏瘧蚊交配竞争力的方案，这是蚊虫种群控制策略中的一个重要考虑因素。通过使用罗丹明B作为荧光标记物，研究人员可以直接比较标记和未标记雄性在接触雌性蚊子后的交配成功率。
关键研究组成部分
研究领域
- 蚊虫交配竞争力
- 种群抑制策略
- 昆虫行为和生物学
背景
- 由于蚊虫在疾病传播中的作用，有效控制蚊虫种群的需求。
- 评估雄性交配适应度对杀虫昆虫技术计划中的质量控制的重要性。
- 使用荧光标记物来提高实验的准确性和效率。
使用的方法
- 使用标记和未标记的雄性蚊子进行受控的交配测定。
- 以埃及凯氏瘧蚊为模型生物。
- 使用荧光显微镜分析交配结果和精子存在。
主要结果
- 近亲繁殖降低了雄性交配适应度，这表现为近亲繁殖的雄性的授精率低于杂交雄性。
- 荧光标记并未影响雌性的授精比例。
- 高效的方法允许快速评估交配竞争力。
结论
- 本研究强调了遗传因素对埃及凯氏瘧蚊交配成功的影响。
- 研究结果对未来的蚊虫控制和种群动态研究具有相关性。
常见问题
Executive Industry Relevance
Assessing male mating competitiveness is critical for evaluating strain fitness in sterile insect technique programs, directly impacting the success of vector control strategies. This fluorescent dye-based method enables rapid, quantitative comparison of mating fitness between strains, reducing experimental time by 90% and supporting data-driven go/no-go decisions in pipeline advancement. By providing a scalable, reproducible assay for target validation in vector-borne disease intervention, it enhances predictive confidence in preclinical strain selection.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables direct interrogation of mating fitness as a phenotypic endpoint for strain fitness evaluation.
- Operational Value: Reduces assay duration from days to hours by eliminating blood-feeding and egg-hatching steps.
- Predictive Value: Supports mechanistic de-risking by quantifying competitive mating success between sterile or Wolbachia-infected lines.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates quantitative, fluorescence-based readouts for mating partner identification in spermathecae.
- Operational Value: Uses sucrose feeding for non-invasive male marking, enabling high-throughput preparation of labeled cohorts.
- Reproducibility: Standardized Rhodamine B concentration (0.2% in 10% sucrose) ensures consistent labeling across experimental replicates.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Bridges laboratory strain evaluation to field release readiness by assessing a key fitness criterion for population suppression.
- Mechanistic De-risking: Detects fitness costs of inbreeding through reduced insemination rates, informing strain maintenance strategies.
- Disease-Relevant System: Uses Aedes aegypti, a vector for dengue, Zika, and chikungunya, aligning with global health priorities.
Pipeline & Workflow Integration
This method fits within the discovery-to-preclinical continuum, supporting strain selection after genetic modification and before field trial planning, by providing a quantitative mating competitiveness metric.
- Discovery Biology: Tests the hypothesis that genetic background influences mating success through competitive male-female interactions.
- Screening: Produces standardized, fluorescent sperm labeling enabling blind scoring of mating outcomes across experimental groups.
- Analytics: Generates proportional insemination data per male strain, facilitating statistical comparison of mating fitness.
- Translational Research: Connects laboratory competitiveness to field efficacy by validating a prerequisite for sterile male release success.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for comparing any two male strains, applicable across vector control programs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Provides mechanistic insight into mating fitness determinants, reducing ambiguity in strain selection.
- Operational Value: Eliminates dependency on blood feeding and embryology, simplifying workflow and increasing throughput.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by identifying fitness defects early, reducing investment in non-competitive strains.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of strains based on validated mating competitiveness data.
Implementation Considerations
- Requires expertise in mosquito handling, sex separation at pupal stage, and fluorescence microscopy.
- Necessitates stereo microscope with RFP1 filter set and mercury burner lamp for standardized fluorescence detection.
- Demands cross-team standardization of male marking protocols and female dissection procedures to ensure data consistency.
- Involves adaptation considerations when applying to different mosquito species or strains with varying feeding behaviors.
- Includes practical limitations such as the need to avoid pre-inseminated females and ensure proper cage labeling to prevent cross-contamination.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:04
Introduction
0:41
Preparation of Male and Female Mosquitoes
1:11
Preparation of 0.2% RhB Sucrose Solution and Feeding of Male Mosquitoes
1:52
Checking for RhB Fluorescence in Male Mosquitoes
2:46
Mating Competitiveness Assay
5:36
Results: Assessment of Mating Competitiveness in Male Mosquitoes
6:27
Conclusion
