Name: 视网膜器官诱导系统，用于从人类多能干细胞中提取3D视网膜组织 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-04-12T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 5 s
Description: 了解从人类多能干细胞诱导三维视网膜组织的优化方案，通过量化胚状体大小和接种密度提高分化效率与可重复性，无需视黄酸即可富集视锥细胞，适用于疾病建模和细胞治疗研究。

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本研究由国家重点研发计划&amp;中国国家重点研发计划（2016YFC1101103，2017YFA0104101）、广州市科技计划项目基金（201803010078）、科学 &amp;广东省科技计划项目（2017B020230003）、国家自然科学基金（81570874，81970842）、中山大学百人计划（PT1001010）以及眼科学国家重点实验室基本科研业务费

1. 人多能干细胞的培养与扩增
<ol>
	<li>人多能干细胞（hPSC）培养
	<ol>
		<li>用细胞外基质（ECM，适用于人胚胎干细胞的基质）包被6孔板中的两个孔。配制50 mL ECM溶液，其中ECM浓度为8–12 µg/mL，溶剂为杜氏改良伊格尔培养基（DMEM）。在49&#160;mL DMEM中加入1 mL已解冻的ECM储备液（50倍浓度）。向6孔板的每个孔中加入1 mL ECM溶液。将培养板置于37 °C、5% CO2的培养箱中孵育1小时。</li>
		<li>根据制造商说明书配制人多能干细胞维持培养基（MM）。</li>
		<li>将MM在室温（RT）预温30分钟。</li>
		<li>从液氮罐中取出一管冷冻保存的人多能干细胞（hiPSCs或hESCs，约1 × 106个细胞），在37 °C水浴中孵育30秒以解冻。</li>
		<li>取出冻存管，用75%消毒酒精喷雾仔细消毒，然后放入生物安全柜中。</li>
		<li>将冻存管中的细胞悬液转移至15 mL离心管中，使用5 mL移液器逐滴加入5 mL预温的MM。同时轻轻振荡离心管，使hPSCs充分混匀。</li>
		<li>以170 × g离心5分钟。用1 mL移液器小心吸除大部分上清液，保留约50 µL上清液，以避免细胞损失。</li>
		<li>向离心管中加入1 mL MM，使用1 mL移液器轻轻吹打1–2次，重悬细胞沉淀。 
		注：hPSC单个细胞的存活率较低。建议保留含3–5个细胞的小细胞团，以利于hPSC以克隆形式生长。</li>
		<li>移除预先包被的孔中的ECM，每孔加入1.5 mL&#160;MM，然后每孔接种0.5 mL&#160;细胞悬液。</li>
		<li>轻轻摇动培养板使hPSC均匀分布，将培养板放入37 °C、5% CO2的培养箱中。至少24小时内不要移动培养板，以促进细胞贴壁。</li>
		<li>每隔一天更换一次MM，当细胞融合度达到约80%时进行传代。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>hPSC传代 
	注：维持hPSC的未分化状态对其后续应用至关重要。在贴壁培养条件下，hPSC以边界清晰的克隆形式生长。当hPSC融合度达到约80%时应进行传代。
	<ol>
		<li>在显微镜下观察细胞。传代前标记并机械去除明显可见的已分化细胞（&#60;5%）。</li>
		<li>按照步骤1.1.1所述方法准备ECM包被的培养板。</li>
		<li>将MM和不含Ca2+和Mg2+的1×磷酸盐缓冲液（PBS）在室温下预温。</li>
		<li>将0.5 mM EDTA（溶于1× PBS）溶液在37 °C水浴中预温。</li>
		<li>使用真空抽吸系统移除培养板中的培养基，用1 mL移液器向每孔加入1 mL&#160;1× PBS洗涤细胞，重复两次。</li>
		<li>每孔加入1 mL&#160;EDTA溶液，在37 °C、5% CO2的细胞培养箱中孵育5分钟，使hPSC解离。孵育时间不得超过推荐时长，以免细胞过度解离为单细胞。</li>
		<li>取出培养板，在显微镜下检查细胞脱落情况。融合生长的hPSC会变得松散，细胞边界清晰可见，但轻摇培养板时细胞不会轻易脱落。</li>
		<li>用1 mL移液器吸除EDTA溶液，每孔加入1 mL MM以终止解离反应。用1 mL移液器轻轻吹打1–2次，使细胞重悬。无需离心收集&#160;细胞。 
		&#8203;注：若EDTA孵育后大部分细胞已从培养板脱落，可通过离心收集细胞。</li>
		<li>移除预先包被孔中的ECM，每孔加入1.5 mL&#160;MM。</li>
		<li>将150–200 µL细胞团转移至每孔。通常hPSC可按1:6的比例传代。例如，一个6孔板中的细胞可分种至六个新孔中。</li>
		<li>轻轻摇动培养板使hPSC均匀分布，并在37 °C、5% CO2 的培养箱中培养至少24小时，期间不要触碰培养板。</li>
		<li>每隔一天更换一次MM，操作同步骤1.1。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 人多能干细胞向视网膜的分化
注意：当细胞集落达到约 80% 汇合度时（图 1B），可按照 图 1A 所示的方案诱导其分化为视网膜类器官。为确保人多能干细胞（hPSCs）具有高质量和良好的产量，应定期通过分子标志物（如 OCT4 或 NANOG）采用免疫荧光染色（IFC）或定量 PCR（QPCR）检测其多能性。若分化细胞占总细胞数的比例超过 5%，应弃用该 hPSCs。根据试剂盒制造商的说明，使用支原体检测试剂盒检测支原体污染。仅使用无支原体污染的 hPSCs，因为支原体可能改变 hPSCs 的分化能力。
<ol>
	<li>准备培养基和试剂
	<ol>
		<li>通过混合以下成分制备神经诱导培养基（NIM）：500 mL&#160;Dulbecco 改良 Eagle 培养基/营养混合物 F-12（DMEM/F-12，1:1），5 mL&#160;1% N2添加剂，0.5 mL&#160;0.1% 肝素（1×PBS 中 2 mg/mL），以及 5 mL 的&#160;1% MEM非必需氨基酸（NEAA）。</li>
		<li>制备含有300 mL的视网膜分化培养基（RDM）&#160;DMEM/F-12，200 mL&#160;DMEM 基础培养基，10 mL&#160;2% B27添加剂，5 mL&#160;1% 抗生素-抗真菌剂，以及 5 mL&#160;1% MEM 非必需氨基酸 
		注意：NIM 和 RDM 均未经过过滤，但需进行无菌检测。取出 1 mL&#160;培养基加入35 mm培养皿中，置于37 °C、5% CO₂培养箱中培养3-7天2培养基可在4 °C保存，应在2周内使用，以确保组分的活性。</li>
		<li>配制10 mM 的Blebbistatin（1,000倍）DMSO溶液。加入1,710 µL的&#160;DMSO 溶解 5 mg 的&#160;使用Blebbistatin配制10 mM储存液（1,000倍），按10 µL/管分装，于-20 °C保存。 
		注意：除非另有说明，所有培养基和试剂使用前均需在室温下预热30分钟。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>胚胎体（EB）形成
	<ol>
		<li>在第0天（D0）启动分化。从6孔板中取出一个生长至约80%汇合度的hPSCs孔，按照步骤1.2.1至1.2.6所述，使用EDTA解离溶液收集细胞。</li>
		<li>移除EDTA溶液，加入1 mL的&#160;加入含10 µM Blebbistatin的MM以终止细胞解离，并用1 mL移液器收集细胞。细胞团块的大小是影响胚体（EBs）产量的关键因素之一。每个团块约含五个细胞&#160;在第5至第7天生成适当大小的拟胚体时，更优选上述条件。 
		注意：这是关键步骤。不要过度吹打细胞，因为人多能干细胞的单细胞难以形成类胚体聚集体。</li>
		<li>将细胞悬液（约 2 x 106 细胞）转移至一个100 mm超低吸附培养皿中，并加入9 mL&#160;将含有10 µM Blebbistatin的MM加入培养皿中。</li>
		<li>轻轻晃动培养皿两次，使细胞均匀分布，然后将培养皿置于37 °C、5% CO₂的培养箱中2.</li>
		<li>在第1天，细胞培养至少24小时后，取出培养皿并在显微镜下观察。大量小型细胞聚集体将自发形成。&#160;此时已形成（图1C).</li>
		<li>准备12 mL的MM与NIM按3:1比例混合的溶液（9 mL MM&#160;MM 和 3 mL 的&#160;NIM) 置于15 mL离心管中。</li>
		<li>用10 mL移液管将细胞培养物垂直转移至15 mL离心管中，并向培养皿中加入10 mL预热的混合液。</li>
		<li>将试管以 60 x g 3分钟以收集聚集体，用5 mL移液管吸除上清液，保留约500 µL以避免细胞损失。</li>
		<li>向试管中加入2 mL该混合物，并将悬液转移至同一培养皿（步骤2.2.7）。</li>
		<li>轻轻摇晃培养皿，使细胞聚集体均匀分布，然后将培养皿放回&#160;在培养箱中。</li>
		<li>在第2天，用MM和NIM按1:1比例配制12 mL的新混合液（各6 mL）&#160;MM 和 6 mL 的&#160;NIM) 加入15 mL离心管中。通过重复步骤2.2.5至2.2.10，用新鲜配制的混合液更换细胞培养基。</li>
		<li>第3天，更换细胞培养基，加入15 mL&#160;如上所述的NIM。在悬浮条件下培养细胞至少5天。 
		注意：在第1至第3天（D1至D3）期间，应每天更换培养基，以提供充足的营养。从第3天（D3）开始，神经诱导培养基（NIM）可每隔一天更换一次。此外，可将胚状体（EBs）分至多个培养皿中，以保证营养充足。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>接种胚体 
	注意：在第5至第7天，根据胚胎体（EB）的大小选择合适的时间点，将EB接种至经细胞外基质（ECM）包被的培养皿中。选择直径约为200 µm的EB&#160;适用于视网膜分化。通常情况下，6孔板中一孔人多能干细胞（hPSCs）可产生约300至1,000个拟胚体（EBs）。EB产量的差异&#160;因hPSC细胞系的不同而有所差异。
	<ol>
		<li>在第4天，准备用于拟胚体贴壁培养的ECM包被培养皿。加入5 mL的&#160;将ECM加入每个100 mm组织培养皿（经表面处理），并在培养箱中孵育过夜。</li>
		<li>在第5天，从预先包被的培养皿中去除细胞外基质，加入10 mL&#160;预热的NIM加入每皿。</li>
		<li>取出含有拟胚体（EBs）的培养皿，在显微镜下检查拟胚体的质量，确保其形态较为明亮且呈圆形。拟胚体的大小约为 200 µm&#160;直径。将所有拟胚体收集到一个15 mL离心管中。用5 mL移液器将拟胚体从培养皿转移至15 mL离心管中。静置5分钟使拟胚体沉降。吸除大部分上清液，保留约2 mL培养基。</li>
		<li>将EBs分配至含有10 mL包被液的包被培养皿中&#160;用1 mL移液器逐滴加入NIM。将EBs以每平方厘米约2-3个EBs的密度接种。2例如，将约120–180个EB加入一个100 mm培养皿中。为粗略估算EB数量，可取一滴EB悬液置于盖玻片上，在显微镜下计数EB数目。 
		注意：拟胚体（EBs）的接种密度是影响视网膜诱导效率的关键因素之一。该密度也可根据不同人多能干细胞（hPSC）细胞系进行调整。</li>
		<li>轻轻摇晃培养皿，使拟胚体均匀分布。将其置于37 °C、5% CO₂的培养箱中2. 
		注意：&#160;至少 24 小时内不要移动培养皿，以增强 EBs 的贴附。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>在贴壁条件下诱导视泡（OVs）和视网膜色素上皮（RPE） 
	注意：将EB接种于ECM包被的表面后，hPSC可发育形成类似视杯（OV-like）的结构，最早可在分化后第20天（D20）观察到。在本方案中，除在培养基中添加N2和B27添加剂外，无需额外添加特定的生长因子或信号分子来引导hPSC向视网膜命运分化。
	<ol>
		<li>在第8-9天，取出培养皿并在显微镜下观察胚胎体（EBs）。所有胚胎体均会贴壁并铺展在培养皿上（图1D。加入10 mL&#160;的&#160; 新鲜 NIM 加入每个含有 10 mL 的 100 mm 培养皿中&#160;旧培养基。将它们放回培养箱中。 
		注意：不要移除旧的培养基。</li>
		<li>在第12天，使用10 mL移液管用NIM培养基更换一半的培养液。将培养物置于培养箱中继续培养。</li>
		<li>在第16天，使用真空抽吸系统将培养皿中的所有NIM移除。加入20 mL&#160;向每皿加入RDM，继续在RDM中培养，每隔一天更换一半培养基。</li>
		<li>在第10至30天期间，每周两次在显微镜下观察细胞的形态变化，并评估视网膜分化效率。 
		&#8203;注意：自第10天起，眼场（EF）区域在贴壁型胚胎体（EBs）的周边区域自发组织形成。视杯样结构于第20至25天出现，逐渐从培养皿中向外突出，并自组织形成被色素化的视网膜色素上皮（RPE）包围的视杯结构。图1E）。OVs 可通过明亮、折光且较厚的 NR 环轻松识别。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>分离并悬浮培养视泡（OVs）和视网膜色素上皮（RPE），以获得视网膜类器官（ROs）
	<ol>
		<li>在第28至35天，大多数视泡（OVs）出现在培养皿中。使用钨针或连接1 mL注射器的针头，将形态上可识别的视泡及其相邻的视网膜色素上皮（RPE）进行机械分离，并将其置于悬浮培养中。 
		注意：不同hPSC系中视泡（OV）和视网膜色素上皮（RPE）的形态和产量差异较大。因此，OV和RPE的分离时间点具有灵活性。当出现明显的OV及其相邻的RPE时，即可进行分离，并将其转移至含有RDM的低吸附培养皿中。继续培养剩余细胞，直至所有OV和RPE均被分离。</li>
		<li>将50-60个OVs放入每个含有15 mL RDM的100 mm低吸附培养皿中，用于ROs的形成（图1F).</li>
		<li>每2-3天更换一次RDM，直至第42天，此时ROs应呈现良好的圆形。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. 视网膜发育与成熟
注意：在本方案中，需要血清以维持类器官在长期培养中的生长和成熟。
<ol>
	<li>视网膜类器官中的视网膜层化与细胞命运特化
	<ol>
		<li>配制10 mL 100 mM 牛磺酸（1,000倍）溶液于1×PBS中。称取125 mg 牛磺酸&#160;牛磺酸，溶于10 mL 1×PBS中。使用0.22 µm针头滤器过滤溶液。按500 µL/管分装，于-20 °C保存。</li>
		<li>制备视网膜培养基1（RC1）。混合以下组分：250 mL&#160;的&#160;DMEM/F-12, 175&#160;毫升&#160;DMEM 基础培养基，50 mL&#160;胎牛血清，10 mL&#160;2% B27添加剂，5 mL&#160;1% 抗生素-抗真菌剂，5 mL&#160;1% MEM非必需氨基酸，0.5 mL&#160;100 µM 牛磺酸和 5 mL 的&#160;2 mM L-丙氨酰-L-谷氨酰胺</li>
		<li>制备含450 mL视网膜培养基2（RC2）的溶液&#160;DMEM/F-12，50 mL&#160;胎牛血清，5 mL&#160;1% N2添加剂，5 mL&#160;1% 抗生素-抗真菌剂，0.5 mL&#160;100 µM 牛磺酸、5 mL 1% MEM 非必需氨基酸和 5 mL 2 mM L-丙氨酰-L-谷氨酰胺。 
		注意：RC1 和 RC2 未经过滤，但需进行无菌检测。取出 1 mL&#160;培养基，加入35 mm培养皿中，在37 °C、5% CO₂的培养箱中培养3-7天2，以确保使用前的无菌状态。培养基可保存在4 °C，应在2周内使用完毕，以保证组分的活性。所有培养基和试剂在使用前应在室温下预热30分钟。</li>
		<li>在第42天，将培养基从RDM更换为RC1。</li>
		<li>将培养皿倾斜约30˚，使视网膜类器官沉降&#160;静置30秒。用10 mL移液器移除旧的RDM，残留约1 mL。&#160;中等体积培养基以避免丢失ROs。加入15 mL&#160;每皿加入新鲜的 RC1。</li>
		<li>轻轻摇晃培养皿，使类器官均匀分布。将培养皿放回培养箱中。此后每周更换两次全量培养基。</li>
		<li>在 D50-D90 期间，挑选高质量的视网膜类器官（ROs）进行长期培养，这些类器官应具备以下特征：&#160;圆形，具有厚而明亮的神经视网膜（NR）。将30-40个视网膜类器官（ROs）置于100 mm低吸附培养皿中，加入20 mL培养基&#160;RC1，以及&#160; 每周更换两次全部培养基。</li>
		<li>为进行类器官的长期悬浮培养，使用移液器吹打类器官，避免类器官之间重新聚集。每月将类器官转移至新的培养皿，以防止类器官贴附于培养皿表面。 
		注意：在悬浮培养条件下，视网膜类器官呈圆形，具有一圈明亮且厚实的神经视网膜环，一侧附着或多或少的视网膜色素上皮。分层的神经视网膜逐渐发育，视网膜细胞亚型依次出现，首先生成视网膜神经节细胞，随后为光感受器细胞、无长突细胞和双极细胞。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>人视网膜类器官中富集视锥细胞的光感受器成熟过程
	<ol>
		<li>D90后，将培养基从RC1更换为适用于光感受器成熟的RC2。</li>
		<li>按照步骤 3.1.7-3.1.8 所述更换培养基。 
		注意：在此培养条件下，视网膜类器官可长期生长（图1G），最长测试至D300。类器官中的视网膜细胞逐渐成熟，并获得神经视网膜的所有细胞亚型，包括穆勒胶质细胞、视杆细胞和视锥细胞。在未添加任何视黄酸（RA）的情况下，类器官中亦富含视锥光感受器细胞。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

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<li>Mitchell, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retinoic+acid+signaling+regulates+differential+expression+of+the+tandemly-duplicated+long+wavelength-sensitive+cone+opsin+genes+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genetics%22%5BJournal%5D)">Retinoic acid signaling regulates differential expression of the tandemly-duplicated long wavelength-sensitive cone opsin genes in zebrafish.</a> PLoS Genetics. 11 (8), 1005483(2015).</li>
<li>Stevens, C. B., Cameron, D. A., Stenkamp, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plasticity+of+photoreceptor-generating+retinal+progenitors+revealed+by+prolonged+retinoic+acid+exposure%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Plasticity of photoreceptor-generating retinal progenitors revealed by prolonged retinoic acid exposure.</a> BMC Developmental Biology. 11 (1), (2011).</li>
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<li>Kim, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation%2C+transcriptome+profiling%2C+and+functional+validation+of+cone-rich+human+retinal+organoids%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Science+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">Generation, transcriptome profiling, and functional validation of cone-rich human retinal organoids.</a> Proceedings of the National Academy of Science U. S. A. 116 (22), 10824-10833 (2019).</li>
<li>Lowe, A., Harris, R., Bhansali, P., Cvekl, A., Liu, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intercellular+adhesion-dependent+cell+survival+and+ROCK-regulated+actomyosin-driven+forces+mediate+self-formation+of+a+retinal+organoid%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Intercellular adhesion-dependent cell survival and ROCK-regulated actomyosin-driven forces mediate self-formation of a retinal organoid.</a> Stem Cell Reports. 6 (5), 743-756 (2016).</li>
<li>Carcamo-Orive, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+transcriptional+variability+in+a+large+human+ipsc+library+reveals+genetic+and+non-genetic+determinants+of+heterogeneity%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Analysis of transcriptional variability in a large human ipsc library reveals genetic and non-genetic determinants of heterogeneity.</a> Cell Stem Cell. 20 (4), 518-532 (2017).</li>
<li>DeBoever, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Large-scale+profiling+reveals+the+influence+of+genetic+variation+on+gene+expression+in+human+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Large-scale profiling reveals the influence of genetic variation on gene expression in human induced pluripotent stem cells.</a> Cell Stem Cell. 20 (4), 533-546 (2017).</li>
</ol>

Xiufeng Zhong 是与从人多能干细胞生成视网膜细胞相关的专利发明人。

在此多步骤视网膜诱导方案中，人多能干细胞（hPSCs）被逐步引导获得视网膜命运，并自组织形成包含层状神经视网膜（NR）和视网膜色素上皮（RPE）的视网膜类器官。在分化过程中，hPSCs重现了人类视网膜发育的所有主要阶段 体内从视杯前体（EF）、视泡（OV）和视网膜色素上皮（RPE）出发，逐步实现视网膜层状结构的形成，按特定的空间和时间顺序生成所有类型的视网膜细胞，包括视网膜神经节细胞、无长突细胞、双极细胞、视杆细胞和视锥细胞光感受器以及穆勒胶质细胞。视网膜发育过程的体外重现将有助于视网膜疾病建模等下游应用。
已建立多种从人多能干细胞（hPSCs）生成视网膜类器官的实验方案3,4,5,6,7,<sup class="xre...

视网膜变性疾病（RDs），例如年龄相关性黄斑变性（AMD）和视网膜色素变性（RP），其特征是感光细胞功能障碍和死亡，通常导致不可逆的视力丧失，且目前尚无有效的治愈方法1。这些疾病的发病机制在很大程度上仍不清楚，部分原因在于缺乏人类疾病模型2。在过去的几十年中，干细胞技术推动了再生医学领域的重大进展。包括我们研究团队在内的许多研究人员已证实，人类多能干细胞（hPSCs），包括人类胚胎干细胞（hESCs）和人类诱导多能干细胞（hiPSCs），可通过多种分化方法分化为所有类型的视网膜细胞，甚至形成类视网膜组织3,4,5,6,7,8,9,10,11，为疾病建模和细胞治疗提供了巨大潜力12,13,14。
然而，从人多能干细胞（hPSCs）诱导为视网膜细胞的过程极为复杂且&#160;耗时较长，重复性低，需要研究人员具备丰富的经验和高超的技术。在这一复杂且动态的诱导过程中，多种因素会影响视网膜组织的产量15,16,17。此外，不同的诱导方法在视网膜标志物的表达时间和稳定性方面往往存在显著差异，这可能会影响样本的采集和数据的解读3。因此，亟需一种具有逐步指导的、简便明了的hPSCs向视网膜细胞分化的实验方案。
本文基于我们已发表的研究18,19,20,21，描述了一种优化的视网膜诱导方案，可从人多能干细胞（hPSCs）高效生成富含视锥光感受器的视网膜类器官（ROs），且无需添加视黄酸（RA）。该方案重点阐述了生成神经视网膜和视网膜色素上皮（RPE）的多步骤方法。胚胎体（EB）的形成是早期诱导阶段的关键环节，其大小和接种密度均经过定量优化，可科学地提高视网膜组织的产量并增强实验的可重复性。在诱导的第二阶段，视泡（OVs）在贴壁培养中自发组织，而视网膜类器官则在悬浮培养中形成；此阶段的时间进程和效率在不同hPSC细胞系中存在显著差异。视网膜类器官中视网膜细胞的成熟与特化主要发生在诱导的中后期。在不添加RA的情况下，仍可生成包含丰富视锥细胞和视杆细胞的成熟光感受器。
本方案的目的是对每一步骤进行定量描述和详细说明，以便缺乏经验的研究人员能够重复操作。通过本方案，已成功将多种hPSC细胞系诱导为视网膜类器官（ROs），获得产量稳定、富含视锥细胞的视网膜组织，且具有高度可重复性。采用本方案获得的hPSC来源的视网膜类器官能够重现视网膜发育的主要阶段。 体内并能够长期存活，这有助于后续应用，如疾病建模、药物筛选和细胞治疗。

<table><tbody><tr><td>(&amp;minus;)-Blebbistatin</td><td>Sigma</td><td>B0560-5mg</td><td>ROCK抑制剂</td></tr><tr><td>1 ml 吸头</td><td>Kirgen</td><td>KG1313</td><td>1 ml</td></tr><tr><td>10 ml 移液器</td><td>Sorfa</td><td>3141001</td><td>移液器</td></tr><tr><td>100 mm 组织培养皿</td><td>BIOFIL</td><td>TCD000100</td><td>100 mm 培养皿</td></tr><tr><td>100 mm 组织培养皿</td><td>Falcon</td><td>353003</td><td>100 mm 培养皿</td></tr><tr><td>15 ml 离心管</td><td>BIOFIL</td><td>CFT011150</td><td>离心管</td></tr><tr><td>35 mm 组织培养皿</td><td>Falcon</td><td>353001</td><td>35 mm 培养皿</td></tr><tr><td>5 ml 移液器</td><td>Sorfa</td><td>313000</td><td>移液器</td></tr><tr><td>50 ml 离心管</td><td>BIOFIL</td><td>CFT011500</td><td>离心管</td></tr><tr><td>6 孔组织培养板</td><td>Costar</td><td>3516</td><td>培养板</td></tr><tr><td>Anti-AP2&amp;alpha; 抗体</td><td>DSHB</td><td>3b5</td><td>一抗&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>抗生素-抗真菌剂 100X</td><td>Gibco</td><td>15240062</td><td>抗生素-抗真菌剂</td></tr><tr><td>Anti-ISL1 抗体</td><td>Boster</td><td>BM4446</td><td>一抗&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Anti-Ki67 抗体</td><td>Abcam</td><td>ab15580</td><td>一抗&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Anti-L/M 视蛋白抗体</td><td>由 Jeremy 博士惠赠</td><td>/</td><td>一抗&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Anti-PAX6 抗体</td><td>DSHB</td><td>pax6</td><td>一抗&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Anti-rabbit 555</td><td>Invitrogen</td><td>A31572</td><td>驴抗兔 IgG (H+L)&lt;br/&gt; 二抗，Alexa Fluor 555</td></tr><tr><td>Anti-Recoverin 抗体</td><td>Millipore</td><td>ab5585</td><td>一抗&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Anti-Rhodopsin 抗体</td><td>Abcam</td><td>ab5417</td><td>一抗&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Anti-sheep 555</td><td>Invitrogen</td><td>A21436</td><td>驴抗羊 IgG (H+L)&lt;br/&gt; 二抗，Alexa Fluor 555</td></tr><tr><td>Anti-SOX9 抗体</td><td>Abclonal</td><td>A19710</td><td>一抗&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Anti-VSX2 抗体</td><td>Millipore</td><td>ab9016</td><td>一抗&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>B-27 补充剂（不含维生素 A，50X）</td><td>Gibco</td><td>12587010</td><td>补充剂</td></tr><tr><td>冻存管</td><td>Thermo scientific-NUNC</td><td>375418</td><td>1.8 ml</td></tr><tr><td>DAPI</td><td>DOJINDO</td><td>D532</td><td>4',6-二脒基-2-苯基吲哚&lt;br/&gt; 二盐酸盐；多家供应商</td></tr><tr><td>二甲基亚砜（DMSO）Hybri-max</td><td>Sigma</td><td>D2650-100ML</td><td>多家供应商</td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Gibco</td><td>C11995500BT</td><td>培养基</td></tr><tr><td>DMEM /F12</td><td>Gibco</td><td>C11330500BT</td><td>培养基</td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Invitrogen</td><td>15575-020</td><td>0.5 M，pH 8.0</td></tr><tr><td>FBS</td><td>NATOCOR</td><td>SFBE</td><td>血清</td></tr><tr><td>滤器</td><td>Millipore</td><td>SLGP033RB</td><td>0.22&amp;mu;m，无菌 Millex 滤器</td></tr><tr><td>GlutaMax，100X</td><td>Gibco</td><td>35050061</td><td>L-丙氨酰-L-谷氨酰胺</td></tr><tr><td>肝素</td><td>Sigma</td><td>H3149</td><td>使用时为 2 mg/ml PBS 溶液</td></tr><tr><td>Matrigel，100x</td><td>Corning</td><td>354277</td><td>细胞外基质（ECM）</td></tr><tr><td>MEM 非必需氨基酸溶液（100X）</td><td>Gibco</td><td>11140050</td><td>MEM NEAA</td></tr><tr><td>mTeSR1</td><td>STEM CELL</td><td>85850</td><td>人多能干细胞维持培养基（MM）</td></tr><tr><td>N2 补充剂</td><td>Gibco</td><td>17502048</td><td>补充剂</td></tr><tr><td>磷酸盐缓冲液（PBS）</td><td>GNM</td><td>GNM10010</td><td>不含 Ca⁺、Mg⁺，pH 7.2&amp;plusmn;0.1，0.1M</td></tr><tr><td>牛磺酸</td><td>Sigma</td><td>T0625</td><td>补充剂</td></tr><tr><td>超低吸附培养皿 100 mm 培养皿，低吸附</td><td>Corning</td><td>CLS3262-20EA</td><td>培养皿</td></tr></tbody></table>

人多能干细胞衍生三维视网膜组织的视网膜类器官诱导系统

Retinal Organoid Induction System for Derivation of 3D Retinal Tissues from Human Pluripotent Stem Cells

视网膜变性疾病是导致不可逆失明的主要原因，目前尚无有效治疗方法。多能干细胞具有分化为所有类型视网膜细胞甚至类视网膜类器官的潜力，为这些疾病的患者带来了巨大希望，同时在疾病建模和药物筛选方面具有广阔的应用前景。然而，从人多能干细胞（hPSCs）诱导为视网膜细胞的过程复杂且耗时。本文介绍了一种优化的视网膜诱导方案，可高效、高重复性地生成视网膜组织，适用于多种人多能干细胞系。该方案无需添加视黄酸，有利于富集视锥光感受器细胞。本方案的优势在于对拟胚体（EB）大小和接种密度进行量化，显著提高了视网膜诱导的效率和可重复性。采用该方法，所有主要的视网膜细胞类型可依次出现，并重现视网膜发育的主要阶段，将有助于疾病建模和细胞治疗等下游应用。

本方案中的视网膜诱导过程模拟了人类胎儿视网膜的发育过程。为启动视网膜分化，将人多能干细胞（hPSCs）解离成小细胞团块，并在悬浮培养中诱导形成拟胚体（EBs）。在第1天（D1），形成了大小均一的细胞聚集体或拟胚体（图1C）。随后逐步将培养基更换为NIM。在第5天（D5），将拟胚体接种至ECM包被的培养皿中。细胞逐渐从拟胚体中迁移出来（图1D）。从第10天起，在贴壁的拟胚体周边区域自发形成视泡样结构（eye fields）。在第16天，将诱导培养基更换为RDM。此后，神经视网膜（NR）结构域逐渐形成，从培养皿表面突起，并在RPE细胞的包围下自组织形成视杯样结构（图1E）。在第28至35天期间，用细针将视杯结构及其邻近的RPE组织整体挑起，转入悬浮培养。在悬浮培养条件下，视网膜类器官（ROs）自组织形成，其结构包含一侧附着或多或少RPE球状结构的神经视网膜（NR）（图1F），并在培养基中添加FBS的条件下...

本文介绍了一种优化的视网膜类器官诱导系统，该系统适用于多种人类多能干细胞系，可高效且高重复性地生成视网膜组织。

视网膜变性疾病是导致不可逆失明的主要原因，目前尚无有效治疗方法。具有分化潜能的多能干细胞……

从人多能干细胞（hPSCs）诱导生成视网膜细胞的过程复杂且耗时。本优化方案能够以高重复性且零成本的方式生成视网膜组织。该方案的优势在于对拟胚体（EB）大小和接种密度进行量化，从而显著提高hPSCs向视网膜细胞诱导的效率和可重复性。通过该方法，所有主要的视网膜细胞将依次出现，并重现视网膜发育的主要阶段。该技术将有助于视网膜变性疾病的疾病建模和细胞治疗。演示该实验流程的是来自实验室的博士研究生关媛媛（Yuanyuan Guan）和技术员谢冰冰（Bingbing Xie）。首先，通过将1 mL的50倍浓缩的第三组分储存液加入50 mL的DMEM中，制备50 mL的ECM溶液。然后，向六孔板的每孔中加入1 mL上述制备的ECM溶液，在37摄氏度、5%二氧化碳条件下孵育1小时。根据生产商说明书配制hPSC维持培养基，并将其预热至室温30分钟。从液氮罐中取出一支冻存的人多能干细胞（hPSCs）冻存管，置于37摄氏度水浴中孵育30秒。使用75%酒精喷雾小心消毒后，放入生物安全柜中。将冻存管中的细胞悬液转移至一支15毫米离心管中。然后，使用 5 mL 移液器将 5 mL 预先温育的维持培养基逐滴加入离心管中，同时轻轻振荡管子以混匀 hPSCs。在 170 × g 条件下离心 5 分钟。使用 1 mL 移液器小心吸除大部分上清液，保留约 50 微升上清液，以避免细胞损失。用移液器上下吹打，将沉淀重悬于1 mL维持培养基中。去除预包被孔中的细胞外基质，每孔加入1.5 mL维持培养基。然后将0.5 mL细胞悬液分配至每孔中。轻轻摇动培养板，使hPSCs均匀分布。将培养板放入37°C、5%二氧化碳的培养箱中孵育至少24小时，以促进细胞贴壁。每天更换培养基，并在细胞融合度达到80%时进行传代。在第0天，从六孔板的一个孔中取出达到80%融合度的细胞，开始诱导分化。按照文本手稿中的描述，使用EDTA解离液收集细胞。去除EDTA溶液后，加入1 mL含有10 µM氟伐他汀的维持培养基，以终止细胞解离过程。用1 mL移液器收集细胞。将细胞悬液转移至100毫米超低吸附培养皿中，并向培养皿中加入含有10 µM氟伐他汀的9 mL维持培养基。轻轻晃动培养皿两次，使细胞均匀分布。然后，将其放入37摄氏度、5%二氧化碳的培养箱中。细胞培养至少24小时后，在显微镜下观察。在15 mL离心管中加入9 mL维持培养基和3 mL NIM。将细胞培养物转移至15 mL离心管中，并向培养皿中加入10 mL预热的NIM混合液。在60 × g条件下离心3分钟以收集细胞团块。然后使用5 mL移液器去除上清液，保留约500 µL，以避免细胞损失。向试管中加入 2 mL 混合物，并将悬浮液转移回同一培养皿中。轻轻摇动培养皿，使细胞聚集体均匀分布。然后将培养皿放回培养箱中。第-5天，从预先包被的培养皿中移除细胞外基质（ECM），并向每皿加入10 mL预热的NIM培养基。取出含有EBs的培养皿，在显微镜下检查EBs的质量，确保其形态透亮且呈圆形。将所有EBs收集至15 mL离心管中，静置5分钟使其沉降。然后，吸除大部分上清液，留下约 2 mL 培养基。计数胚胎小体（EBs）后，将其逐滴接种至含有 10 mL 神经诱导培养基（NIM）的包被培养皿中，接种密度约为每平方厘米 2–3 个 EBs。轻轻晃动培养皿使 EBs 分布均匀，随后放入培养箱中培养至少 24 小时。在第28至35天，使用钨针或带有1 mL注射器的针头，机械分离形态上可识别的视泡以及相邻的视网膜色素上皮。将分离的组织进行悬浮培养。将50-60个视泡放入每个100毫米的低吸附培养皿中，每个培养皿加入15 mL RDM，用于视网膜类器官的形成。每2至3天更换一次培养基，直至第42天。为启动视网膜分化，将人多能干细胞（hPSCs）解离成小细胞团块，并在悬浮培养中形成拟胚体（EBs），自第1天开始。第5天时，将EBs接种至包被有细胞外基质（ECM）的培养皿中，细胞逐渐从EBs中迁移而出。在第16天，将诱导培养基更换为RDM，导致神经视网膜区域开始形成并逐渐从培养皿中凸起，同时细胞形成类似视泡的结构，周围由视网膜色素上皮（RPE）细胞包绕。在第28至35天期间，视网膜类器官由神经视网膜组成，并连接到一个RPE球状结构上。在一侧，细胞形成。随着视网膜分化与特化过程的推进，人多能干细胞（hPSCs）产生了神经视网膜的多种亚型，这些亚型逐渐分层排列，模拟了天然人视网膜的结构特征。视网膜神经节细胞首先由视网膜前体细胞生成，并积聚于神经视网膜的基底层。通过该方案，视网膜类器官发育为高度成熟的光感受器细胞，包含丰富的视杆细胞和视锥细胞。感光细胞位于神经视网膜的顶端侧，而无长突细胞、水平细胞、双极细胞以及穆勒胶质细胞均位于神经视网膜的中间层。本实验方案的关键在于生成高质量的Ebs，并以适当的密度进行接种。

retinal-organoid-induction-system-for-derivation-3d-retinal-tissues

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视网膜器官诱导系统，用于从人类多能干细胞中提取3D视网膜组织

利用多能干细胞生成特化的视网膜细胞是干细胞治疗视网膜疾病发展过程中的一个关键转折点。本文介绍了一种简单的方法，可高效地生成用于基础研究、转化研究和临床研究的视网膜类器官和视网膜色素上皮细胞。...

无饲养层且无异源成分的培养条件用于生成人iPSC来源的视网膜细胞模型

本文介绍了一种逐步生成成熟人类视网膜类器官的实验方案，并将其应用于光感受器毒性检测，以筛选针对年龄相关性视网膜变性疾病——2型黄斑毛细血管扩张症（MacTel）的潜在药物候选分子。...

用于药物发现的人类视网膜类器官毒性筛选

采用自组织方法，我们开发了一种通过添加COCO显著提高感光细胞生成的方案。...

由人多能干细胞定向诱导视网膜类器官

本方案描述了一种利用简化的培养条件，将人诱导多能干细胞（hiPSCs）高效分化为视泡样细胞簇并生成神经视网膜类器官的方法，该培养过程结合了贴壁培养和悬浮培养体系。在视网膜培养物中成熟的视泡结构内，还可分离出其他眼部细胞类型，如视网膜色素上皮细胞（RPE）和角膜上皮细胞。...

由健康及视网膜疾病特异性人诱导性多能干细胞生成视网膜类器官

本方案描述了一种优化的三维神经视网膜诱导系统，可减少视网膜类器官的黏附与融合，具有高重复性和高效率。...

由人多能干细胞生成神经视网膜

小胶质细胞是视网膜中独特的常驻免疫细胞，在多种视网膜变性疾病中发挥关键作用。建立视网膜类器官与小胶质细胞的共培养模型，有助于更深入理解视网膜疾病的发病机制及发展过程。...

利用小胶质细胞构建视网膜类器官

该方案结合光学透明化与免疫标记技术，实现对整体视网膜类器官的全体积共聚焦成像。该方法可保持三维结构，从而实现对关键神经元通路的精细可视化，有助于深入研究视网膜成熟过程、空间组织特征，及其在疾病建模和个体化医学中的潜在应用。...

全胚层视网膜类器官的细胞分辨率成像

本文介绍了一种简化技术，用于从人尸体供体的眼球中切除角膜和摘除视网膜组织。此处描述的技术有助于获取高质量的组织，用于移植、手术或研究目的，同时避免损伤眼球的其他组织。...

一种简化的技术方法 原位 人眼球角膜切除与视网膜组织剜除

所述方法通过使用以下任一方式分离和表征人牙髓干细胞（hDPSCs） 牙髓组织的酶解离（DPSC-ED） 或 牙髓组织外植体中干细胞的直接迁出（DPSC-OG）。随后 体外...

利用两种不同方法分离、鉴定及比较源自恒牙的人牙髓干细胞的分化特性

我们采用视网膜切除术获取的视网膜样本，对视网膜脱离进行了转录组学分析。我们建立了一种可在手术标本与实验室之间保持RNA稳定性的操作流程。我们标准化了一种通过氯化铯超速离心法纯化RNA的方案，以确保所获得的纯化RNA适用于微阵列分析。...

使用jouRNAl对人视网膜手术标本进行转录组学分析

了解从人类多能干细胞诱导三维视网膜组织的优化方案，通过量化胚状体大小和接种密度提高分化效率与可重复性，无需视黄酸即可富集视锥细胞，适用于疾病建模和细胞治疗研究。

人多能干细胞衍生三维视网膜组织的视网膜类器官诱导系统

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