人多能干细胞衍生三维视网膜组织的视网膜类器官诱导系统

从人多能干细胞（hPSCs）诱导生成视网膜细胞的过程复杂且耗时。本优化方案能够以高重复性且零成本的方式生成视网膜组织。该方案的优势在于对拟胚体（EB）大小和接种密度进行量化，从而显著提高hPSCs向视网膜细胞诱导的效率和可重复性。

通过该方法，所有主要的视网膜细胞将依次出现，并重现视网膜发育的主要阶段。该技术将有助于视网膜变性疾病的疾病建模和细胞治疗。演示该实验流程的是来自实验室的博士研究生关媛媛（Yuanyuan Guan）和技术员谢冰冰（Bingbing Xie）。

首先，通过将1 mL的50倍浓缩的第三组分储存液加入50 mL的DMEM中，制备50 mL的ECM溶液。然后，向六孔板的每孔中加入1 mL上述制备的ECM溶液，在37摄氏度、5%二氧化碳条件下孵育1小时。根据生产商说明书配制hPSC维持培养基，并将其预热至室温30分钟。

从液氮罐中取出一支冻存的人多能干细胞（hPSCs）冻存管，置于37摄氏度水浴中孵育30秒。使用75%酒精喷雾小心消毒后，放入生物安全柜中。将冻存管中的细胞悬液转移至一支15毫米离心管中。

然后，使用 5 mL 移液器将 5 mL 预先温育的维持培养基逐滴加入离心管中，同时轻轻振荡管子以混匀 hPSCs。在 170 × g 条件下离心 5 分钟。使用 1 mL 移液器小心吸除大部分上清液，保留约 50 微升上清液，以避免细胞损失。

用移液器上下吹打，将沉淀重悬于1 mL维持培养基中。去除预包被孔中的细胞外基质，每孔加入1.5 mL维持培养基。然后将0.5 mL细胞悬液分配至每孔中。

轻轻摇动培养板，使hPSCs均匀分布。将培养板放入37°C、5%二氧化碳的培养箱中孵育至少24小时，以促进细胞贴壁。每天更换培养基，并在细胞融合度达到80%时进行传代。

在第0天，从六孔板的一个孔中取出达到80%融合度的细胞，开始诱导分化。按照文本手稿中的描述，使用EDTA解离液收集细胞。去除EDTA溶液后，加入1 mL含有10 µM氟伐他汀的维持培养基，以终止细胞解离过程。

用1 mL移液器收集细胞。将细胞悬液转移至100毫米超低吸附培养皿中，并向培养皿中加入含有10 µM氟伐他汀的9 mL维持培养基。轻轻晃动培养皿两次，使细胞均匀分布。

然后，将其放入37摄氏度、5%二氧化碳的培养箱中。细胞培养至少24小时后，在显微镜下观察。在15 mL离心管中加入9 mL维持培养基和3 mL NIM。

将细胞培养物转移至15 mL离心管中，并向培养皿中加入10 mL预热的NIM混合液。在60 × g条件下离心3分钟以收集细胞团块。然后使用5 mL移液器去除上清液，保留约500 µL，以避免细胞损失。

向试管中加入 2 mL 混合物，并将悬浮液转移回同一培养皿中。轻轻摇动培养皿，使细胞聚集体均匀分布。然后将培养皿放回培养箱中。

第-5天，从预先包被的培养皿中移除细胞外基质（ECM），并向每皿加入10 mL预热的NIM培养基。取出含有EBs的培养皿，在显微镜下检查EBs的质量，确保其形态透亮且呈圆形。将所有EBs收集至15 mL离心管中，静置5分钟使其沉降。

然后，吸除大部分上清液，留下约 2 mL 培养基。计数胚胎小体（EBs）后，将其逐滴接种至含有 10 mL 神经诱导培养基（NIM）的包被培养皿中，接种密度约为每平方厘米 2–3 个 EBs。轻轻晃动培养皿使 EBs 分布均匀，随后放入培养箱中培养至少 24 小时。

在第28至35天，使用钨针或带有1 mL注射器的针头，机械分离形态上可识别的视泡以及相邻的视网膜色素上皮。将分离的组织进行悬浮培养。将50-60个视泡放入每个100毫米的低吸附培养皿中，每个培养皿加入15 mL RDM，用于视网膜类器官的形成。

每2至3天更换一次培养基，直至第42天。为启动视网膜分化，将人多能干细胞（hPSCs）解离成小细胞团块，并在悬浮培养中形成拟胚体（EBs），自第1天开始。第5天时，将EBs接种至包被有细胞外基质（ECM）的培养皿中，细胞逐渐从EBs中迁移而出。

在第16天，将诱导培养基更换为RDM，导致神经视网膜区域开始形成并逐渐从培养皿中凸起，同时细胞形成类似视泡的结构，周围由视网膜色素上皮（RPE）细胞包绕。在第28至35天期间，视网膜类器官由神经视网膜组成，并连接到一个RPE球状结构上。在一侧，细胞形成。

随着视网膜分化与特化过程的推进，人多能干细胞（hPSCs）产生了神经视网膜的多种亚型，这些亚型逐渐分层排列，模拟了天然人视网膜的结构特征。视网膜神经节细胞首先由视网膜前体细胞生成，并积聚于神经视网膜的基底层。通过该方案，视网膜类器官发育为高度成熟的光感受器细胞，包含丰富的视杆细胞和视锥细胞。

感光细胞位于神经视网膜的顶端侧，而无长突细胞、水平细胞、双极细胞以及穆勒胶质细胞均位于神经视网膜的中间层。本实验方案的关键在于生成高质量的Ebs，并以适当的密度进行接种。