小鼠肝细胞类器官的建立与遗传操作

肝脏是哺乳动物最大的器官。它在新陈代谢和解毒中起着非常重要的作用。虽然肝脏在体外具有显着的再生能力，但从长远来看，在体外培养肝细胞仍然是一个非常大的挑战。

在这里，我们从成熟的肝细胞中建立肝细胞类器官。它保留了肝细胞在形态和功能上的主要特征。在本视频中，我们将详细介绍如何培养和传代这些类器官，以及如何对这些类器官进行遗传修饰。

首先，肝脏灌注和消化。准备所有区域和器械，并使其无菌。清洗小鼠并打开表皮和皮肤，然后尝试找到肝脏的袋烤箱。

将针头注入其中，然后捕获它。以每分钟5毫升的速度进行灌注，直到肝脏变白。将它们换入灌注缓冲液中，小心放置，观察肝脏，直到它变软。

通常需要三到五分钟，然后切开肝脏并放入盘子中，然后用剪刀将它们切成小块。经常上下打气。通常，将它们制成单个细胞需要10到15分钟。

然后用10到15分钟上下搅拌，并通过钳工喂它们。将它们制成单个细胞。收集50毫升管中的所有细胞，并以速度离心它们，然后收集所有每个板。

尽量把它们永远放在冰冷的冰里。制作单个细胞悬浮液并用细胞计数器计数。通常肝细胞如果快乐，它具有活泼的荧光。

第二部分，我们尝试让细胞坐下并进行类器官培养。我们收集所有的细胞悬浮液，并用一定的同心融合来计数细胞，然后我们混合。Metrogels.和代码介质。

通常，我们以1比2或1比3的比例取介质和metrogels。仔细混合后，我们将它们放在梯度板上。我们通常在24孔板孔处加入100微升。

将它们放入37度温度的培养箱中。20分钟后，我们将它们向前反转，底部在底部，然后在介质处。在两三天的反击中，我们通常会看到类器官出来。

这是我们类器官的典型形象。如果我们想进行传代或做一些遗传修饰方法，我们通常需要来自类器官的单细胞，我们用涂层洗涤缓冲液从计数器板中收集所有类器官。我们放下上清液，然后在涂层处洗涤缓冲液到板中，混合它们，所以上下打气。

然后我们通常用洗涤胶带缓冲器预洗所有吸头。为了避免所有类器官都倒在尖端上。然后，在冰上或没有冰上的新一批，我们通过中心融合收集所有类器官。

我们对待它们，有一个弯曲的弧度来去除所有的地铁凝胶。在冰上孵育20至30分钟后，所有metrogel都被移除。我们收集所有干净的类器官，并添加胰蛋白酶使它们变成单细胞。

加入胰蛋白酶后，我们将类器官处理到培养箱中。肝脏类器官需要5到10分钟才能变成单细胞。我们添加更多的洗涤缓冲液来停止三聚糖。

然后上下打动他们。对于选项过程，您可以再次清洗它们以除去所有胰蛋白酶。通过中心融合洗涤后，我们可以在细胞计数器下计数它们。

然后，我们将展示如何对这些肝细胞类器官进行交易或转染。首先，在试管上贴上你将要做的事情的标签，然后我们将根据制造商的说明进行视力转染。你需要，脂酰事实驯服INI MaX的摄政王。

我们添加。控制和特定的基因siRNA，并根据制造商的说明以最佳方式孵育它们。然后根据细胞浓度，我们加入RAN max并彻底混合它们。

然后，我们还将RAN max与最佳值分开添加，并将它们放在冰上。5分钟后，我们分别用不同的siRNA，特异性基因RANi和II对照分别调出RAN max混合物并彻底混合。再次将它们放在冰上，然后我们收集所有的类器官，缓慢的中央融合，滴下所有的上清液，我们将RNAi max，siRNA混合物加入到这个细胞板中，并彻底地上下激发它。

简而言之，将细胞和标记RNAi max和siRNA混合物在37度下臀化并孵育4至5小时。最后一部分，这些肝细胞类器官也可能被Lenti病毒感染。类似的信息作为siRNA转染进行。

对照和siRNA病毒管准备充分，并根据制造商的说明添加最佳。然后用像聚绿色这样的感染区域，然后我们添加不同的Lenti病毒，根据制造商的说明宪法。将类器官培养物中的单细胞悬浮液和各种颗粒在1.5毫升的eppendorf管中混合，加入，孔，混合它们板块该混合物，并在32度下浓缩1小时。

浓缩物融合将在500 G下进行，在37度下孵育4至5小时后，细胞悬浮液将被收集并置于metrogel中。然后再次将它们放入培养箱中。器官对形成效率或其他功能分析可以在7至10天后进行。

以下是我们的代表性结果。在图1A中，您可以看到来自小鼠的ALB-Cre Rosa 26-GFP或RFP肝细胞类器官。在图1B中，您可以看到染色中的Ki67阳性信号，这表明我们的肝细胞类器官正在增殖。

在图2A和2B中，这是我们基因干扰表达的代表性基因表达。在肝细胞类器官中进行遗传操作后，干扰效果非常有效。这是图2C，你可以看到在我们的小鼠类器官中使用卡森石技术进行基因操作后。

结论，我们的研究结果表明，肝细胞类器官可以在体外扩增并进行遗传操纵。总之，在本视频中，我们展示了如何进行肝脏灌注和消化以获得肝细胞。如何捕获肝细胞并使肝细胞类器官通过。

此外，我们还展示了如何进行siRNA和载体转染或Lenti病毒感染，以修饰这些类器官的遗传。此外，我们的类器官有两个短缺。首先，我们没有使用每个核心或毛皮核心来纯化肝细胞。

其次，我认为应该尝试更多的生长因子和信号传导来改善类器官的生长时间。