Name: 分离人原代瓣膜细胞进行体外疾病建模 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-04-16T14:15:00.000+00:00
Duration: 7 min 31 s
Description: 学习从人主动脉瓣组织中分离原代瓣膜内皮细胞和间质细胞的方法，用于钙化性主动脉瓣疾病的体外疾病建模研究。该方案可维持细胞约40%的存活率长达61小时，并通过免疫荧光验证细胞表型特异性。

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我们感谢 Jason Dobbins 对本文的深入讨论和审阅。感谢器官获取与教育中心（Center for Organ Recovery and Education）提供的帮助与支持，并感谢组织捐献者及其家属使本研究得以进行。所有患者样本均来自个体，这些个体参与的研究已获得匹兹堡大学机构审查委员会批准，并遵循《赫尔辛基宣言》的规定。通过器官获取与教育中心（CORE）获得的遗体组织，已获匹兹堡大学遗体研究与临床培训监督委员会（CORID）批准。
部分图示使用 Biorender.com 创建。
CSH 受美国国家心肺血液研究所 K22 HL117917 和 R01 HL142932 项目以及美国心脏协会 20IPA35260111 项目资助。

所有患者样本均来自经匹兹堡大学机构审查委员会批准的研究项目中的受试者，研究遵循《赫尔辛基宣言》的规定。通过器官获取与教育中心（CORE）获得的遗体组织样本，已获匹兹堡大学涉及遗体的研究与临床培训监督委员会（CORID）批准。
1. 批准与安全
<ol>
	<li>根据《赫尔辛基宣言》的要求，获取机构审查委员会（IRB）对采集患者样本或尸体组织的批准或豁免函。</li>
	<li>完成机构要求的与人体组织操作相关的培训，例如血源性病原体培训、生物医学人体受试者研究培训、隐私与信息安全培训，以及生物材料的运输与递送培训。</li>
</ol>
2. 后勤与准备
<ol>
	<li>手术样本
	<ol>
		<li>确保在手术室附近配备冰箱。在冰箱中放置预先贴好匿名编号标签的50 mL锥形管，每管含40 mL无菌分装的低温保存液，供手术人员使用。这些试管在4 °C条件下保存，有效期以原包装标注的截止日期为准。</li>
		<li>取出组织后，立即将瓣膜组织放入上述锥形管中。将锥形管置于密封的第二层容器内（如防漏塑料袋或塑料容器），并在容器上贴上生物危害标识。根据机构规定的生物危害物运输流程，组织样本需在冰上运输并由专人收取。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>尸体来源样本
	<ol>
		<li>将获取的器官完全浸入低温保存液中，放入密封的第二层容器内，并根据机构规定的生物危害物运输流程在冰上运输。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. 试剂准备
<ol>
	<li>至少在前一天制备胶原蛋白包被的培养板。
	<ol>
		<li>在50 mL锥形管中，加入5 mL异丙醇、8.7 mL乙酸和0.5 µg I型胶原蛋白粉末，再用无菌水定容至50 mL。混匀后经0.45 µm滤膜过滤。</li>
		<li>在无菌细胞培养超净台中，向6孔板和10 cm培养皿中加入足量的胶原溶液，使其刚好覆盖整个底部。盖上盖子，在室温下静置4–6小时。用无菌移液器吸除多余溶液，转移至新的无菌50 mL锥形管中，于4 °C保存，用于后续制备其他培养板。该溶液可在4 °C保存数月。</li>
		<li>将培养板置于37 °C培养箱中过夜干燥，随后放入可密封袋中，于4 °C保存。胶原包被的培养板和培养皿可保存数月。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>对以下物品进行高压灭菌：组织镊子、组织剪、棉签和纱布垫。</li>
	<li>VEC生长培养基：根据生产商说明书配制并使用内皮细胞生长培养基。避光保存于4 °C。使用前加热至37 °C，避免在预热浴中放置过久（10–15分钟足够）。配制后一个月内使用完毕。</li>
	<li>VIC生长培养基：在DMEM基础培养基（含4.5 g/L葡萄糖、L-谷氨酰胺补充剂、110 mg/L丙酮酸钠）30中添加10%热灭活胎牛血清以及100 I.U./mL青霉素和100 μg/mL链霉素。避光保存于4 °C，最长可保存3个月。使用前加热至37 °C，避免在预热浴中放置过久（10–15分钟足够）。</li>
	<li>使用前现配无菌冲洗液。在无菌PBS中加入2.5 µg/mL杀菌剂、0.05 mg/mL庆大霉素和5 µg/mL抑菌剂。</li>
	<li>使用前现配无菌胶原酶溶液。将5 mg胶原酶II加入5 mL无菌新鲜DMEM基础培养基中，充分混匀后经0.45 µm滤膜过滤除菌。使用前置于冰上保存。</li>
</ol>
4. 组织制备与处理
注意：在开始实验前，必须获得使用人体组织的机构批准。在处理组织时，必须穿戴以下个人防护装备（PPE）：一次性防液体渗透的围裙式隔离衣，或专用的前扣式实验服并搭配防液体渗透的围裙及一次性袖套；全面罩面屏，或佩戴安全眼镜并配合外科口罩；双层手套；包覆脚趾的鞋子；以及覆盖腿部的衣物。组织制备用于钙化评估（第5节）和细胞分离（第6和第7节）的完整工作流程图分别如图1A、B所示。
<ol>
	<li>收到尸体器官标本后，切除主动脉根部并浸入含有无菌冲洗液的50 mL锥形管中；收到手术标本后，从运输容器中取出，并浸入含有无菌冲洗液的50 mL锥形管中。将装有组织的管子置于冰桶中，在摇床上室温（RT）混合10分钟。 
	注：组织应在尽可能接近获取时间时进行处理，以获得最佳的细胞回收率；然而，即使在切除后长达61小时仍可收集到活细胞，且数据显示，随着时间延长，VIC细胞比VEC细胞更具稳定性。若无法立即处理组织，应尽可能取出组织，执行步骤4.1，然后将组织放回新鲜的无菌冷藏保存液中，并在4 °C下保存直至可继续操作。夜间或周末手术获取的瓣膜可在4 °C下保存于40 mL冷藏保存液中，并仍可在获取后超过2天仍能获得活细胞。</li>
	<li>用70%乙醇喷洒管子，转移至无菌操作台。取出组织并切除两个瓣叶（图2A）。将其中一个瓣叶放入一个冷冻管中（若后续分析需要多个小片段，则可分装至2-3个冷冻管），通过浸入液氮中快速冷冻，随后在-80 °C下保存。
	<ol>
		<li>若瓣膜为二叶式，仅切除一个瓣叶。使用剪刀从结节至铰链处将瓣叶纵向剪成两半。取其中一半用于快速冷冻，另一半用于步骤4.3。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将第二个瓣叶用于石蜡包埋，以评估钙化程度：从结节至铰链处将其纵向切成两半。将两部分均放入浸有4%多聚甲醛（PFA）的包埋盒中，室温下置于摇床上固定，时间不少于2小时但不超过4小时。 
	注：固定时间过长会导致免疫荧光染色背景增强。完成步骤4.2和4.3后，立即进入第6节操作，并在完成步骤6.12后再返回执行步骤4.4。</li>
	<li>固定后，用新鲜PBS浸泡组织，清洗3-4次，每次1小时。清洗后，样本若需要可在4 °C的PBS中保存数月。在包埋前立即进行下一步操作。</li>
	<li>逐步从PBS过渡至70%乙醇。每步使用1:4、1:1、4:1的70%乙醇:PBS混合液以及纯70%乙醇，各清洗30-60分钟。</li>
	<li>按照既定方案包埋组织，使切片可显示瓣叶的三层结构（图1A）31。或者，如有条件，可将组织送至病理科核心设施进行包埋与切片。</li>
	<li>处理完组织后，妥善处置或存放个人防护装备（PPE），并立即洗手。使用1:10稀释的漂白剂或洗涤剂消毒剂对所有设备、表面以及固体和液体废物进行去污处理。去污作用时间应持续20分钟，随后用70%乙醇冲洗。根据制造商说明，使用支原体喷雾处理细胞培养操作台。</li>
</ol>
5. 钙含量的Von Kossa染色
注意：这可以在细胞分离和细胞系建立后较长时间进行，但务必将来自治疗组织的钙化水平与所建立的原代细胞系相关文件关联起来。
<ol>
	<li>将5或10 µm厚的石蜡切片切至载玻片上，在65 °C下烘烤1小时，然后冷却至室温。</li>
	<li>使用新鲜配制的溶液，按以下步骤进行脱蜡：100%二甲苯处理30分钟，两次；100%乙醇处理3分钟，两次；&#160;90%乙醇处理3分钟；80%乙醇处理3分钟；70%乙醇处理3分钟；50%乙醇处理3分钟；超纯水冲洗3分钟；之后保持在超纯水中直至后续步骤。 
	注意：上述时间为最低要求，各步骤可适当延长。</li>
	<li>根据制造商说明书进行Von Kossa染色。</li>
	<li>在显微镜下评估整个瓣膜区域，并将组织归类为对照组织（无钙化迹象）或CAVD（存在任何钙化证据，图2B）。</li>
</ol>
6. 瓣膜内皮细胞（VEC）的分离、扩增与鉴定
<ol>
	<li>在无菌细胞培养操作台中，打开含有剩余瓣膜小叶的锥形管，将小叶转移至一个新的盛有冰冻PBS的50 mL锥形管中。盖紧管盖，在室温下轻轻倒置或置于摇床上孵育2分钟。</li>
	<li>将组织移至含有5-7 mL冷胶原酶溶液的60 mm培养皿中。用镊子将瓣膜两侧在溶液中浸入3-4次。将组织在37 °C细胞培养孵箱中孵育5-10分钟，每隔2分钟轻轻摇动3-4次。</li>
	<li>从培养皿中取出2 mL溶液，置于无菌的15 mL锥形管中。将镊子置于结节处，用干燥无菌的棉签从镊子向铰链方向擦拭，并在移动棉签的同时旋转棉签，沿小叶表面进行操作。每次擦拭后，将棉签在15 mL锥形管的溶液中涮洗，以去除细胞。重复上述操作，彻底擦拭组织表面，然后翻转组织，对另一侧重复相同步骤。</li>
	<li>用一只手用镊子夹住瓣膜瓣片，另一只手持1 mL移液器，用培养皿中的溶液冲洗瓣膜瓣片的表面。冲洗后，将培养皿中含血管内皮细胞（VECs）的全部溶液转移至含有拭子细胞的同一15 mL离心管中，进入步骤6.5。将剩余的瓣膜组织放入新的15 mL离心管中，加入7 mL无菌胶原酶溶液，进入步骤7.1。</li>
	<li>将含有VEC的试管在180 x g条件下离心 g 离心5分钟以沉淀分离得到的血管内皮细胞（VECs）。吸除上清液，并将细胞重悬于3 mL VEC生长培养基中。再次离心后弃去上清液。将细胞重悬于1 mL生长培养基中，使用血细胞计数板和台盼蓝染色法测定细胞数量。</li>
	<li>将VEC细胞沉淀重悬于2 mL VEC生长培养基中，并将细胞接种至6孔板中预先包被胶原的孔内，细胞密度约为5 x 10⁵5 细胞/平方厘米2让细胞生长至少3-4天，然后移除培养基并更换为新鲜培养基。每4天重复换液一次。VEC细胞将形成鹅卵石状的细胞簇（图3B，左侧面板。</li>
	<li>当血管内皮细胞（VEC）补片覆盖 &#62;80% 的培养板面积，细胞以约 1.3 x 104 细胞/厘米²2 取决于其生长速度（如果在不到1周内达到80%，则以略低的细胞数/cm²进行传代）2).</li>
	<li>用2 mL DPBS洗涤细胞两次，然后加入足量解离试剂以完全覆盖细胞表面。在37 °C孵育2–3分钟，并注意观察以确保细胞未过度孵育。加入等体积VEC生长培养基终止消化，将液体转移至15 mL离心管中。在180 x g条件下离心 g 孵育5分钟，弃上清，根据所需孔板数量，用适当体积的培养基重悬。 
	注意：血管内皮细胞（VECs）在扩增至10 cm培养皿时，有时会因增殖而失去其原有形态并发生表型改变。这种情况通常发生在建系和扩增细胞系过程中，当VECs以较低汇合度接种时。</li>
	<li>为确保获得纯培养物，每次传代时建议使用CD31+超顺磁性微珠。</li>
	<li>对于 1 × 108 细胞数量较少时（一个10 cm培养皿或更少），按照生产商说明书洗涤，制备25 µL超顺磁性微珠。 
	注意：建议在进行VEC的胰蛋白酶消化之前完成步骤6.10。</li>
	<li>按照步骤6.8的方法消化细胞，但重悬于500 µL含0.1% BSA、pH 7.4的PBS中，并置于2 mL离心管内。向该含细胞的2 mL离心管中加入500 µL经洗涤并重悬的磁珠，于4 °C在旋转仪上孵育20分钟。</li>
	<li>将离心管置于磁力架上2分钟。保持离心管仍在磁力架上时，小心吸去上清液。从磁力架上取下离心管，加入1 mL含0.1% BSA的新鲜PBS，轻轻吹打混匀2–3次，再放回磁力架上静置2分钟。重复此洗涤步骤2次。最后一次去除缓冲液后，将细胞重悬于适量的新鲜培养基中，用于重新接种。 
	注意：细胞中仍会含有磁珠，但这些磁珠不会影响细胞生长，将在后续传代过程中被去除。</li>
	<li>细胞扩增后，除形态学观察外，还需通过免疫荧光染色检测内皮细胞表型，应呈阳性表达冯·维勒布兰德因子（vWF）、钙黏蛋白5（CDH5）或血小板内皮细胞黏附分子-1/CD31（PECAM-1/CD31），并呈阴性表达&#160;VIC标志物，如钙调蛋白1（CNN）或α-2平滑肌肌动蛋白（αSMA， 图4，左侧面板。</li>
</ol>
7. 瓣膜间质细胞（VIC）的分离、扩增与保存
<ol>
	<li>如步骤6.4所述，在从瓣膜组织中去除血管内皮细胞（VECs）后，瓣叶&#160;置于15 mL锥形管中，加入7 mL胶原酶溶液。在细胞培养箱中孵育12小时，管盖稍松以允许气体交换。使用胶原酶溶液孵育时间延长至18小时仍可成功分离VICs。</li>
	<li>孵育后，在无菌细胞培养操作台中，使用血清移液管轻轻吹打组织，以确保瓣叶组织中的间质细胞被充分释放。</li>
	<li>移除细胞悬液，并通过0.70 μm滤器过滤至50 mL锥形管中。</li>
	<li>向50 mL离心管中加入7 mL VIC生长培养基，以180 x g离心 g 5分钟。吸除上清液，将细胞沉淀重悬于1 mL VIC生长培养基中，并测定细胞数量。将VIC以1.3 × 10⁵个细胞接种至60 mm组织培养处理培养皿中4 细胞/厘米²2.</li>
	<li>让细胞生长至少1-2天后再更换培养基。移除培养基，用DPBS洗涤两次以去除残留碎片，然后更换为新鲜生长培养基。每2-3天补充一次培养基。VICs将呈现成纤维细胞形态（图3B，右侧面板。</li>
	<li>当VICs达到汇合度 &#62;90%，用DPBS洗涤两次以去除多余的培养基，加入适量预温的解离试剂覆盖培养皿（例如，每10 cm培养皿加2–3 mL），在37 °C培养箱中孵育。孵育2–3分钟后，血管内皮细胞（VICs）将从培养皿上脱落。加入4–6 mL预温的培养基。 
	注意：如果细胞从培养板上脱落所需时间超过3分钟，可能是解离试剂已失去活性。必要时，可使用细胞刮轻轻刮下细胞。</li>
	<li>将细胞悬液转移至离心管中，轻轻离心，180 x g 孵育5分钟。移除上清液后，用预热的VIC培养基轻轻重悬细胞沉淀，使用血细胞计数板和台盼蓝染色确定活细胞数量。将活细胞以原始培养皿密度的1:2比例接种（即约1 × 106 每10 cm培养皿的细胞数或1.3 × 104 细胞/厘米²2).</li>
	<li>通过免疫荧光标记物（如αSMA、CNN或SM22α）的阳性染色以及内皮细胞标记物（如CD31、CDH5或vWF）的阴性染色来评估VIC表型（图4，右侧面板）。 
	注意：本方案流程中随机选取一个瓣膜小叶用于VEC和VIC的分离，其余瓣膜小叶则用于Von Kossa染色（第5节）和速冻保存。</li>
</ol>
8. 细胞的长期保存
<ol>
	<li>扩增后，将细胞冻存以长期保存。用 2–5 mL DPBS 洗涤细胞两次，然后加入足量的解离试剂，按照步骤 6.8 和 7.6 的方法使细胞脱离。加入等体积的 VEC 或 VIC 生长培养基终止消化，并将细胞悬液转移至 15 mL 离心管中。</li>
	<li>使用血细胞计数板和台盼蓝测定活细胞数量。</li>
	<li>以 180 × g 离心 5 分钟。</li>
	<li>用预冷的条件培养基重悬细胞，使细胞密度约为 3 × 106 个细胞/mL。</li>
	<li>轻轻旋转加入等体积预冷的 2× 冻存液，使细胞终浓度约为 1.5 × 106 个细胞/mL。</li>
	<li>将 1 mL 细胞悬液分装至冻存管中。将冻存管放入细胞冻存盒，盖紧后倒置 5–6 次，确保细胞保持悬浮状态。将冻存盒置于 -80 °C 环境中 6–72 小时，或按照冻存盒说明书操作。从 -80 °C 取出冻存管，转移至液氮中进行长期保存。</li>
</ol>

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<li>Martinsson, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Temporal+trends+in+the+incidence+and+prognosis+of+aortic+stenosis%3A+A+nationwide+study+of+the+Swedish+population%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Temporal trends in the incidence and prognosis of aortic stenosis: A nationwide study of the Swedish population.</a> Circulation. 131, 988-994 (2015).</li>
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<li>Xu, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-type+transcriptome+atlas+of+human+aortic+valves+reveal+cell+heterogeneity+and+endothelial+to+mesenchymal+transition+involved+in+calcific+aortic+valve+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Arteriosclerosis%2C+Thrombosis+and+Vascular+Biology%22%5BJournal%5D)">Cell-type transcriptome atlas of human aortic valves reveal cell heterogeneity and endothelial to mesenchymal transition involved in calcific aortic valve disease.</a> Arteriosclerosis, Thrombosis and Vascular Biology. 40, 2910-2921 (2020).</li>
</ol>

IS 获得 Atricure 和 Medtronic 提供的机构科研支持，并担任 Medtronic Vascular 的顾问。上述利益冲突均与本研究无关。其他所有作者均无任何需要披露的内容。

获取人类的正常组织与病变组织对于体外和离体疾病建模至关重要；然而，尽管人们经常讨论从实验室到临床转化的挑战，反过来从手术室到实验室的过程——即从手术切除到实验研究——同样充满困难。基础科学家若要获得原代人类组织样本，必须与有投入的外科科学家开展合作，后者需拥有包括护士、手术技术人员、医师助理、医学生、住院医师以及临床方案管理人员在内的团队，能够完成患者的入组与知情同意，参与并协助切除组织的正确处理，并协调组织取材所需的各项后勤工作。若所有相关人员未能尽最大努力缩短组织切除至细胞分离之间的时间，则关键的细胞材料及其所携带的信息将发生不可逆的改变或丢失。
保持组织标本活性的关键在于使用冷保存液。该溶液与UPMC及其他移植医疗中心的器官移植团队所使用的溶液相同。相较于从手术室较快获取但保存在冷PBS中的组织，从供体切除后数小时才获取的尸体组织获得了更高的细胞得率。这一偶然发现对于从人体组织中获取细胞至关重要。手术组织从切除到送至实验室的获取时间通常为1至5小时，而尸体组织则可长达24小时以上。相比之下，动物组织的获取与处理通常可在安乐死后数分钟内完成，这更有利于维持细胞活性。在缺乏冷保存...

主动脉瓣钙化性疾病（CAVD）是一种慢性病理过程，其特征是主动脉瓣叶发生炎症、纤维化和大范围钙化。瓣叶进行性重构和钙化（称为主动脉硬化）可导致血流受阻（即主动脉瓣狭窄），进而引发中风，并导致心力衰竭。目前，CAVD的唯一治疗方法是外科主动脉瓣置换术或经导管主动脉瓣置换术（分别为SAVR和TAVR）。尚无非手术手段能够阻止或逆转CAVD的进展；若不进行瓣膜置换，患者在2至3年内的死亡率接近50%1,2,3。明确驱动该疾病发展的潜在机制，将有助于发现潜在的新型治疗策略。
在健康的成年人中，主动脉瓣瓣叶厚度约为一毫米，其主要功能是维持血液从左心室单向流出4。三个瓣叶中的每一个均由一层瓣膜内皮细胞（VECs）构成，该层细胞覆盖在瓣叶的外表面并发挥屏障作用。VECs通过调节通透性、炎症细胞黏附以及旁分泌信号传导来维持瓣膜稳态5,6,7。瓣膜间质细胞（VICs）构成了瓣叶内大多数细胞8。VICs在瓣叶中排列为三个不同的层次，分别为心室层（ventricularis）、疏松层（spongiosa）和纤维层（fibrosa）9。心室层面向左心室，含有胶原纤维和弹性蛋白纤维。中间的疏松层含有丰富的蛋白聚糖，可在心动周期中提供剪切柔韧性。外层的纤维层位于主动脉侧的流出道表面附近，富含I型和III型纤维状胶原，可在舒张期提供足够的强度以维持瓣叶闭合10,11,12。VICs通常处于静息状态，但炎症、细胞外基质（ECM）重塑以及机械应力等因素可能破坏VIC的稳态8,9,13,14,15,16。当稳态失衡时，VICs被激活，并获得类似肌成纤维细胞的表型，具备增殖、收缩以及分泌可重塑细胞外微环境的蛋白质的能力17。活化的VICs可进一步转化为钙化细胞，这一过程类似于间充质干细胞（MSC）向成骨细胞的分化过程15,17,18,19,20,21,22,23,24,25。
钙化似乎起源于富含胶原蛋白的纤维层，由VEC和VIC共同参与，随后扩展并侵入瓣膜的其他层次8。因此，可以明确的是，VEC和VIC均能响应刺激，上调成骨相关基因的表达；然而，驱动成骨基因激活的具体事件，以及细胞与瓣膜细胞外基质之间复杂的相互作用，目前仍不明确。小鼠模型并非研究非遗传性CAVD发病机制的理想来源，因为小鼠不会自发形成CAVD26,27，因此必须使用原代人组织及其分离出的原代细胞系。特别是，获得数量充足且质量良好的细胞至关重要，因为三维细胞培养和类器官建模领域正在不断发展，未来有望成为基于人体组织的、替代小鼠模型的体外研究手段。
本方法的目的是分享一种工作流程，该流程已确立了有效分离和培养从人类供体手术切除瓣膜中获得的血管内皮细胞（VECs）和瓣膜间质细胞（VICs）的条件。先前的研究表明&#160;成功分离猪的血管内皮细胞和血管间质细胞28&#160;和小鼠瓣膜29据我们所知，这是首次描述从人体组织中分离这些细胞的方法。本文所述方案适用于人切除瓣膜，并通过引入一种冷保存液显著克服并改善了组织切除后至实验室处理之间因常较长的获取时间所造成的损伤；该缓冲溶液在器官移植临床中常用，可有效稳定切除组织中的细胞。本文所述方案还展示了如何确定细胞表型，并确保细胞存活率高且交叉污染极少。

<table><tbody><tr><td>0.45 &amp;mu;m 滤膜</td><td>Thermo Scientific</td><td>7211345</td><td>制备胶原蛋白包被的培养板</td></tr><tr><td>10 cm 细胞培养板</td><td>Greiner Bio-One</td><td>664160</td><td>细胞培养/细胞系扩增</td></tr><tr><td>10 mL 血清移液管</td><td>Fisher</td><td>14955234</td><td>VEC/VIC 分离、细胞培养、细胞系扩增</td></tr><tr><td>1000 &amp;mu;L 滤芯吸头</td><td>VWR</td><td>76322-154</td><td>细胞培养/细胞系扩增</td></tr><tr><td>10XL 滤芯吸头</td><td>VWR</td><td>76322-132</td><td>细胞培养/细胞系扩增</td></tr><tr><td>15 mL 锥形管</td><td>Thermo Scientific</td><td>339650</td><td>组织储存、VIC/VEC 分离</td></tr><tr><td>16% 甲醛水溶液</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>15710S</td><td>组织和细胞固定剂</td></tr><tr><td>190 证明乙醇</td><td>Decon</td><td>2801</td><td>消毒</td></tr><tr><td>1x DPBS：无钙、无镁</td><td>Gibco</td><td>14190250</td><td>生理盐水溶液。VIC/VEC 分离</td></tr><tr><td>1x PBS</td><td>Fisher</td><td>BP2944100</td><td>生理盐水溶液。组织制备、VIC/VEC 分离</td></tr><tr><td>20 &amp;mu;L 滤芯吸头</td><td>VWR</td><td>76322-134</td><td>细胞培养/细胞系扩增</td></tr><tr><td>200 证明乙醇</td><td>Decon</td><td>2701</td><td>脱蜡组织样本</td></tr><tr><td>2-丙醇</td><td>Fisher</td><td>A416P 4</td><td>制备胶原蛋白包被的培养板</td></tr><tr><td>5 mL 血清移液管</td><td>Fisher</td><td>14955233</td><td>VEC/VIC 分离、细胞培养、细胞系扩增</td></tr><tr><td>50 mL 锥形管</td><td>Thermo Scientific</td><td>339652</td><td>组织储存、VIC/VEC 分离</td></tr><tr><td>60 mm 培养皿</td><td>GenClone</td><td>25-260</td><td>VEC 分离</td></tr><tr><td>6 孔细胞培养板</td><td>Corning</td><td>3516</td><td>细胞培养/细胞系扩增</td></tr><tr><td>冰醋酸</td><td>Fisher</td><td>BP2401 500</td><td>制备胶原蛋白包被的培养板</td></tr><tr><td>AlexaFluor 488 鬼笔环肽</td><td>Invitrogen</td><td>A12379</td><td>荧光 F-肌动蛋白复染剂</td></tr><tr><td>Belzer UW 冷保存移植溶液</td><td>Bridge to Life</td><td>BUW0011L</td><td>组织保存溶液</td></tr><tr><td>牛血清白蛋白，第五组分 — 无脂肪酸 25g</td><td>Bioworld</td><td>220700233</td><td>使用 CD31+ Dynabeads 验证 VEC</td></tr><tr><td>Calponin 1 抗体&amp;nbsp;</td><td>Abcam</td><td>ab46794</td><td>一抗（VIC 阳性染色）</td></tr><tr><td>CD31 (PECAM-1) (89C2)</td><td>Cell Signaling</td><td>3528</td><td>一抗（VEC 阳性染色）</td></tr><tr><td>CD31+ Dynabeads</td><td>Invitrogen</td><td>11155D</td><td>使用 CD31+ Dynabeads 验证 VEC</td></tr><tr><td>CDH5</td><td>Cell Signaling</td><td>2500</td><td>一抗（VEC 阳性染色）</td></tr><tr><td>孔径为 0.70 &amp;mu;m 的细胞筛</td><td>Corning</td><td>431751</td><td>VIC 分离</td></tr><tr><td>胶原蛋白 I，大鼠尾部蛋白</td><td>Gibco</td><td>A1048301</td><td>制备胶原蛋白包被的培养板</td></tr><tr><td>胶原酶 II</td><td>Worthington Biochemical Corporation</td><td>LS004176</td><td>组织消化。组织制备、VIC/VEC 分离</td></tr><tr><td>Conflikt 即用型消毒喷雾</td><td>Decon</td><td>4101</td><td>消毒</td></tr><tr><td>Countess II 自动细胞计数仪</td><td>Invitrogen</td><td>A27977</td><td>自动细胞计数</td></tr><tr><td>Countess II 可重复使用载玻片盖片</td><td>Invitrogen</td><td>2026h</td><td>自动细胞计数仪所需盖片</td></tr><tr><td>盖玻片</td><td>Fisher</td><td>125485E</td><td>安装瓣膜样本</td></tr><tr><td>冻存管</td><td>Olympus Plastics</td><td>24-202</td><td>冷冻细胞/组织样本</td></tr><tr><td>含 CLOROMAX 的消毒漂白剂 - 浓缩配方&amp;nbsp;</td><td>Clorox</td><td>N/A</td><td>消毒</td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Gibco</td><td>10569044</td><td>生长培养基。VIC 扩增</td></tr><tr><td>EBM - 内皮细胞基础培养基，无酚红 500</td><td>Lonza Walkersville</td><td>CC3129</td><td>生长培养基。VEC 扩增</td></tr><tr><td>EGM-2 内皮细胞培养基-2 - 1 套装 SingleQuot 试剂盒</td><td>Lonza Walkersville</td><td>CC4176</td><td>生长培养基补充剂。VEC 扩增</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>EVOS FL 显微镜</td><td>Life Technologies</td><td>型号：AME3300</td><td>荧光成像</td></tr><tr><td>EVOS XL 显微镜</td><td>Life Technologies</td><td>AMEX1000</td><td>细胞系扩增过程中观察细胞</td></tr><tr><td>胎牛血清 - 优质选择</td><td>R&amp;D Systems</td><td>S11550</td><td>VIC 扩增</td></tr><tr><td>精细剪刀</td><td>Fine Science Tools</td><td>14088-10</td><td>组织制备、VIC/VEC 分离</td></tr><tr><td>Fisherbrand 细胞刮刀</td><td>Fisher</td><td>08-100-241</td><td>VIC 扩增</td></tr><tr><td>Fungizone</td><td>Gibco</td><td>15290-026</td><td>抗真菌剂：组织制备、VIC/VEC 分离</td></tr><tr><td>庆大霉素</td><td>Gibco</td><td>15710-064</td><td>抗生素：组织制备、VIC/VEC 分离</td></tr><tr><td>载玻片</td><td>Globe Scientific Inc</td><td>1358L</td><td>安装瓣膜样本</td></tr><tr><td>山羊抗小鼠 488</td><td>Invitrogen</td><td>A11001</td><td>荧光二抗</td></tr><tr><td>山羊抗小鼠 594</td><td>Invitrogen</td><td>A11005</td><td>荧光二抗</td></tr><tr><td>山羊抗兔 488</td><td>Invitrogen</td><td>A11008</td><td>荧光二抗</td></tr><tr><td>山羊抗兔 594</td><td>Invitrogen</td><td>A11012</td><td>荧光二抗</td></tr><tr><td>Invitrogen Countess II FL 可重复使用载玻片</td><td>Invitrogen</td><td>A25750</td><td>自动细胞计数仪所需载玻片</td></tr><tr><td>Invitrogen NucBlue 固定细胞 ReadyProbes 试剂（DAPI）</td><td>Invitrogen</td><td>R37606</td><td>荧光核复染剂</td></tr><tr><td>LM-HyCryo-STEM - 2X 干细胞冻存培养基</td><td>HyClone Laboratories, Inc.</td><td>SR30002</td><td>冷冻细胞储存</td></tr><tr><td>封片剂</td><td>Fisher Chemical Permount</td><td>SP15-100</td><td>安装瓣膜样本</td></tr><tr><td>Mr. Frosty 冷冻容器</td><td>Nalgene</td><td>51000001</td><td>用于控制样品冷冻的容器</td></tr><tr><td>Mycoplasma-ExS 喷雾剂</td><td>PromoCell</td><td>PK-CC91-5051</td><td>消毒</td></tr><tr><td>青霉素-链霉素</td><td>Gibco</td><td>15140163</td><td>抗生素。VIC 扩增</td></tr><tr><td>Plasmocin</td><td>Invivogen</td><td>ANTMPT</td><td>抗支原体。VIC/VEC 分离与扩增</td></tr><tr><td>SM22a 抗体</td><td>Abcam</td><td>ab14106</td><td>一抗（VIC 阳性染色）</td></tr><tr><td>标准型剪刀</td><td>Fine Science Tools</td><td>14001-14</td><td>组织制备、VIC/VEC 分离</td></tr><tr><td>无菌棉签</td><td>Puritan</td><td>25806 10WC</td><td>VEC 分离</td></tr><tr><td>Swingsette 人体组织包埋盒</td><td>Simport Scientific</td><td>M515-2</td><td>组织包埋容器</td></tr><tr><td>Taylor 镊子（17cm）</td><td>Fine Science Tools</td><td>11016-17</td><td>组织制备、VIC/VEC 分离</td></tr><tr><td>台盼蓝溶液，0.4%</td><td>Gibco</td><td>15250061</td><td>细胞计数溶液</td></tr><tr><td>TrypLE Express 酶</td><td>Gibco</td><td>12604021</td><td>消化传代 VIC/VEC</td></tr><tr><td>Von Kossa 试剂盒</td><td>Polysciences</td><td>246331</td><td>对组织石蜡切片进行钙化染色</td></tr><tr><td>von Willebrand 因子抗体</td><td>Abcam</td><td>ab68545</td><td>一抗（VEC 阳性染色）</td></tr><tr><td>二甲苯</td><td>Fisher Chemical</td><td>X3S-4</td><td>脱蜡组织样本</td></tr><tr><td>&amp;alpha;SMA 抗体</td><td>Abcam</td><td>ab7817</td><td>一抗（VIC 阳性染色）</td></tr></tbody></table>

用于体外疾病建模的人原代瓣膜细胞分离

Isolation of Human Primary Valve Cells for In vitro Disease Modeling

主动脉瓣钙化性疾病（CAVD）存在于近三分之一的老年人群中。主动脉瓣的增厚、僵硬和钙化会导致主动脉瓣狭窄，并促进心力衰竭和中风的发生。该疾病的发病机制是多因素的，炎症、细胞外基质重塑、湍流以及机械应力和应变等刺激因素均会促进瓣膜内皮细胞和瓣膜间质细胞向成骨方向分化。然而，驱动健康细胞向钙化细胞发生成骨转化的精确起始因素尚未完全明确。此外，目前针对CAVD引起的主动脉瓣狭窄的唯一治疗方法是主动脉瓣置换术，即通过手术切除原生瓣膜（外科主动脉瓣置换术，SAVR），或经导管植入完全可折叠的替代瓣膜（经导管主动脉瓣置换术，TAVR）。这些外科手术成本高昂且伴随严重风险；因此，发现新的药物治疗靶点至关重要。为此，本研究建立了一种工作流程，利用患者手术切除组织和供体尸体组织，体外构建患者特异性的瓣膜细胞原代细胞系，用于疾病建模。该方案引入了一种常用于器官移植的低温保存液，以减轻组织切除后至实验室处理期间因常较长的获取时间所造成的损伤，从而显著稳定切除组织中细胞的状态。本研究结果表明，分离得到的瓣膜细胞在供体瓣膜切除后数天内，仍能在体外培养中保持其增殖能力以及内皮细胞和间质细胞的表型特征。利用这些材料，可同时获取对照组和CAVD患者的细胞，并建立相应的对照和疾病细胞系。

上述方案概述了处理人类瓣膜组织并从中分离和建立可存活细胞系所需的步骤。主动脉瓣瓣叶被分别处理，用于石蜡包埋、快速冷冻以长期保存用于生化或遗传分析，以及消化以分离血管内皮细胞（VECs）和瓣膜间质细胞（VICs）（图1）。尽管手术标本通常具有主动脉瓣狭窄的临床诊断，并可能表现出肉眼可见的严重钙化结节，但在大量老年人群（>65岁）中也普遍存在主动脉瓣钙化现象32。鉴于该现象的高发性，所有组织样本——无论是手术来源还是尸体来源——均需进行Von Kossa染色或类似处理，以评估是否存在钙化（图2）。
研究发现，使用低温保存液可显著稳定切除瓣膜组织中的细胞。低温保存液常用于活体器官移植，在供体器官摘取前后通过灌注方式注入器官，并在冰上运输期间保留在该器官的血管系统中。观察发现，相较于手术组织，供体样本更容易建立血管内皮细胞（VEC）系，且供体来源的细胞系更有可能在多次传代后仍保持其内皮细胞形态。这一点令人困惑，因为供体组织通...

本方案描述了在手术主动脉瓣置换术过程中或从尸体组织中获取人类主动脉瓣，并随后分离、扩增和鉴定患者特异性的原代瓣膜内皮细胞和间质细胞的方法。文中包含了确保细胞活力和表型特异性的关键操作步骤细节。

主动脉瓣钙化性疾病（CAVD）在老年人群中的发病率接近三分之一。主动脉瓣的增厚、僵硬和钙化……

分离人原代瓣膜内皮细胞和间质细胞对于理解钙化性主动脉瓣疾病发病机制至关重要。当瓣膜从原生组织中切除后，细胞活力会下降。因此，我们已确定一种可延长细胞活力的方法。收到提取的瓣膜组织样本后，取出主动脉根部，并将组织浸入含有无菌冲洗液的50毫升锥形管中。在冰浴中摇床上孵育10分钟后，用70%乙醇喷洒管子表面。在无菌细胞培养罩内，将组织转移至培养皿中，并切除两个瓣叶。取一片小叶放入冻存管中，用液氮速冻，随后于-80摄氏度保存。为进行钙含量染色固定组织，将第二片小叶从根瘤至叶柄处纵向切开，将两部分组织均放入浸没于4%多聚甲醛中的包埋盒中。然后将整个装置置于摇床上，室温下固定，时间不少于2小时，但不超过4小时。为了分离瓣膜间质细胞，将瓣叶转移至一个新的50毫升锥形管中，管内含有预冷的PBS，并将管子置于摇床上，在室温下摇动两分钟。混匀后，将组织转移至一个60毫米培养皿中，皿内含有5至7毫升的冷胶原酶溶液。用镊子将瓣叶的两面在溶液中浸入浸出3至4次，然后将组织置于细胞培养孵箱中，在37摄氏度下孵育5至10分钟，每隔两分钟轻轻摇动组织3至4次。孵育结束时，将两毫升溶液从培养皿转移至无菌的15毫升锥形管中。用镊子夹住小叶的节结部位，使用无菌棉签沿小叶旋转棉签，将组织从镊子处擦拭至铰链处。擦拭后，将棉签在胶原酶溶液管中冲洗，并如上所述擦拭组织的另一侧。清洗后，再次用拭子擦拭组织的两侧，并使用1毫升移液器和胶原酶溶液将瓣膜表面两侧脱落的细胞冲洗至培养皿中。清洗完成后，将培养皿中的全部溶液转移至含有拭子收集细胞的离心管中，将剩余的瓣膜组织放入一个新的15毫升锥形管中，管内含有7毫升无菌胶原酶溶液。通过离心沉淀分离得到的瓣膜内皮细胞，并将细胞沉淀重悬于3毫升血管内皮细胞生长培养基中。经过第二次离心后，将细胞重悬于1毫升新鲜培养基中，计数后以每平方厘米5 × 10⁵个细胞的浓度接种至胶原蛋白包被的六孔板中，每三至四天更换一次培养基。当瓣膜内皮细胞贴壁生长覆盖超过80%的培养板面积时，根据其生长速率，以每平方厘米1.3 × 10⁴个细胞的浓度进行传代。细胞扩增后，通过针对目标瓣膜内皮细胞标志物的免疫荧光染色，确认其瓣膜内皮细胞表型。为了分离瓣膜间质细胞，将含有拭子和瓣叶组织的试管放入细胞培养孵箱中孵育12至18小时，管盖略微打开。孵育结束后，使用血清移液管轻轻吹打组织，以充分解离并释放瓣膜间质细胞，并将细胞悬液通过70微米细胞筛过滤至一个50毫升锥形管中。向管中加入7毫升瓣膜间质细胞培养基，通过离心收集细胞。将沉淀重悬于1毫升新鲜的瓣膜间质细胞生长培养基中，计数后以每平方厘米1.3 × 10⁴个细胞的浓度接种至直径为60毫米的组织培养处理培养皿中。培养1至2天后，用PBS洗涤细胞两次，并向细胞中加入新鲜培养基。当细胞达到90%融合度时，用DPBS洗涤两次，加入2至3毫升预热的解离试剂，在

isolation-of-human-primary-valve-cells-for-in-vitro-disease-modeling

Research

科研

JoVE Journal

Biology

生物学

分离人原代瓣膜细胞进行体外疾病建模

我们提供一种分离和培养纯化心脏瓣膜内皮细胞（VEC）群体的方法。VEC...

瓣膜内皮细胞的分离

本文将提供一种分离和培养鹌鹑或鸡HH14-期心脏瓣膜内皮细胞以及HH25期瓣膜垫间充质细胞的方法。...

禽类胚胎瓣膜前体细胞的分离与培养

在本视频中，我们展示了使用两步胶原酶法从小鼠心脏中分离主动脉瓣间质细胞，并在少量生长培养基中进行后续培养的方法。...

小鼠瓣膜间质细胞的分离：一种从鼠主动脉瓣分离和培养VIC的酶消化法

分离心脏瓣膜内皮细胞（VECs）的能力对于理解瓣膜发育、维持及疾病机制至关重要。本文描述了利用FACS技术从胚胎期和成年 Tie2-GFP...

小鼠瓣膜内皮细胞的分离

微型组织培养系统中培养小鼠心脏瓣膜

本方案描述了大鼠来源的心瓣膜间质细胞的分离、培养及钙化过程，具有高度的生理相关性 体外...

分离与表征原代大鼠瓣膜间质细胞：研究主动脉瓣钙化的新模型

本研究中，我们描述了从钙化主动脉瓣新鲜样本中分离T淋巴细胞的过程，以及利用流式细胞术分析对T细胞克隆进行分析的步骤，以表征适应性白细胞亚群。...

通过使用辐照后的血沉棕黄层来源的饲养细胞分离和培养T淋巴细胞研究主动脉瓣钙化

T淋巴细胞，血沉棕黄层，主动脉瓣钙化，细胞培养，饲养细胞，免疫细胞分离

本文描述了通过两步胶原酶法分离小鼠主动脉瓣膜细胞的过程。分离的小鼠瓣膜细胞对于开展多种实验分析至关重要，例如此项研究中的分析 体外...

分离小鼠主动脉瓣间质细胞以研究主动脉瓣钙化 体外

本文介绍了一种基于组织块培养的方法，用于分离和培养原代的、患者特异性的许多人主动脉平滑肌细胞和皮肤成纤维细胞。此外，还提出了一种测量细胞收缩及进行后续分析的新方法，可用于研究这些细胞在不同患者间的特异性差异。...

分离患者特异性原代主动脉平滑肌细胞及半定量实时收缩测量 体外

原代肝细胞为在生理相关的实验体系中评估生化、分子及代谢功能提供了有价值的工具。本文描述了一种可靠的大鼠原位肝脏灌注方案，该方法可稳定地从每次制备中获得高达 1.0 × 108 个细胞的肝细胞，细胞活力维持在 88 ~ 96%...

大鼠肝细胞的分离与原代培养

学习从人主动脉瓣组织中分离原代瓣膜内皮细胞和间质细胞的方法，用于钙化性主动脉瓣疾病的体外疾病建模研究。该方案可维持细胞约40%的存活率长达61小时，并通过免疫荧光验证细胞表型特异性。

用于体外疾病建模的人原代瓣膜细胞分离

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