Name: 一种从人类多能干细胞中生成肾类器官的简化方法 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-04-13T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 39 s
Description: 学习一种从人类多能干细胞生成肾类器官的简化方法。该方案具有成本低、可重复性强、产量高的特点，适用于肾脏发育、疾病建模及药物筛选研究。

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本研究由美国国立卫生研究院R01 DK069403、UC2 DK126122、P30-DK079307以及美国肾脏病学会肾脏研究基金会Ben J. Lipps研究奖学金项目资助，资助对象为AP。

所有使用人多能干细胞（hPSCs）的实验均遵循机构指导原则，并在II级生物安全柜中佩戴适当的个人防护装备进行。所有试剂均为细胞培养级别，除非另有说明。所有培养物均在37 °C、5% CO2的空气环境中孵育。在实验的任何阶段，均可收集类胚体或肾类器官，并进行固定或后续分析处理。用于生成本数据的hPSC细胞系均已得到充分表征并已发表18。
1. 准备培养皿
注意：在传代人多能干细胞（hPSCs）前约1小时，用经干细胞验证的基底膜基质提取物（BME）包被2个100 mm的组织培养皿。可根据生产商说明书预先包被培养皿，用石蜡膜密封后于4 °C保存。
<ol>
	<li>在II级生物安全柜中准备2个100 mm组织培养处理过的培养皿（1个用于肾类器官实验，1个用于维持细胞系）以及1个15 mL锥形管。</li>
	<li>将8 mL冷的无血清杜氏改良伊格尔培养基（DMEM）分装至15 mL锥形管中，并将约4 mL分别加入每个100 mm培养皿中，使培养基足以覆盖每个培养皿底部。</li>
	<li>从冷冻保存条件（-20 °C）中取出100 µL基底膜提取物（BME）。使用2 mL移液管从15 mL锥形管中吸取约1 mL冷DMEM，通过缓慢反复吹打使BME分装液在冷DMEM中逐渐解冻，注意避免产生气泡。 
	注意：切勿将BME分装液置于室温下静置，应立即使用。</li>
	<li>将解冻后的DMEM/BME混合液转移回含有剩余DMEM的15 mL锥形管中。使用10 mL移液管轻轻上下吹打至少8次，使BME充分稀释并均匀分散，注意避免产生气泡。</li>
	<li>将4 mL稀释后的BME混合液分别加入含有DMEM的每个培养皿中，轻轻旋转培养皿使BME均匀分布。将包被好的培养皿在室温下孵育1小时，或在37 °C下孵育30分钟。 
	注意：每100 mm培养皿使用50 µL BME。若使用其他人多能干细胞（hPSC）培养基或细胞系，可能需要调整BME的使用浓度。</li>
</ol>
2. 人多能干细胞的传代
注意：常规 hPSC 培养时，应在细胞融合度达到 70-80% 时进行传代。
<ol>
	<li>吸出待传代的hPSC培养板中的培养基。向hPSC培养板中加入约8 mL杜氏磷酸盐缓冲液（DPBS），轻轻晃动以洗涤细胞。</li>
	<li>吸出DPBS，向100 mm培养板中逐滴加入2 mL温和细胞解离试剂（GCDR），覆盖整个细胞层。 
	注意：也可使用其他解离试剂。请根据实际情况调整。</li>
	<li>室温孵育约6–8分钟，直至细胞集落开始分散，且在相差显微镜下观察到细胞呈折光性（图2A）。 
	注意：不同细胞系所需时间可能有所不同，请根据实际情况调整。</li>
	<li>孵育期间，准备一个50 mL锥形管。加入16 mL hPSC培养基（每100 mm培养板8 mL），并加入Rho相关激酶抑制剂（ROCKi），使其终浓度为5 µM。</li>
	<li>吸出BME包被板中的DMEM，每孔加入8 mL含ROCKi的hPSC培养基。</li>
	<li>当细胞达到所需状态时（如步骤2.3所述，见图2A），吸出GCDR，将培养板向实验者方向倾斜约45°，用细胞刮铲轻轻刮下细胞。 
	注意：若细胞已自行脱落，可省略吸除GCDR步骤，直接进行下一步。</li>
	<li>将培养板旋转约90°，再次刮取以收集剩余细胞。保持培养板倾斜约45°，用10 mL移液管加入3 mL hPSC培养基冲洗细胞并收集至管中。</li>
	<li>轻柔吹打数次以分散大块细胞团（不超过2–3次），按目标细胞系所需比例将细胞接种至预处理的培养板中。将培养板放入培养箱后，轻柔地以“8”字形移动培养板，使细胞均匀分布。 
	注意：本实验中hPSC细胞系以1:5比例传代，其他细胞系或条件下比例可能不同。接种后过夜勿扰动培养板。</li>
	<li>约24小时后，观察细胞贴壁情况，检查是否有小而独立的细胞集落贴附。吸出用过的培养基，更换为8 mL新鲜hPSC培养基（不添加ROCKi）。</li>
	<li>继续每日观察并更换培养基，直至细胞达到约60%融合度，即可开始肾类器官诱导实验（通常在传代后48至72小时达到）。理想的细胞集落应彼此分离，不发生融合（图2B）。 
	注意：为维持细胞的多能性状态，必须将融合度控制在不超过80%。过度融合的培养物、操作粗暴或高代次细胞可能导致非预期的自发分化或肾类器官形成效率降低。</li>
</ol>
3. 第0天——建立肾类器官检测体系
<ol>
	<li>开始前，根据配方配制 E5-ILP 和 Stage II 培养基（见表1和表2）。 
	注意：培养基可在 4 °C 下保存最多 14 天。</li>
	<li>进行一个肾类器官实验（每 6 孔板需使用一个 100 mm 培养皿），在 50 mL 锥形管中配制完全 E5-ILP 培养基：18 mL E5-ILP 培养基中加入 8 µM CHIR99021（14.4 µL）、3.3 µM ROCKi（6 µL）和 0.1 mM β-巯基乙醇（32.7 µL）。</li>
	<li>将 2 mL 完全 E5-ILP 培养基加入 6 孔超低吸附培养板的每个孔中。</li>
	<li>用约 8 mL DPBS 对汇合度约为 60% 的 hPSCs 进行两次洗涤（见图2B）。吸除 DPBS 后，按每 100 mm 培养皿加入 2 mL 分散酶，逐滴加入以覆盖细胞，于 37 °C 孵育 6 分钟。 
	注意：6 分钟后，细胞集落边缘开始卷起（见图2C，红色箭头），而集落其余部分仍附着于皿底。若 6 分钟后未见此现象，可将细胞放回培养箱继续孵育 30 秒。其他 hPSC 培养基或基质可能不适用于此时间参数。基于层粘连蛋白的 BME 包被与分散酶不兼容。若实验室常规使用基于层粘连蛋白的 BME 作为 hPSC 培养基质，请在第 1 节中将其中一块培养皿按本方法所述使用 BME 进行包被，用于肾类器官实验。</li>
	<li>用约 10 mL DPBS 洗涤细胞 3 次。吸除 DPBS 后，将培养皿倾斜约 45°，用细胞刮铲轻轻刮下细胞。 
	注意：分散酶未被灭活，因此必须彻底清洗去除。不得减少洗涤次数。</li>
	<li>使用 10 mL 移液管，加入 6 mL 完全 E5-ILP 培养基从培养皿顶部将细胞集落冲洗下来。轻柔吹打数次（通常 2–3 次即可）以打散较大的细胞团块。</li>
	<li>将细胞集落均匀分配至 6 孔板中，每孔加入 1 mL。将 6 孔板置于轨道摇床（设置参数：轨道直径 = 30，往复角度 = 330°，振动角度 = 5° - 2 秒）上，并放入 37 °C 培养箱中（见图2D）。 
	&#8203;注意：振动功能对于类器官的均匀分布及防止聚集至关重要。</li>
</ol>
4. 第2天——通过半量换液进行喂养
注意：在 48 小时内，集落簇将形成类胚体。
<ol>
	<li>配制完全培养基：为一个6孔板在15 mL锥形管中配制12 mL E5-ILP培养基，并加入8 µM CHIR99021。 
	注意：此步骤无需添加β-巯基乙醇和ROCKi。</li>
	<li>让胚状体沉降至孔板底部，将孔板倾斜约45°，然后从上层缓慢吸出培养基，每孔保留约1 mL。 
	注意：此阶段的胚状体会迅速聚集，沉降时间不得超过&#62; 5分钟。</li>
	<li>每孔加入2 mL已配制的完全培养基（第4.1节），将孔板放回摇床继续培养。</li>
</ol>
5. 第3天——将拟胚体转移至II阶段培养基
<ol>
	<li>准备一个 50 mL 的锥形管和 DMEM（低糖）。让类胚体沉降到培养板底部。将培养板倾斜约 45°，缓慢从顶部吸出培养基，每孔保留约 1 mL。</li>
	<li>使用 10 mL 血清移液管小心地从每孔中收集所有类胚体，并转移至 50 mL 锥形管中。</li>
	<li>用约 1 mL 的 DMEM（低糖）洗涤每孔，以收集残留的类胚体，并将其加入同一 50 mL 锥形管中。</li>
	<li>让类胚体沉降到管底，约 5 分钟。等待期间，向 6 孔板的每孔中加入 2 mL 第 II 阶段培养基。使用 200 µm 细胞筛过滤掉较大的类胚体（&#62;300 µm）（图 2E）。
	<ol>
		<li>取一个新的 50 mL 锥形管，将 200 µm 细胞筛置于其上方。使用 10 mL 血清移液管小心地将所有类胚体移至细胞筛上。</li>
		<li>用额外约 5 mL 的 DMEM（低糖）冲洗细胞筛，以收集滞留在筛网上的类胚体。让类胚体沉降到锥形管底部。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>当类胚体沉降后，吸去上清液，并用约 10 mL 的 DMEM（低糖）洗涤。</li>
	<li>吸去 DMEM，将类胚体重悬于 6 mL 第 II 阶段培养基中。</li>
	<li>将类胚体转移回 6 孔超低吸附培养板中，均匀分配至 6 个孔内。</li>
	<li>每隔一天进行半量换液，操作如步骤 4.2 和 4.3 所述。 
	&#8203;注意：从第 3 天开始，类胚体将呈现“金黄色”且表面光滑、呈球形（图 2F）。大约从第 6 天起，单个类胚体中将开始出现小管结构，随后几天内数量逐渐增加，至第 14 天达到最佳数量和生长状态（图 2G,H)。为消除偶尔出现的聚集体，或在显微镜下观察到无小管结构的极小类胚体，可按照步骤 5.4.1 和 5.4.2 所述，使用 500 µm 和 200 µm 细胞筛分别去除 &#60;200 µm 和大于 &#62;500 µm 的类器官。</li>
</ol>
6. 转移至旋转烧瓶及换液
注意：从第3天开始，只要实验需要大量类器官，即可使用旋转培养瓶。我们实验室通常在第6至第8天之间进行类器官的常规传代。如果设备不可用，请参见讨论部分中的替代方案。
<ol>
	<li>将拟胚体转移至含有45 mL第二阶段培养基的125 mL旋转培养瓶中。将磁力搅拌器转速设为120 rpm，并将培养瓶放入培养箱中（图2I）。</li>
	<li>为喂养拟胚体或肾类器官，先让肾类器官在旋转培养瓶底部短暂沉降。从培养瓶一侧臂口打开瓶盖，将吸管插入瓶内，管尖轻触对侧内壁。</li>
	<li>缓慢倾斜吸管向下，吸出约一半培养基。通过同一开口加入20 mL新鲜的第二阶段培养基以补充培养液。</li>
</ol>
7. 设置6孔磁力搅拌板（6MSP）
注意：如果需要测试多个条件，可以使用6MSP格式替代旋转瓶。在化合物或肾毒素处理时使用6MSP。这种方法可在第二阶段节省培养基用量，同时通过扩散维持营养物质的供应。
<ol>
	<li>若磁力搅拌子从未使用过，用适合组织培养的洗涤剂在50 mL锥形管中短暂清洗；若 previously used，则需浸泡 &#62; 1 h。</li>
	<li>用无菌DPBS冲洗3次，每次短暂清洗。</li>
	<li>用70%乙醇洗涤1次，持续5分钟，再用无菌DPBS洗涤1次。</li>
	<li>用抗黏附溶液冲洗，并用无菌DPBS洗涤1次，然后吸除液体。</li>
	<li>使用长柄无菌镊子小心地将一个磁力搅拌子放入每个含有拟胚体或肾类器官的6孔板孔中。</li>
	<li>将6孔板置于6MSP装置上，设置转速为120 rpm（图2J）。按照第4.2和4.3节所述，通过半量换液方式维持肾类器官培养。 
	注意：为使磁力搅拌子准确就位并开始旋转，可先将功率短暂调至100，待所有搅拌子开始旋转后，再将功率降至25。</li>
</ol>

<ol><li>Takasato, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kidney+organoids+from+human+iPS+cells+contain+multiple+lineages+and+model+human+nephrogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Kidney organoids from human iPS cells contain multiple lineages and model human nephrogenesis.</a> Nature. 526 (7574), 564-568 (2015).</li>
<li>Freedman, B. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modelling+kidney+disease+with+CRISPR-mutant+kidney+organoids+derived+from+human+pluripotent+epiblast+spheroids%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Modelling kidney disease with CRISPR-mutant kidney organoids derived from human pluripotent epiblast spheroids.</a> Nature Communications. 6, 8715(2015).</li>
<li>Morizane, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nephron+organoids+derived+from+human+pluripotent+stem+cells+model+kidney+development+and+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Nephron organoids derived from human pluripotent stem cells model kidney development and injury.</a> Nature Biotechnology. 33 (11), 1193-1200 (2015).</li>
<li>Taguchi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Redefining+the+in+vivo+origin+of+metanephric+nephron+progenitors+enables+generation+of+complex+kidney+structures+from+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Redefining the in vivo origin of metanephric nephron progenitors enables generation of complex kidney structures from pluripotent stem cells.</a> Cell Stem Cell. 14 (1), 53-67 (2013).</li>
<li>Przepiorski, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+bioreactor-based+method+to+generate+kidney+organoids+from+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">A simple bioreactor-based method to generate kidney organoids from pluripotent stem cells.</a> Stem Cell Reports. 11 (2), 470-484 (2018).</li>
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<li>Morizane, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nephron+organoids+derived+from+human+pluripotent+stem+cells+model+kidney+development+and+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Nephron organoids derived from human pluripotent stem cells model kidney development and injury.</a> Nature Biotechnology. 33 (11), 1193-1200 (2015).</li>
<li>Takasato, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kidney+organoids+from+human+iPS+cells+contain+multiple+lineages+and+model+human+nephrogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Kidney organoids from human iPS cells contain multiple lineages and model human nephrogenesis.</a> Nature. 526 (7574), 564-568 (2015).</li>
<li>Taguchi, A., Nishinakamura, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Higher-order+kidney+organogenesis+from+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Higher-order kidney organogenesis from pluripotent stem cells.</a> Cell Stem Cell. 21 (6), 730-746 (2017).</li>
<li>Uchimura, K., Wu, H., Yoshimura, Y., Humphreys, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+pluripotent+stem+cell-derived+kidney+organoids+with+improved+collecting+duct+maturation+and+injury+modeling%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Human pluripotent stem cell-derived kidney organoids with improved collecting duct maturation and injury modeling.</a> Cell Reports. 33 (11), 108514(2020).</li>
<li>Howden, S. E., Little, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generating+kidney+organoids+from+human+pluripotent+stem+cells+using+defined+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Generating kidney organoids from human pluripotent stem cells using defined conditions.</a> Methods in Molecular Biology. 2155, 183-192 (2020).</li>
<li>Tanigawa, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activin+is+superior+to+BMP7+for+efficient+maintenance+of+human+iPSC-derived+nephron+progenitors%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Activin is superior to BMP7 for efficient maintenance of human iPSC-derived nephron progenitors.</a> Stem Cell Reports. 13 (2), 322-337 (2019).</li>
<li>Sander, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protocol+for+large-scale+production+of+kidney+organoids+from+human+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22STAR+Protocols%22%5BJournal%5D)">Protocol for large-scale production of kidney organoids from human pluripotent stem cells.</a> STAR Protocols. 1 (3), 100150(2020).</li>
<li>Ekblom, P., Thesleff, I., Miettinen, A., Saxen, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organogenesis+in+a+defined+medium+supplemented+with+transferrin%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Differentiation%22%5BJournal%5D)">Organogenesis in a defined medium supplemented with transferrin.</a> Cell Differentiation. 10 (5), 281-288 (1981).</li>
<li>Thesleff, I., Ekblom, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+transferrin+in+branching+morphogenesis%2C+growth+and+differentiation+of+the+embryonic+kidney%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Embryology+and+Experimental+Morphology%22%5BJournal%5D)">Role of transferrin in branching morphogenesis, growth and differentiation of the embryonic kidney.</a> Journal of Embryology and Experimental Morphology. 82, 147-161 (1984).</li>
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<li>Lei, X., Deng, Z., Duan, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Uniform+embryoid+body+production+and+enhanced+mesendoderm+differentiation+with+murine+embryonic+stem+cells+in+a+rotary+suspension+bioreactor%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Uniform embryoid body production and enhanced mesendoderm differentiation with murine embryonic stem cells in a rotary suspension bioreactor.</a> Methods in Molecular Biology. , Clifton, N.J. (2016).</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

先前的研究表明，初始实验方案步骤对于中胚层分化至关重要5,19,20，因此在此阶段实施严格控制的培养基成分十分必要。在实验方案的第一阶段去除未定义成分，如血清、白蛋白和无蛋白杂交瘤培养基II，可能有助于提高不同检测之间分化效率的一致性21。
肾脏细胞的代谢状态对其功能至关重要，葡萄糖水平的变化可导致代谢状态的改变22。既往研究指出，高浓度葡萄糖（高达 25 mM）可诱导内皮细胞功能障碍，并改变肾脏细胞的生长能力及氧化能力22,23,24。高浓度葡萄糖还被报道可改变线粒体功能24</s...

近年来，已开发出多种将人类多能干细胞分化为肾类器官的实验方案1,2,3,4,5肾脏类器官已成为研究再生医学新方法、模拟肾脏相关疾病、开展毒性研究及药物开发的重要工具。尽管其应用广泛，但肾脏类器官仍存在局限性，例如成熟度不足、长期培养能力有限等问题 体外以及人类肾脏中多种细胞类型的缺乏6,7,8近期研究工作集中在通过改进现有方案，提高类器官的成熟度、延长培养周期以及扩展肾脏细胞群体的复杂性。9,10,11,12在本方案的当前版本中5,13，我们已在方案的第一阶段将培养基成分修改为无血清基础培养基，并添加胰岛素-转铁蛋白-硒-乙醇胺（ITSE）、脂质、聚乙烯醇（E5-ILP）和 CHIR99021（图1这些改变提供了一种成分更少、完全明确、无血清且低蛋白的培养基，相较于我们之前的培养基配方更为简化。5,13 且无需添加额外的生长因子。因此，第一阶段培养基的制备比我们先前发表的版本更省时省力，并可降低批次间的差异性5先前的研究表明，胰岛素和转铁蛋白在无血清培养中均具有重要作用14,15然而，高水平的胰岛素可能抑制中胚层分化16我们保持了原始方案中提供的低胰岛素水平，并在检测的第二阶段进一步降低了KOSR（含有胰岛素）的浓度。与其他肾脏类器官形成方案一致，较低水平的KOSR有助于维持肾组织增殖与分化之间的平衡。17此外，我们已降低了第二阶段培养基中的葡萄糖浓度13.
本方法描述了一种用于肾类器官悬浮培养的实验方案，可从初始约60%融合度的人多能干细胞（hPSC）100 mm培养皿中获得多达约1,000个类器官，具体步骤详见原始文献5,13。该方案可轻松放大，起始材料可使用多个100 mm或150 mm培养皿，以进一步增加类器官数量。

<table><tbody><tr><td>2-巯基乙醇</td><td>Thermo Fisher</td><td>21-985-023</td><td></td></tr><tr><td>防黏附冲洗液</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>7010</td><td></td></tr><tr><td>CHIR99021</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>72054</td><td>以DMSO配制为10 mM储备液</td></tr><tr><td>Corning&amp;nbsp;一次性旋转瓶</td><td>Fisher Scientific</td><td>07-201-152</td><td></td></tr><tr><td>Corning 超低吸附6孔板</td><td>Fisher Scientific</td><td>07-200-601</td><td></td></tr><tr><td>Corning 低速搅拌器</td><td>Fisher Scientific</td><td>11-495-03</td><td>用于旋转瓶培养的多板磁力搅拌器</td></tr><tr><td>Dispase</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>7923</td><td>分装后冷冻保存</td></tr><tr><td>DMEM，低糖，含丙酮酸，不含谷氨酰胺，不含酚红</td><td>Thermo Fisher</td><td>11054020</td><td></td></tr><tr><td>DPBS 1x，不含钙，不含镁</td><td>Thermo Fisher</td><td>14-190-250</td><td></td></tr><tr><td>卵形/椭圆形搅拌子</td><td>2mag</td><td>PI20106</td><td></td></tr><tr><td>Excelta 通用镊子</td><td>Fisher Scientific</td><td>17-456-103</td><td>在细胞培养超净台中保持无菌</td></tr><tr><td>EZBio 一次性培养基瓶，250 mL</td><td>Foxx Life Sciences</td><td>138-3211-FLS</td><td>用于配制10% PVA溶液</td></tr><tr><td>Falcon 标准组织培养皿（100 mm）</td><td>Thermo Fisher</td><td>08-772E</td><td></td></tr><tr><td>Fisherbrand&amp;nbsp;无菌吸管，2 mL</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-955-135</td><td></td></tr><tr><td>Fisherbrand&amp;nbsp;细胞刮刀</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-100-240</td><td></td></tr><tr><td>Fisherbrand&amp;nbsp;多功能3D旋转仪</td><td>Fisher Scientific</td><td>88-861-047</td><td>轨道摇床</td></tr><tr><td>Geltrex LDEV-Free Reduced Growth Factor 基底膜基质</td><td>Thermo Fisher</td><td>A1413302</td><td>&lt;strong&gt;BME&lt;/strong&gt;。在冰上分装并冷冻保存。其他合适的基质替代品包括Matrigel或Cultrex。</td></tr><tr><td>温和细胞解离试剂</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>7174</td><td>&lt;strong&gt;GCDR&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>GlutaMAX 补充剂</td><td>Thermo Fisher</td><td>35-050-061</td><td>L-谷氨酰胺补充剂。</td></tr><tr><td>HEPES (1M)</td><td>Thermo Fisher</td><td>15-630-080</td><td></td></tr><tr><td>胰岛素-转铁蛋白-硒-乙醇胺</td><td>Thermo Fisher</td><td>51-500-056</td><td>&lt;strong&gt;ITSE&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>KnockOut&amp;nbsp; 血清替代物 - 多物种</td><td>Thermo Fisher</td><td>A3181502</td><td>&lt;strong&gt;KOSR&lt;/strong&gt;。分装后冷冻保存</td></tr><tr><td>脂质混合物1，化学成分明确</td><td>Millipore-Sigma</td><td>L0288-100ML</td><td></td></tr><tr><td>MEM 非必需氨基酸溶液</td><td>Thermo Fisher</td><td>11140-050</td><td></td></tr><tr><td>MilliporeSigma Stericup Quick Release-GP 无菌真空过滤系统，500 mL</td><td>Fisher Scientific</td><td>S2GPU05RE</td><td></td></tr><tr><td>MilliporeSigma&amp;nbsp; Stericup Quick Release-GP 无菌真空过滤系统，250 mL</td><td>Fisher Scientific</td><td>S2GPU02RE</td><td></td></tr><tr><td>MIXcontrol MTP / Variomag TELEcontrol MTP 控制单元</td><td>2mag</td><td>VMF 90250 U</td><td></td></tr><tr><td>MIXdrive 6 MTP / Variomag TELEdrive 6 MTP 微孔板搅拌驱动器</td><td>2mag</td><td>VMF 40600</td><td>&lt;strong&gt;6MSP&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>MP Biomedicals&amp;nbsp; 7X 清洁液</td><td>Fisher Scientific</td><td>MP0976670A4</td><td>&lt;strong&gt;适用于组织培养的洗涤剂。&lt;/strong&gt; 用水配制成5%溶液</td></tr><tr><td>mTeSR1</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>85850</td><td>&lt;strong&gt;人多能干细胞培养基。&lt;/strong&gt;TeSR-E8、NutriStem XF 和 mTeSR Plus 培养基也经过测试，是合适的替代品。&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Nunc 50 mL 锥形无菌离心管</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-565-270</td><td></td></tr><tr><td>Nunc 15 mL 锥形无菌离心管</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-565-268</td><td></td></tr><tr><td>青霉素-链霉素</td><td>Thermo Fisher</td><td>15-140-122</td><td>分装后冷冻保存</td></tr><tr><td>Plasmocin</td><td>Invivogen</td><td>ant-mpt</td><td>&lt;strong&gt;抗支原体试剂。&lt;/strong&gt; 分装后冷冻保存</td></tr><tr><td>pluriStrainer&amp;reg; 200 &amp;micro;m</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC0776417</td><td>细胞筛</td></tr><tr><td>pluriStrainer&amp;reg; 500 &amp;micro;m</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC0822591</td><td>细胞筛</td></tr><tr><td>聚乙烯醇 87-90% 水解&amp;nbsp; (PVA)</td><td>Millipore-Sigma</td><td>P8136-250G</td><td>在DPBS中配制成10%溶液，98°C搅拌至完全溶解，使用138-3211-FLS瓶配制</td></tr><tr><td>ROCK抑制剂 Y-27632 (ROCKi)</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>72304</td><td>以DPBS配制为10 mM储备液</td></tr><tr><td>无菌一次性移液管&amp;nbsp; - 10 mL</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-678-11E</td><td></td></tr><tr><td>无菌一次性移液管 - 25 mL</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-678-11</td><td></td></tr><tr><td>无菌一次性移液管 - 5 mL</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-678-12D</td><td></td></tr><tr><td>TeSR-E5</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>5916</td><td>无血清、低蛋白基础培养基，用于&lt;strong&gt;E5-ILP&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>Variomag distriBOX 2 分配器</td><td>2mag</td><td>VMF 90512</td><td>若使用多个MIXdrive时使用</td></tr></tbody></table>

一种从人多能干细胞生成肾类器官的简化方法

A Simplified Method for Generating Kidney Organoids from Human Pluripotent Stem Cells

由人多能干细胞（hPSCs）生成的肾类器官为肾脏组织提供了无限来源。人类肾类器官是研究肾脏疾病与损伤、开发细胞治疗手段以及测试新疗法的宝贵工具。对于这些应用，需要大量均一的类器官以及高度可重复的检测方法。我们在先前发表的肾类器官培养方案基础上进行了优化，以提高类器官的整体健康状态。该方法是一种简单且稳健的三维培养方案，首先在含有脂质、胰岛素-转铁蛋白-硒-乙醇胺添加剂和聚乙烯醇，并添加GSK3抑制剂（CHIR99021）的最低成分培养基中培养3天，形成均一的拟胚体；随后转入含敲除血清替代物（KOSR）的培养基中继续培养。此外，通过振荡培养可减少拟胚体的聚集，并维持其大小均一，这对于降低类器官之间的变异性至关重要。总体而言，该方案提供了一种快速、高效且经济的方法，可用于大规模生成肾类器官。

在本方案的最新版本中，肾类器官的分化起始于一种成分明确且低蛋白的培养基中。所有实验步骤均在悬浮培养条件下完成，依赖于人多能干细胞（hPSCs）自身分化和组织构建的能力来启动肾小管形成。由一个直径100 mm、融合度约60%的hPSC培养皿起始，通常可获得500至1,000个肾类器官，如我们先前发表的研究5所示。由于能够生成大量类器官，本方案非常适用于化合物筛选。我们常规采用6孔板格式进行化合物测试，但该方案在第二阶段（第3天起）可轻松扩展至其他多孔板格式，以实现更高通量的化合物筛选。对石蜡切片进行免疫荧光染色显示，类器官中存在肾单位的不同节段，即表达肝细胞核因子-1β（HNF1B）和刀豆四棱豆凝集素（LTL）的肾小管（图3A - HNF1B, LTL），以及表达V-maf肌腱膜纤维肉瘤癌基因同源物B（MAFB）和足蛋白（nephrin, NPHS1）的足细胞簇（图3A - MAFB，图3B - NPHS1）。此外...

本文介绍了一种从人多能干细胞（hPSCs）生成肾类器官的实验方案。该方案可在两周内生成肾类器官。所获得的肾类器官可在大规模旋转烧瓶或多孔磁力搅拌板中进行培养，适用于并行药物筛选研究。

由人多能干细胞（hPSCs）生成的肾脏类器官为肾脏组织提供了无限来源。人类肾脏类器官是研究肾脏发育、疾病机制及药物筛选的宝贵工具。

该方法可在任何具备细胞培养实验条件的实验室中进行。通过此方法，我们能够进一步了解肾脏发育及疾病通路。与其他生成肾类器官的方法相比，该方法相对简单且成本较低。该技术最大的挑战在于维持高质量的人类多能干细胞培养。必须将细胞维持在低于80%的融合度，并定期进行传代。刚接触人类多能干细胞培养的研究人员应在进行分化实验前，先熟悉所使用的干细胞系。开始肾类器官实验，向每个六孔超低吸附培养板的孔中加入两毫升完全E5-ILP培养基。将人多能干细胞（hPSCs）在100毫米组织培养处理过的培养皿中培养至60%融合度。用约八毫升DPBS洗涤hPSCs两次。吸除 DPBS，然后逐滴加入 2 毫升 Dispase 以覆盖细胞，在 37 摄氏度下孵育 6 分钟。用约 10 毫升 DPBS 洗涤细胞 3 次。吸除 DPBS，将培养板倾斜 45 度，用细胞刮棒刮下细胞。用10毫升血清移液管将6毫升完全E5-ILP培养基沿培养板顶部加入，冲洗下菌落。然后，保持移液管垂直，通过轻柔吹打上下重悬液体以分散大块菌落，注意避免触碰培养板壁。将菌落团块均匀分配至6孔板中，每孔加入1毫升，随后将6孔板置于37摄氏度培养箱内的轨道摇床上。或者，若无轨道摇床，也可进行静态培养。在第二天，待类胚体沉降至培养板底部后，将培养板倾斜45度，从上部缓慢吸出培养基，每孔保留1毫升。每孔加入2毫升预先配制的完全培养基，然后将培养板放回摇床继续培养。第三天，吸取并移除培养基后（操作方法如前所述），使用10毫升血清移液管小心地从每个孔中收集所有类胚体，并转移至一个50毫升锥形管中。为收集残留的类胚体，用1毫升低糖DMEM冲洗每个孔，并将冲洗液加入同一50毫升锥形管中。在等待类胚体沉降至管底的过程中，向六孔板的每孔中加入2毫升第二阶段培养基。接下来，将一个200微米的细胞筛置于新的50毫升锥形管上，小心地将所有类胚体通过移液转移至细胞筛上，以滤除较大的类胚体。用额外的5毫升DMEM冲洗细胞筛，以收集滞留在筛网中的任何类胚体。在后续阶段，先使用500微米的细胞筛滤除过大的类胚体，然后将滤液通过200微米的细胞筛，以去除不含管状结构的过小类胚体。通过将200微米滤网倒置至新的50毫升离心管中，并用DPBS冲洗滤网，收集大小在200至500微米之间的正确尺寸的类胚体。过滤后，让类胚体沉降至锥形管底部，然后吸除上清液，并用约10毫升DMEM洗涤。随后，将类胚体重悬于6毫升第二阶段培养基中。将类胚体重新转移至六孔超低吸附培养板中，均匀分配至各孔。由于大多数类器官会聚集在移液管顶部，因此在转移结束时需保留约0.5毫升液体，然后轻轻将枪头接触每孔中的培养基，使类器官缓慢流入孔内。将类胚体转移至含有45毫升第二阶段培养基的125毫升旋转培养瓶中。将磁力搅拌速度设置为 120 rpm，然后将烧瓶放入培养箱中。喂养胚状体或肾类器官时，先让其短暂沉降至旋转烧瓶底部，然后从烧瓶一侧臂处掀开盖子，将吸液移液管插入瓶内，管尖轻触对侧内壁。缓慢倾斜移液管向下，吸出约一半的培养基。通过同一开口，用移液管加入 20 毫升新鲜的 II 期培养基。使用长柄无菌镊子，小心地将一个磁力搅拌子放入每孔含有胚状体或肾类器官的六孔板的每个孔中。将六孔板置于六孔磁力搅拌台上，设置转速为 120 rpm。为使磁力搅拌子迅速就位并开始旋转，首先将功率调至100。待所有搅拌子开始旋转后，将功率降至25。通过更换一半培养基的方式维持肾类器官的培养，操作方法如前所述。第14天肾类器官石蜡切片的免疫荧光结果显示存在肾单位节段，例如表达肝细胞核因子-1β和莲藕四棱豆凝集素的肾小管，以及表达V-maf肌肉腱膜纤维肉瘤癌基因同源物B和足蛋白的足细胞簇。本方案中的改进可支持内皮细胞的扩增，培养第26天通过血小板和内皮细胞黏附分子-1染色已证实该结果。人类多能干细胞需要用Dispase处理适当时间，然后彻底洗涤以去除所有残留。如果未完全去除中性蛋白酶（Dispase），可能导致细胞死亡以及类胚体聚集。该方法有助于我们在体外研究先天性肾脏疾病的发育过程，以及多种肾脏损伤通路和潜在的治疗干预手段。

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科研

JoVE Journal

Developmental Biology

发育生物学

一种从人类多能干细胞中生成肾类器官的简化方法

在本视频中，我们介绍了通过在特定化学条件下诱导细胞分化，从诱导性多能干细胞中获得人类肾脏足细胞的实验方案。所获得的足细胞可用于肾毒性测试和疾病模型研究。...

从诱导性多能干细胞衍生人类肾脏足细胞：一种从干细胞定向分化成熟肾脏足细胞的实验方案

关键词：诱导性多能干细胞，肾脏足细胞，定向分化，干细胞分化，肾小球，足细胞标志物，PAX2，WT1，NEPHRIN，SYNPO，细胞培养，肾脏发育

本方案旨在以简化且低成本的方式生成脑类器官，无需外源性生长因子或基底膜基质，同时仍能维持脑细胞类型的多样性及细胞组织的多种特征。...

一种静态自诱导法由人胚胎干细胞生成脑类器官

本研究描述了两种用于研究器官发育的方法：一种是改进的禽类胚胎绒毛尿囊膜（CAM）异种移植体系，可实现培养的胚胎器官和类器官的血管化；另一种是新型的固定z轴方向器官培养方法，通过优化实验条件，可实现高分辨率的共聚焦显微镜延时成像。...

肾类器官和类器官型培养的优化：促进血管化、延长发育及改善显微成像

本文介绍了一种化学成分明确的人肾足细胞高效（&gt;90%）分化方案，该方案由诱导性多能干细胞衍生而来，无需基因操作或亚群筛选。本方案可在26天内获得目标细胞类型，适用于肾毒性检测和疾病模型研究。...

在化学成分明确条件下诱导人诱导多能干细胞定向分化为成熟肾足细胞

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从组织和尿液中生成人类肾脏管状类器官

本文介绍了一种利用人类多能干细胞通过自组织方式高效生成具有发育相关性的人类心脏类器官（hHOs）的实验方案。该方案依赖于发育信号的顺序性激活，可产生高度复杂且功能相关的人类心脏组织。...

生成源自多能干细胞的自组装人类心脏类器官

本文介绍了一种构建个性化器官芯片系统的方案，该系统通过整合由人诱导多能干细胞分化而来的基因匹配的上皮细胞和血管内皮细胞，模拟肾脏肾小球滤过屏障的结构与功能。这种生物工程系统可推动肾脏精准医学及相关应用的发展。...

由人诱导多能干细胞构建的等基因肾小球芯片

本文介绍了一种将肾类器官移植到鸡胚体腔的详细方案。该方法可在8天内诱导类器官的血管化并促进其进一步成熟，可用于高效研究这些过程。...

通过鸡胚体内移植实现肾类器官的有效血管化

本方案介绍了一种利用悬浮培养条件从诱导性多能干细胞（iPSCs）高效生成肾类器官的全面方法。本研究的重点在于确定初始细胞密度和WNT激动剂浓度，从而为对肾类器官研究感兴趣的科研人员提供参考。...

从诱导性多能干细胞在悬浮培养中生成肾脏类器官

本方案介绍了一种利用人多能干细胞生成血管类器官的方法。...

由人诱导性多能干细胞生成血管类器官

学习一种从人类多能干细胞生成肾类器官的简化方法。该方案具有成本低、可重复性强、产量高的特点，适用于肾脏发育、疾病建模及药物筛选研究。

一种从人多能干细胞生成肾类器官的简化方法

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