Name: 使用大鼠对象定位任务的主体内实验设计 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-05-06T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 28 s
Description: 学习大鼠对象定位任务的主体内实验设计，通过弱编码和强编码范式评估短期与长期空间记忆。该方法利用平衡设计与重复测试提高统计效能，减少动物使用，适用于行为神经科学研究。

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我们感谢 Antonios Asiminas、Dorothy Tse、Kiichi O'Hara 和 David Bett 提出的深刻评论和建议。本研究得到了 Erasmus+ 项目（资助 G.B. 和 L.N.）；奥胡斯大学健康研究生院（资助 K.H.）；诺和诺德基金会青年研究员奖 2017（NNF17OC0026774）、伦德贝克基金会（DANDRITE-R248-2016-2518）以及丹麦国家研究基金会资助的卓越中心 PROMEMO——记忆蛋白研究中心（DNRF133）（资助 T.T.）的支持。

此处所述所有方法均已获得丹麦国家主管部门批准（许可证编号：2018-15-0201-01405），符合丹麦及欧盟动物福利法律法规。
1. 实验装置与不同环境的准备
<ol>
	<li>具有情境的物体位置实验场 
	注意：以下设置在封闭的隔音箱内进行演示（图1B）光源位于箱体天花板边缘，相机位于箱体天花板中央。实验区域为60 cm × 60 cm，四周墙壁高100 cm（图1B），置于箱内，并与周围环境完全隔离。所有空间线索均位于实验区域内。这简化了创建不同环境的过程。通过在普通开阔场地周围墙壁加装均匀的帘幕，也可实现与周围环境相似程度的隔离。
	<ol>
		<li>获取一个由不透明、无孔硬质塑料制成的方形实验区域，其宽度至少为60 cm，高度至少为50 cm。选择与大鼠体色形成对比的地面颜色，以便自动化软件（如适用）能够成功记录大鼠的运动轨迹。将该实验区域置于箱体内部（图1B）或置于由帘子围合的平台上。</li>
		<li>为了构建上下文，获取第二层可插入的墙壁（例如， 墙壁覆盖物采用与实验 arena 相同的材料，或易于清洁的塑料壁纸，颜色和/或图案各异（例如， 黑色、白色、条纹或圆点）。在实验 arena 中插入第二层墙壁，使其彼此区分。</li>
		<li>获取三维（3D）空间线索（每个环境1-2个），其尺寸范围为10 cm × 10 cm × 5 cm 至 20 cm × 15 cm × 15 cm（宽 × 长 × 高），并满足以下条件：（i）具有明显不同的几何形状；（ii）颜色与墙面颜色形成对比。将这些线索悬挂于足够高的墙面位置，使大鼠无法触及。</li>
		<li>获取不同对的物体（数量与情境数量相同），这些物体应为非多孔、不可咀嚼且易于清洁的。力求每个新物体具有不同的几何形状和纹理。选择宽度和高度在5至15厘米之间的物体（避免过高的物体）。参见 图1D 圆锥体、足球、长方体和三棱柱四种不同物体的示例。 
		注意：每个物体对大鼠的吸引力应相似，以确保所有物体的总探索时间具有可比性。</li>
		<li>找到将物体固定在实验区域底部的最佳方法例如， 使用粘性垫、双面胶带、在物体下方安装金属板以及在实验区域下方配对磁铁 等等。).</li>
		<li>创建另一个情境时，需重新构建墙壁，使其颜色和图案的分布与之前情境中的墙壁形成对比。使用与所有先前线索不同且形成对比的新三维空间线索。参见 图1C 四种不同情境的示例。</li>
		<li>获取一个能够确保实验区域内光照均匀且可调节亮度的光源。每次构建环境后，在实验区域的角落处将光照强度调整至约100–120勒克斯。获取一台摄像机，并将其置于箱体天花板正中央。 
		注意：如果未使用自动评分软件，可将光强度调整至较低水平。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>物体桶
	<ol>
		<li>获取一个桶（&gt;直径为50 cm）。不要选择方形，以避免与实验场地相似。加入垫料材料。</li>
		<li>获取5-10个形状和大小各异的物体（需与实验中将要使用的物体不同），随机放入桶中图1A).</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
<img alt="使用设置图像、情境变化和用于分析的不同物体进行物体识别实验。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62458/62458fig01.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图 1"> 
图 1：实验装置，包括四种不同的情境与物体。(A) 用于物体习惯化的物体存放桶。(B) 实验装置（左），包含物体放置区域、摄像头和光源；实验箱及实验区域在布置情境前（中）和布置情境后（右）。(C) 四种情境（1-4），具有不同的墙壁颜色和图案，以及三维空间线索。(D) 分别用于情境1-4的四个物体。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62458/62458fig01large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的高清版本。</a>
<ol start="3">
	<li>相机与追踪软件（可选）
	<ol>
		<li>获取可用于远程控制摄像记录仪并能追踪大鼠鼻部的软件。在每次实验前，针对每种特定实验条件和大鼠品系进行软件参数调整。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>物体位置与实验组的平衡设计
	<ol>
		<li>为编码和测试试验准备物体位置的所有可能组合，并将这些组合命名为对照组。设计组合时需覆盖所有角落作为物体位置，并包含物体从相邻角落移动到对角角落的情况。 反之亦然 (图2A).</li>
		<li>为特定实验制定时间表，将每个实验组中的每只大鼠与一个计数器配对。使用每一对配对的两个计数器（图 2A）如果某一组内有足够的大鼠，可在该组内进行。在单次编码/测试会话中，两个实验组应使用同一套计数器（图2B）。为后续实验重新分配计数器（即， 每一种新情境）。 
		注意：在编码/测试阶段，应以混合顺序对大鼠进行实验（例如，不要连续在同一个笼子中依次测试所有大鼠；而应轮换使用不同笼子，以确保容纳多只大鼠的笼子内环境保持安静。</li>
		<li>当使用两种或两种以上的情境来平衡实验组时（例如， 1小时记忆组与24小时记忆组），将大鼠分配至各组，并在后续实验情境中更换分组（图2B).</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
<img alt="计数器编码与测试示意图，含实验会话表；行为学研究中的数据分析。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62458/62458fig02.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图2"> 
图2代表性平衡方法 (A实验和测试阶段中， arena 内物体可能的朝向被命名为计数器。物体 1 始终为移动物体。每两个计数器之间进行平衡，使得移动物体的位置发生变化。每个角落被占据两次，物体 1 从对角位置移动到相邻位置 反之亦然 相同次数。B) 两次平衡对照实验的编码/测试时间表示例（例如， 情境1和情境2）。大鼠在情境1中被分配至实验条件（会话X，左侧）。一组对照配对（即， 1-2、3-4、5-6 和 7-8）被选中并分配给实验组中的每只大鼠。同一组计数器被分配给两个实验组的大鼠。在接下来的第2阶段环境中（第X+1次会话；右侧），实验组中的大鼠进行交叉平衡调整，并分配一组新的计数器配对。在编码和测试试验开始时应记录时间。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62458/62458fig02large.jpg" target="_blank">请点击此处以查看此图的放大版本。</a>
注意：本方案中的所有操作、适应及编码/测试阶段均在12小时光照/黑暗循环的光照期进行优化，因此建议实验在光照期进行。
2. 处理与适应
<ol>
	<li>从断奶期开始（如果大鼠在本单位饲养）或在实验开始前2-3周（如果大鼠从外部机构订购，在到达后经过一周适应期后）开始对大鼠进行操作处理。</li>
	<li>每周对每笼4只大鼠花费至少10–15分钟，持续2至3天，直至大鼠能够适应被实验人员触摸和抓取。根据每笼中大鼠的数量调整每笼分配的时间。 
	注意：所有预期将要操作大鼠的实验人员均须在场参与抓取训练。</li>
	<li>若从断奶时开始处理，达到该阶段后可（可选）尽量减少处理；若在实验开始前2-3周开始处理，则应持续进行处理直至适应性训练阶段开始。</li>
	<li>将装有大鼠的笼子带入实验房间，使大鼠适应运输过程以及实验环境。让大鼠静置至少30分钟，以使其有足够时间平静下来并适应环境。此后，将大鼠及其笼子送回饲养房间。 
	注意：步骤 2.4 可根据需要与操作处理结合并重复多次。如果方案中包含其他操作，可在该步骤中额外增加适应性训练。例如， 注射等操作的处理。</li>
	<li>进行物体习惯化，使大鼠适应与物体的互动，并降低因接触新环境而产生的总体应激水平。
	<ol>
		<li>第一阶段：将所有饲养笼带入实验房间，让大鼠适应环境并静置至少30分钟。将同一笼内的2-4只大鼠共同放入桶中，持续20分钟。每组大鼠使用后，清除桶内粪便等残留物，清洁桶具。对所有饲养笼重复上述操作。完成后将所有大鼠放回各自饲养笼，并送回饲养室。</li>
		<li>第二次实验在另一天进行，将所有鼠笼带入实验室内，静置至少30分钟。将每只大鼠单独放入桶中10分钟，之后将其放回原笼，并在每只大鼠使用后清洁桶。最后将所有鼠笼送回饲养室。</li>
		<li>第3次实验时，在另一天重复步骤2.5.2。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>如果实验装置是一个封闭的盒子（图1B），选择进行空箱适应，使大鼠适应新的实验装置。在第4次实验中，将所有笼子移至实验室内，静置至少30分钟。将同一笼内的大鼠（2–4只）一起放入无任何环境或空间线索的空旷场地中图1B，中间）20 分钟。将所有大鼠放回饲养笼，并在每组大鼠实验结束后用 70% 乙醇擦拭实验区域。 
	注意：步骤 2.5 和 2.6 应在同一周内完成，且在情境适应周（步骤 2.7）之前进行（参见 图3）。在这些步骤之间间隔几天是可以接受的。然而，从开始步骤2.7起，各步骤应按照规定在连续的几天内依次进行，直至测试试验结束（步骤2.9）。</li>
	<li>进行环境适应，使大鼠适应环境及其三维线索，以降低总体应激水平，并促进对环境的空间学习。
	<ol>
		<li>按照第1.1节所述方法改造空旷的实验 arena 以创建第一个环境，但不在 arena 中放置物体。准备记录设备。</li>
		<li>第一次实验时，将所有笼子带入实验室内，静置至少30分钟。若为手动操作，此时启动记录设备。将第一只大鼠置于旷场中央，让其自由探索10分钟。随后，停止记录（如为手动操作），并将大鼠放回原笼。每只大鼠实验结束后，须用70%乙醇彻底擦拭旷场装置。全部实验结束后，将所有笼子送回饲养室。</li>
		<li>在第2天和第3天，对每只大鼠连续两天重复步骤2.7.2，使每只大鼠共完成3次环境适应训练。 
		注意：建议打乱大鼠进入实验区域的顺序，尤其是处理大群体时。这可以避免在每天相同时段重复测试特定大鼠。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
<img alt="习惯化与编码过程示意图；为期两周的动物行为学研究实验装置。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62458/62458fig03.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图3"> 
图3行为学实验的设计，包括抓取、适应和物体位置任务的实验方案。 大鼠应从适应周前数周开始定期进行抓取和处理。在第0周，进行物体和实验箱的适应，共4次训练，每次间隔至少24小时。在第1周，进行情境适应，连续3次，每次间隔24小时，随后进行编码和测试试验。每次后续实验 session 之间应至少间隔48小时，最长可达1周。例如， 从第2周或第3周开始对下一环境进行习惯化。缩写：Hab.，习惯化。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62458/62458fig03large.jpg" target="_blank">请点击此处以查看此图的放大版本。</a>
<ol start="8">
	<li>编码试验（第4次会话） 
	注意：在进行药理学干预的情况下，给药的合理时间可根据药理学试剂的性质，在编码试验之前或之后立即给药，或在测试试验之前给药。
	<ol>
		<li>将所有笼子带入实验房间，静置至少30分钟。根据事先准备好的时间表（图2B），使用粘性垫或双面胶带将第一对相同物体放置在指定位置（位于两个角落，距离各自墙壁&gt;10 cm；可使用L形硬纸板每次保持相同距离）。</li>
		<li>启动记录仪（如为手动操作）。将第一只大鼠放入实验箱内，使其面朝未放置任何物体的墙壁或角落（与每个物体的距离相等）。 
		注意：根据以下步骤进行弱编码或强编码操作。</li>
		<li>进行弱编码（1次试验），允许大鼠探索实验箱及物体20分钟。然后停止记录（如为手动操作），并将大鼠放回其饲养笼中。移除物体，并用70%乙醇彻底擦拭物体和实验箱。</li>
		<li>对所有大鼠重复步骤2.8.3，使每只大鼠接受一次20分钟的编码试验。</li>
		<li>进行强编码（3次试验），允许大鼠探索实验箱及物体5分钟。然后停止记录（如为手动操作），并将大鼠放回其饲养笼中。不要移除物体，用70%乙醇擦拭实验箱和物体。</li>
		<li>对同一只大鼠再重复步骤2.8.5两次，共完成3次试验。时间结束后将大鼠放回饲养笼。移除物体进行彻底清洁，并用70%乙醇擦拭物体和实验箱。 
		注意：大鼠每次试验之间的间隔时间应约为1-2分钟。</li>
		<li>对每只大鼠重复步骤2.8.5–2.8.6。</li>
		<li>如果延迟时间短于24小时，则将笼子保留在实验房间直至测试试验。否则，在完成后将所有笼子送回饲养室。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>测试试验（第4次会话） 
	注意：延迟期应从编码试验开始时计算。
	<ol>
		<li>若延迟时间为24小时（或任何需要次日进行测试试验的情况），将所有笼子提前足够时间带入实验房间，以便在首次测试前让大鼠静置至少30分钟。根据时间表，将物体放置在指定位置（其中一个物体置于新位置）。</li>
		<li>到时间后，启动记录仪（如为手动操作）。将第一只大鼠放入实验箱内，使其面朝未放置任何物体的墙壁或角落（与每个物体的距离相等）。</li>
		<li>允许大鼠探索实验箱和物体5分钟。然后停止记录（如为手动操作）。将大鼠放回其饲养笼中。移除物体，并用70%乙醇彻底擦拭物体和实验箱。</li>
		<li>对每只大鼠重复步骤2.9.2–2.9.3。完成后将所有笼子送回饲养室。 
		​注意：在随后的每次编码/测试会话中，间隔至少48小时至最多1周后，从步骤2.7（环境适应）重新开始适应性训练方案。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. 数据分析
<ol>
	<li>对每只大鼠，使用专为此目的设计的软件或手动设置，分别在编码阶段和测试阶段对每个物体的探索时间进行评分。编码阶段的评分应覆盖整个持续时间，测试阶段的评分则以2分钟为宜，以获得最佳的区分效果3若使用自动在线软件评分，需从软件中导出评分数据。</li>
	<li>当大鼠接触物体、嗅闻物体或面向物体且距离小于2 cm时，计入探索时间。若大鼠攀爬或坐在物体上，只要其注意力集中在该物体上，也应视为探索行为；若大鼠注意力明显在其他位置，则不计入探索例如， 远离物体的方向）。</li>
	<li>计算每只大鼠对两个物体的总探索时间。若某只大鼠在测试试验中的总探索时间（按2分钟评分）少于10秒，则应考虑将其从本实验中剔除，因其可能反映了不可靠的探索行为。</li>
	<li>计算每只大鼠对每个物体的探索百分比（公式1）或辨别指数（DI）（公式2），并计算各组的平均值。 
	<img alt="行为分析实验中使用的探索百分比公式，公式如图所示。" src="/files/ftp_upload/62458/62458eq01.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="公式 1"> (1) 
	<img alt="辨别指数计算公式，新物体与稳定物体探索时间的比值，行为学分析。" src="/files/ftp_upload/62458/62458eq02.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="公式 2"> 
	注意：如果探索百分比为50%或辨别指数（DI）为0，表示表现处于偶然水平，大鼠对任一物体均无偏好。编码阶段试验中的平均探索百分比和DI应分别约为50%或0。在编码阶段试验中，若任一大鼠对某一物体的偏好超过[均值 ± (2 × 标准差)]范围，则应将其从相应测试的分析中剔除。此举可确保在测试阶段中对物体位置记忆的偏好判断具有可靠性。该阈值可针对单次测试单独计算，也可基于多次测试的合并编码数据进行计算。</li>
	<li>根据实验设计选择最合适的方法分析数据。采用单样本 t- 检验是否存在显著高于偶然水平的偏好。</li>
	<li>在使用多个情境并进行平衡设计时，应将相同实验条件下不同情境的结果进行合并。 
	注意：这将形成由相同大鼠组成的组，从而能够使用配对方法进行组内比较 t采用双样本t检验用于两组比较，采用重复测量方差分析（ANOVA）用于多于两组的比较。</li>
</ol>

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</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

如前所述，物体位置任务可用于多种研究，以探究空间记忆。该实验装置具有灵活性，可模拟不同强度的短期和长期记忆，且易于以较低成本实施。然而，由于该方案中存在许多可能影响结果的参数，且不同研究在这些参数上略有差异6，研究者在首次成功实施该任务时可能会遇到困难。上述方案旨在引导读者顺利开展这一过程。以下将进一步讨论在高重复性条件下成功实施该任务时可能至关重要的其他关键步骤。
尽管在进行物体位置实验时，编码/测试阶段通常是关注的重点，但操作和适应性训练方案对这类行为学测试的结果具有深远影响，因为测试结果依赖于未受干扰的大鼠自然行为14,15。因此，应谨慎设计编码/测试阶段之前的操作步骤，因为这些步骤可能影响大鼠的行为和记忆，从而影响最终结果。通过充分的操作和适应性训练，使大鼠熟悉实验人员和实验任务，可最大程度地减少应激因素的影响，同时提高其表现出自然行为的可能性8。如实验方案中所述，如果大鼠品系在本单位动物设施中饲养，操作训练最早可在幼鼠断奶后开始。根据以往经验（数据未显示）以及多项先前研究的结果16,17，这种早期操作训练可在随后数月中显著降低大鼠的焦虑水平，并增强其探索好奇心。
由于物体位置识别任务完全依赖大鼠内在的探索驱动力，如果大鼠缺乏探索意愿或对新异物体表现出回避行为（即“恐新行为”），其预期行为可能受到明显抑制。1因此，强烈建议根据研究的具体需求制定全面的动物操作与适应性训练方案。本方案可作为最低要求的指导，还可根据需要增加额外步骤（例如，如果研究后续需要进行注射，则需让动物预先适应注射操作及特定的固定姿势。实验大鼠的品系和年龄是另外两个具有影响的因素，在实验设计阶段应予以考虑，以避免出现次优结果。不同品系的大鼠在行为表现和基础焦虑水平上可能存在差异。18,19,20 因此，根据所用菌株的不同，可能需要对实验方案进行特定调整。
本方案已证实适用于经四次回交至Lister Hooded品系的Long-Evans背景的Th-Cre转基因大鼠，以及野生型Lister Hooded大鼠。在行为学实验中，大鼠理想的起始年龄通常约为12周20，但应考虑不同品系间的差异以及具体实验任务的要求。如果研究需要，也可使用发育中的大鼠，但可能需要对本方案进行调整，而这些调整不在本文讨论范围内。然而，必须考虑特定年龄的大鼠是否已发育出成功完成该任务所需的认知功能。一项相关研究21报道，只有出生后第38天的青春期大鼠（而非更早阶段）表现出以偏好新位置物体为特征的异心空间记忆，这一表现与成年大鼠一致。本文所描述的方案在首次编码/测试阶段开始时使用15至16周龄的大鼠取得了成功。此前，相同的强编码方案在使用23周龄大鼠时产生了次优甚至负面的结果，原因是这些大鼠在幼龄阶段缺乏足够的操作和适应训练，未能达到最佳的适应水平。这些大鼠的表现要么未显著偏离随机水平，要么实际上表现出对新异性的厌恶，表现为更偏好固定位置的物体而非移动过的物体（数据未显示）。这些结果表明，大鼠的年龄以及操作适应训练的时机可能影响适应效果，进而导致在测试中出现焦虑和新异物恐惧行为。
此处概述了两种不同的实验方案，分别用于确保在物体位置任务中实现强编码或弱编码。在建立这些方案的过程中观察到，在单次长时间试验中，动物对物体的兴趣在探索5-10分钟后逐渐下降。例如， 20分钟编码），大鼠最终停止探索，导致对物体位置的记忆变弱。一种将编码试验与短暂休息期交替进行的编码方案（例如， 3次5分钟编码）可克服这一问题，并在整个实验过程中保持较高的探索水平。因此，主动探索时间以及这两种编码方案的不同布局会影响记忆强度，3次5分钟编码后的记忆强于20分钟连续编码。采用单次试验与交错试验方案时，即使持续时间略有不同，也可获得类似结果，且可根据研究需求和大鼠品系进行适当调整。
与仅使用纯白色开放场地并依赖房间内外部线索的方案不同，本方案采用具有不同环境背景和迷宫内线索的实验区域，这可能需要更长的学习时间。因此，建议在编码试验前增加环境适应步骤。该步骤可使大鼠在适应阶段建立每个环境的空间地图，从而缩短后续编码试验的持续时间，因为大鼠只需将物体位置相对于该空间地图进行编码。此外，环境适应还能使大鼠对各环境中可能存在的干扰因素（如三维空间线索）产生习惯化，减少编码/测试阶段中除物体探索以外的其他行为。通过实施包含多个层次的全面平衡方法，即， 通过采用多种物体位置组合（计数器）和物体位移方向，可最大程度减少因实验区域角落光照强度及墙壁颜色/图案差异所引发的非预期偏好。
在重复该任务时，应考虑多个因素，以提高编码/测试阶段之间的可重复性，并尽量减少重复带来的影响。首先，需要设计不同的环境（数量应与编码/测试阶段的重复次数相同），以避免因在相同环境中反复进行实验而导致空间记忆的累积。为实现这一点，使用了带有可更换的不同颜色和图案墙壁的装置（图1B、C）。这些不同的墙壁以及悬挂在墙上的三维物体（例如具有不同颜色和形状的玩具或小型日常物品，参见实验方案及图1C）构成了大鼠可能用于学习物体位置相对于环境关系的空间线索和地标。如果测试未能产生对移动物体的偏好，可考虑改变这些环境参数（如墙壁设计和空间线索）。此外，物体位置任务也可采用矩形或圆形区域，而非本方案中使用的方形区域。据报道，圆形区域可消除在有角区域中常观察到的角落偏好22，因此在处理特别高焦虑的大鼠或小鼠品系时可能更具优势。尽管本方案中创建四个不同环境的要求与四边形区域配合使用效果最佳，但通过一些调整，圆形区域也可实现相应功能。
其次，各编码/测试会话之间的间隔时间应予以确定，以确保大鼠每次均保持相同水平的兴趣，同时避免因重复过于密集而导致的累积学习效应。通常情况下，编码与测试试验之间延迟时间长度的至少两倍间隔即已足够，而对于超过两次的重复，则更长的间隔更为有利。这意味着，对于一到两次重复，24小时测试后至少48小时的间隔已足够，但对于四次重复，则建议采用1周的间隔。如图5中的结果以及ANOVA比较所示，该任务可成功重复四次。基于此，既定方案可用于平衡最多四种实验条件。实验组的数量决定了在不同情境下进行编码/试验会话重复的次数。图5中的结果展示了使用该方案的一种可能方式，即包含两个实验组的情况。这两组在两次会话中进行了交叉平衡，并在另外两次会话中重复了相同条件（用于验证目的）。第二组交叉平衡会话也可用于平衡新的条件。类似地，可分别通过三次或四次交叉平衡会话来比较三种或四种实验条件。
在这些情况下，应设计不同的实验情境以适应方案中描述的对比特征。值得注意的是，对于需要额外操作（例如可能产生持久效应或损伤的药理学干预）的实验，交叉平衡设计可能并不适用。为了保持测试的有效性和可重复性，应相应地设计实验。重复测试的数据可以通过多种方式呈现和分析，如图5所示。在初步分析中，可使用单样本t-检验将每种情境下的实验组分别与偶然水平进行比较，以确定是否存在显著偏好（图5B、D）。这种方法有助于快速了解数据，但仅能实现组间的间接比较。因此，在比较两个或多个组时，应分别采用双样本t-检验（配对或非配对）或方差分析（ANOVA）。这种分析可以表现为单次编码/测试会话内组间的被试间比较（图4A和图5B、D），也可以表现为来自两个（或多个）交叉平衡情境的组内被试内比较（图5C、E）。后一种方法尤为推荐，特别是在处理记忆较弱的条件时，因为如前所述，此类条件会因行为的随机性而导致较高的变异度。
结合使用平衡对照的实验条件，可形成较大的实验组，从而在变异最小的情况下可靠地观察群体行为。采用在平衡对照实验中设置重复的方案，与使用相同统计效能的单次测试相比，所需大鼠数量可减少至约三分之一。通常情况下，对于平衡对照实验，总样本量为7至15只大鼠；对于单次实验，每组10至25只，总计20至50只大鼠，在效应量和统计效能均大于0.8时，已足够满足实验需求。采用本方案不仅减少了所需实验动物的数量，还提高了从每只动物身上获取信息的效率，从而优化了研究设计，并符合实验动物伦理使用中的“3R”原则。在此步骤中需注意，大鼠的随机行为（即未伴随较强记忆的行为）可能导致个体偏好显著偏离随机水平，无论高于或低于随机概率；但群体平均值应显示与随机水平无显著差异的偏好。个体数据应谨慎解读。组内个体数据点的分布情况对于结果解释也具有参考价值。如图4和图5所示，数据分布会因记忆强度的不同而发生变化。总体而言，本文所描述的方案易于实施，可用于建立包含重复测试的物体位置识别任务，以模拟短期和/或长期空间记忆。该任务训练方案简单且灵活，还可进一步实施多种干预操作，因此广受欢迎。通过对本方案进行上述修改，可针对性地研究记忆获取、巩固和提取等特定阶段。

自发识别任务（例如，物体识别、物体位置识别）已广泛应用于啮齿类动物记忆研究中。与基于恐惧条件反射或奖赏动机的记忆评估方法不同，自发识别任务完全依赖于动物对新刺激的自发探索行为。这种行为被称为“新奇偏好”1，在啮齿类动物以及其他哺乳动物甚至某些非哺乳动物（如鸟类和鱼类）中均普遍存在2。依赖于空间记忆的物体位置识别可通过物体位置任务（也称为空间物体识别任务）进行观察3。损毁研究表明，完整的海马体是实现物体位置识别所必需的4,5。由于该任务训练方案相对简单，且无需任何强化训练，因此在许多研究中具有优势。由于既无正性也无负性强化，该任务可最大限度减少可能影响行为的额外参数和脑区干扰。因此，该行为是中立的，仅基于好奇心和空间记忆，从而有助于研究空间记忆编码、巩固和提取过程中涉及的神经机制。
物体位置任务的实验方案通常包括适应性训练阶段，随后进行一次编码试验和测试试验，两者之间设有延迟期，延迟时间从数分钟到数小时不等。强烈建议在实验前对大鼠进行充分抓握训练，以最大限度地降低动物的应激水平，从而减少可能影响识别记忆的行为，例如对新异刺激的回避反应。同样，设计良好的适应性训练方案在防止应激方面起着关键作用，避免应激干扰大鼠在任务中的自然行为。然而，不同实验室和研究者之间在抓握训练和适应性训练的程度上存在较大差异，这可能是导致实验可重复性较低的原因之一6,7,8。在编码试验中，让大鼠在设有两个相同物体（分别放置于指定两个角落）的开放场地中自由探索一段时间。在随后的测试试验中（与编码试验间隔一段延迟时间），大鼠再次被放入同一场地，其中仍放置相同的两个物体，但其中一个物体已被移至新的位置。大鼠表现出的自发探索偏好，以及在新位置物体上花费的探索时间增加，反映了其空间识别能力及对物体位置的记忆3。改变编码试验的持续时间或重复次数会影响记忆的强度。
根据研究目的，可通过调整编码阶段与测试阶段之间的延迟时长，以建模蛋白质合成非依赖性的短期记忆或蛋白质合成依赖性的长期记忆。因此，通过适当调整实验方案，物体位置识别任务可广泛应用于多种不同类型的研究。此外，在这些试验之间还可引入多种实验干预措施，例如药理学干预或光遗传学干预，也可进行in vivo（活体）成像。已有若干研究9,10报道了在同一组大鼠中重复多次实施物体位置识别任务。这与传统使用方式形成对比，传统方法通常每只动物仅进行一次实验且无重复。然而，此类实验范式的有效性尚未得到充分验证，目前也尚无方法学论文对此类方案进行详细描述。据我们所知，本文首次详细报道了一种可在同一组大鼠中重复多达四次的物体位置识别任务方案，并系统比较了每次重复的实验结果。通过重复实验可实现对实验条件的平衡设计，从而支持受试者内部比较，并降低不同测试之间的变异性。该任务的可靠重复性使得数据可以合并分析，意味着使用相对较少数量的大鼠即可获得足够大的数据量。最后，在涉及外科手术和植入操作的实验中，使用同一批大鼠进行重复实验可减少所需大鼠数量，从而节省时间和人力成本。
本研究提供了一项详尽的实验方案，详细描述了如何在成年大鼠中开展物体位置识别任务，该任务包括强编码和弱编码训练试次，随后进行延迟1小时和24小时的测试试次。强编码方案在1小时和24小时延迟测试中均能产生具有统计学意义的识别记忆，因此可用于研究通过干预手段抑制短期和长期记忆的机制11。相比之下，弱编码方案仅在1小时延迟测试中产生显著的短期记忆。由于缺乏长期记忆，该方案可用于研究增强记忆保持能力的干预措施11,12。本方案还包括详细的抓取与适应性训练环节，旨在提高物体位置识别任务的可重复性。本文还展示了在同一组大鼠中，使用弱编码方案在四种不同环境中重复执行该任务的过程，结果证实每次均能获得可重复且一致的结果。

<table><tbody><tr><td>开放场/实验箱</td><td>O'Hara &amp;amp; Co (Japan)</td><td>OF-3001</td><td>用于物体位置任务的开放场箱</td></tr><tr><td>物体1：圆锥体</td><td>O'Hara &amp;amp; Co (Japan)</td><td>ORO-RR</td><td></td></tr><tr><td>物体2：橄榄球</td><td>O'Hara &amp;amp; Co (Japan)</td><td>ORO-RB</td><td></td></tr><tr><td>物体3：矩形块</td><td>O'Hara &amp;amp; Co (Japan)</td><td>ORO-RC</td><td>购买后对矩形块进行了改造</td></tr><tr><td>物体位置任务装置</td><td>O'Hara &amp;amp; Co (Japan)</td><td>SPP-4501</td><td>包含用于物体位置任务的开放场箱的隔音箱</td></tr><tr><td>追踪软件</td><td>O'Hara &amp;amp; Co (Japan)</td><td>TimeSSI</td><td>用于运动追踪和自动摄像功能</td></tr><tr><td>野生型 Lister Hooded 大鼠</td><td>Charles River</td><td>603</td><td></td></tr></tbody></table>

使用物体位置任务的大鼠组内实验设计

A Within-Subject Experimental Design using an Object Location Task in Rats

物体位置识别是一种用于研究啮齿类动物空间记忆的常用方法。这种物体位置识别记忆构成了物体位置任务的基础。本文提供了一套详尽的实验方案，指导如何使用同一批大鼠建立物体位置任务，并可选择进行最多四次重复测试。该方案既可采用弱编码协议，也可采用强编码协议，以研究强度不同的短期和长期空间记忆，并便于实施相应的记忆抑制或增强干预措施。此外，通过采用本文提供的平衡设计进行多次测试，可将两次或更多次测试的结果结合起来进行个体内的比较，从而降低大鼠之间的个体差异。该方法有助于提高统计效能，尤其在进行个体行为变异较大的实验时强烈推荐使用。这种方法通过增加每只动物所提供的数据量，减少了所需的总体动物数量，从而直接优化了实验设计。&#160;最后，重复进行物体位置任务可提高涉及手术操作的研究效率，节省时间和人力。

此处展示的是使用雄性酪氨酸羟化酶（Th）-Cre 转基因大鼠13（该品系以Long-Evans品系与Lister Hooded品系回交四代）以及野生型Lister Hooded大鼠所进行的强编码和弱编码两种实验方案的代表性结果。选择Th-Cre转基因大鼠是因为该品系将用于后续涉及光遗传学的研究中。采用每种编码方案后，分别在1小时和24小时延迟条件下测试记忆。1小时的测试反映短期记忆，而24小时的测试反映长期记忆。编码偏好性的排除阈值按实验方案所述方法计算，基于五次测试（强编码与弱编码方案）的合并数据得出，为[50.8% ± (2×10.8%)]。在分析各次测试结果时，编码偏好高于或低于该阈值范围的大鼠均被排除在外。
在强编码实验中使用了16只大鼠，在弱编码实验中使用了19只大鼠。在强编码试验期间（3次 × 5分钟编码；图4A），动物对任一物体均无显著偏好（52.0 ± 1.9%，n = 16，t15 = 1.1，p = 0.29；单样本t检验与偶然水平比较）。该强编码方案导致动物在新位置的物体上表现出偏好，以平均探索百分比表示，在1小时和24小时延迟的记忆测试中均显著高于偶然水平（1小时记忆：77.9 ± 2.4%，n = 8，t7 = 11.8，p &lt; 0.001；24小时记忆：65.2 ± 5.3%，n = 8，t7 = 2.8，p = 0.025；单样本t检验与偶然水平比较）。1小时与24小时记忆之间无显著差异（p = 0.056；非配对Welch's t检验）。
在弱编码试验期间（20 分钟编码；结果来自四种情境的合并数据；图 4B），动物对任一物体均无显著偏好（51.1 ± 1.0%，n = 66，t65 = 1.2，p = 0.24；单样本 t 检验，与随机水平比较）。该弱编码方案在 1 小时延迟测试中导致动物对位于新位置的物体偏好显著高于随机水平，但在 24 小时延迟测试中则未观察到此效应（所有四种情境的合并数据；1 小时记忆：66.7 ± 2.0%，n = 32，t31 = 8.2，p &lt; 0.001；24 小时记忆：49.6 ± 2.6%，n = 34，t33 = 0.16，p = 0.87；单样本 t 检验，与随机水平比较）。1 小时与 24 小时延迟测试之间的表现存在显著差异（1 小时记忆：n = 32，24 小时记忆：n = 34，t61.5 = 5.2，p &lt; 0.001；非配对 Welch's t 检验）。
在24小时延迟测试中，群体水平的记忆未被观察到，表现为机会水平的表现，但显示出个体差异。这种在弱记忆或无记忆条件下（例如，24小时测试）较高的变异性通常是由于动物对物体的探索行为更加随机所致。因此，不应单独解读每只大鼠的表现。相反，应结合个体数据点的分布与群体平均值，作为测试的可靠结果。编码越强，大鼠的行为越趋于一致，达到统计学显著性所需的大鼠数量就越少，如图4A中强编码方案所示。相比之下，在弱效应条件下获得可靠结果需要更大的样本量（图4B）。
<img alt="强编码与弱编码探索时间比较的条形图记忆编码示意图。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62458/62458fig4v3.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图 4"> 
图 4：强编码与弱编码后的记忆表现。 （A）强编码试验（3 次 × 5 分钟编码）后分别进行 1 小时或 24 小时测试。在编码阶段，动物对任一物体均无显著偏好（n = 16）。强编码在 1 小时和 24 小时延迟测试中均显著提高了对新位置物体的偏好，与偶然水平相比具有统计学意义（1 小时和 24 小时记忆：每组 n = 8）。两组间无显著差异。（B）弱编码试验（20 分钟编码）后分别进行 1 小时或 24 小时测试。在编码阶段，整体上动物对任一物体均无显著偏好（n = 66）。弱编码在 1 小时延迟测试中显著提高了对新位置物体的偏好，但在 24 小时延迟测试中未达到显著水平（1 小时记忆：n = 32；24 小时记忆：n = 34）。1 小时与 24 小时延迟测试的表现之间存在显著差异。结果汇总自四个实验环境。个体数据点以圆点表示。所有条形图显示在新位置物体上的探索时间百分比，数据表示为均值 ± 标准误（SEM）。*p &lt; 0.05，***p &lt; 0.001；单样本 t-检验与偶然水平（50%，虚线）比较。###p &lt; 0.001；ns，无显著性差异；非配对 Welch's t-检验。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62458/62458fig4v3large.jpg" target="_blank">请点击此处查看本图的放大版本。</a>
该成熟方案的一个显著优势在于，可以使用四种不同的环境（图1C）对同一批大鼠进行四次实验。如图5所示，展示了一种采用平衡设计的可行方式，包含两个实验组（1小时记忆组和24小时记忆组）。这两个实验组在两种环境中进行平衡（环境1和环境2），并在另外两种环境中重复该过程（环境3和环境4；图5A）。四个环境的实验结果分别呈现在图5B、D中，通过将每个实验组在各环境中的偏好与偶然水平进行比较来评估记忆表现（1小时记忆：环境1，69.9 ± 3.6%，n = 9，t8 = 5.5，p &lt; 0.001；环境2，65.6 ± 3.9%，n = 9，t8 = 4.0，p = 0.004；环境3，65.2 ± 3.8%，n = 7，t6 = 4.0，p = 0.007；环境4，65.3 ± 5.6%，n = 7，t6 = 2.7，p = 0.035；24小时记忆：环境1，45.1 ± 6.4%，n = 9，t8 = 0.77，p = 0.46；环境2，49.1 ± 4.9%，n = 9，t8 = 0.18，p = 0.86；环境3，57.2 ± 4.1%，n = 8，t7 = 1.7，p = 0.12；环境4，47.6 ± 4.7%，n = 8，t7 = 0.52，p = 0.62；单样本t检验对比偶然水平）。
在情境1、2和4中，组间的被试间比较显示1小时记忆与24小时记忆之间存在显著差异（1小时记忆对比24小时记忆：情境1，t12.7 = 3.4，p = 0.005；情境2，t15.2 = 2.6，p = 0.019；情境3，t13.0 = 1.4，p = 0.17；情境4，t12.2 = 2.4，p = 0.032；非配对Welch's t-检验）。为了更清晰地呈现数据并进行被试内比较，将两个顺序平衡的情境结果合并（图5C，E）。再次将合并后的实验组分别与机遇水平进行比较（情境1和2合并：1小时记忆，67.8 ± 2.6%，n = 18，t17 = 6.7，p &lt; 0.001；24小时记忆，47.1 ± 3.9%，n = 18，t17 = 0.74，p = 0.47；情境3和4合并：1小时记忆，65.3 ± 3.3%，n = 14，t13 = 4.7，p &lt; 0.001；24小时记忆，52.4 ± 3.2%，n = 16，t15 = 0.73，p = 0.48；单样本t-检验对比机遇水平）。随后，对各实验组之间进行了相互比较。
在两组情境对中，组间均存在显著差异，这通过被试内比较分析得以揭示（1小时记忆与24小时记忆：情境1和2合并，t16 = 3.5，p = 0.003；情境3和4合并，t13 = 2.4，p = 0.032；配对t检验）。在使用情境1和4进行两次平衡会话的弱编码方案中，野生型Lister Hooded大鼠也获得了类似结果（数据未显示）。通过单因素方差分析（one-way ANOVA）对每组数据集进行比较，验证了结果的可重复性和可靠性。在四种情境之间未检测到显著差异（1小时记忆：F3,28 = 0.31，p = 0.81；24小时记忆：F3,30 = 0.99，p = 0.41）。因此，只要遵循本方案中的操作说明，物体位置测试即可被可靠地重复进行，且重复操作的影响最小。
<img alt="行为学研究示意图，柱状图显示不同实验情境和测试延迟下的探索时间。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62458/62458fig5v3.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Figure 5"> 
图5：采用两个实验组在两个会话中交叉平衡设计的弱编码方案结果呈现与分析方法。（A）在两个会话（情境1和2）中对两个实验组（1小时记忆组和24小时记忆组）进行交叉平衡的实验设计。该交叉平衡在另外两个会话（情境3和4）中重复进行。（B 和 D）分别将各情境下实验组的结果与偶然水平以及彼此之间进行比较。在全部四个情境中，1小时延迟测试中对新位置物体的偏好均显著高于偶然水平［情境1和2：每组 n = 9（B）；情境3和4：每组 n = 7（D）］。在24小时延迟测试中，对新位置物体的偏好与偶然水平无显著差异（情境1和2：每组 n = 9；情境3和4：每组 n = 8）。通过组间比较发现，实验组在情境1、2和4中的偏好存在显著差异，但在情境3中无显著差异。*p &lt; 0.05，**p &lt; 0.01，***p &lt; 0.001；单样本t-检验对比偶然水平（50%，虚线）。#p &lt; 0.05；##p &lt; 0.01；ns，无显著性；非配对 Welch's t-检验。（C 和 E）将两个交叉平衡情境中的实验组数据合并后呈现结果［合并情境1和2，每组 n = 17（C）；合并情境3和4，每组 n = 14（E）］。在两组情境中，1小时延迟测试中对新位置物体的偏好均显著高于偶然水平，而24小时延迟测试则未达到显著性。通过组内比较发现，在两组情境中，1小时与24小时延迟测试对新位置物体偏好的差异均显著。***p &lt; 0.001；单样本t-检验对比偶然水平（50%，虚线）。#p &lt; 0.05，##p &lt; 0.01；配对t-检验。个体数据点以圆点表示。所有柱状图显示对新位置物体探索时间的百分比，误差线表示均值 ± 标准误（SEM）。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62458/62458fig5v3large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>

本方案提供了使用同一批大鼠进行四次重复的物体位置任务的详细步骤。弱编码和强编码可分别产生短期记忆和长期记忆。该方案通过重复设计提高了灵活性，对于涉及手术操作的研究而言，有助于节省时间和劳动力。

物体位置识别是研究啮齿类动物空间记忆的常用方法。这种物体位置识别记忆构成了……的基础。

物体位置任务利用啮齿类动物的自发探索行为，使我们能够研究空间记忆形成或保持的多种机制。本方案允许重复进行最多四次物体位置任务，有助于提高涉及手术操作的研究的统计效能、效率和产出。首先，准备一个由不透明、无孔硬质塑料制成的方形实验 arena，其宽度至少为60厘米，高度为50厘米。为确保自动化软件成功记录大鼠的运动，请确保实验场地地面的颜色与大鼠的体色形成对比。将实验装置放置于箱体内或由帘子围蔽的平台上。为创建特定环境背景，可在实验场地内插入第二层不同颜色或图案的可拆卸侧壁。悬挂具有不同几何形状和颜色的三维空间线索，高度需足够，确保大鼠无法触及。将不同组合的、具有明显几何形状和质地的非多孔、不可啃咬且易于清洁的物体固定在实验区域的地面。用垫料填充一个非正方形的桶。在桶内随机放置 5 到 10 个与实验中将使用的物体形状和大小不同、且彼此不同的物体。在第一阶段，将所有家庭饲养笼带入实验房间，让大鼠适应房间环境并静置至少 30 分钟。将同一笼中的 2 到 4 只大鼠一起放入桶中，持续约 20 分钟。每次处理完一组大鼠后，清除桶内所有粪便物质以清洁桶。将所有大鼠放入其各自的饲养笼中，并送回饲养室。在第二次实验时，将所有笼子移至实验房间，静置至少30分钟。将每只大鼠单独放入桶中10分钟。每次实验后将大鼠放回其居住笼，并清洁桶。实验结束后，将所有笼子送回饲养室。第四次实验时，将所有鼠笼移至实验室内，静置至少30分钟。从同一鼠笼中取出2至4只大鼠，共同放入无任何环境或空间线索的空旷场地中，持续20分钟。每组实验结束后，将所有大鼠放回原鼠笼，并用70%乙醇擦拭场地。调整空旷的实验区域以创建第一个环境，但不要将物体放入实验区域内。在环境适应的第一阶段，将所有笼子带入实验房间，并静置至少30分钟。启动记录设备，然后将第一只大鼠放置在实验区域的中央，允许其自由探索实验区域10分钟。然后停止记录，并将大鼠放回其居住笼中。完成操作后，将所有笼子送回饲养室。对每只大鼠，在接下来的连续两天内重复进行第二和第三次实验，使每只大鼠总共完成三次情境适应实验。将所有笼子带入实验房间，静置至少30分钟。根据事先准备好的时间表，使用粘性垫或双面胶带将第一对相同物体放置在指定位置。启动录像设备，将第一只大鼠放置在距离两个物体相等的位置，使其面向未放置任何物体的墙壁或角落。对于弱编码，让大鼠在单次试验中探索环境和物体20分钟。对于强编码，让同一只大鼠进行三次试验，每次探索5分钟。停止记录。将大鼠放回居住笼中，每次记录后移除物体并用乙醇擦拭实验区域。将所有笼子移至实验房间，确保在第一次测试前留有充足时间，使大鼠至少适应环境30分钟。将物体放置在指定位置。启动记录仪，将第一只大鼠放入实验区域，使其面朝一个未放置物体的墙壁或角落。让大鼠在实验区域内探索环境和物体，持续五分钟。随后将大鼠放回其居住笼中。移除物体，并用70%乙醇彻底擦拭物体和实验区域。每只大鼠均重复进行记录，然后将笼子放回饲养室。对每只大鼠，在编码阶段和测试阶段均需记录其对每个物体的探索时间。对整个持续时间的评分编码试验以及持续两分钟的测试试验进行评分，以获得最佳的辨别性能。计算每只大鼠对每个物体的探索百分比或辨别指数，并计算各组的平均值。采用单样本T检验来检测是否存在显著高于偶然水平的偏好。强编码方案导致在1小时和24小时延迟测试中，大鼠对新位置物体的平均探索百分比显著高于50%的随机水平，表现出对该物体的偏好。弱编码方案在1小时延迟测试中显著提高了对新位置物体的偏好，高于随机水平，但在24小时延迟测试中未达到显著性。该方案的一个显著优势是，可使用同一组大鼠，在四个不同的环境中重复进行四次实验。此处展示了一种使用平衡设计的可能方式的结果，该设计包含一小时记忆和24小时记忆两个实验组。这两个实验组在情境一和情境二中进行了交叉平衡，并在另外两个情境（情境三和情境四）中重复了该过程。这四个情境的结果分别呈现，每个情境中通过将各实验组的偏好与偶然水平进行比较来评估其记忆表现。四种情境之间未检测到显著差异。为了更清晰地呈现数据并进行被试内比较，将两个顺序平衡的情境结果合并，并采用被试内比较方法（即配对T检验）进行分析。由于该任务依赖于动物的好奇心，因此操作过程中的处理与适应至关重要，以确保动物在测试过程中不会感到过度压力或恐惧。本方案中还可实施药理学和光遗传学干预，以及体内成像，用于研究短期和长期记忆，并增强或损害这些记忆。

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Behavior

行为

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