Name: 1H R1 + RNA 放松分散实验样品制备和设置的实用方面 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-07-09T13:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 17 s
Description: 学习RNA样品制备与R1rho核磁共振实验设置，用于研究RNA构象动态交换。该方法无需同位素标记即可直接观测碱基配对变化，为微秒至毫秒时间尺度的RNA动力学提供原子级分辨率。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

我们感谢卡罗林斯卡学院蛋白质科学设施（PSF）在T7 RNA聚合酶的表达与纯化方面提供的帮助。 E. coli RNase H，Martin Hällberg 慷慨提供了无机磷酸酶，以及 Petzold 实验室全体成员的宝贵讨论。感谢 Luca Retattino 制备了 U-凸起结构，Emilie Steiner 和 Carolina Fontana 在宏程序和拟合脚本方面的贡献。我们感谢卡罗林斯卡学院（Karolinska Institute）和医学生物化学与生物物理学系对购置 600 MHz 核磁共振波谱仪及职位资助（KI FoAss 和 KID 2-3707/2013）的支持。本研究获得瑞典研究理事会（Vetenskapsrådet，项目号 #2014-4303）、瑞典战略研究基金会（Stiftelsen för strategisk Forskning，项目号 ICA14-0023 和 FFL15-0178）、Ragnar Söderberg 基金会（M91-14）、Harald och Greta Jeansson 基金会（JS20140009）、Carl Tryggers 基金会（CTS14-383 和 15-383）、Eva och Oscar Ahréns 基金会、Åke Wiberg 基金会（467080968 和 M14-0109）以及癌症基金会（Cancerfonden，CAN 2015/388）的经费支持。J.S. 获得了欧盟“地平线 2020”计划玛丽·斯克沃多夫斯卡-居里个体奖学金（Marie Skłodowska-Curie IF，项目编号 MSCA-IF-747446）的资助。

K.P. 担任 Arrakis Therapeutics 公司的顾问，该公司致力于发现靶向 RNA 的小分子药物。

本文所述方案综合了此前以研究论文形式发表的多种方案10,20,21,31。因此，读者可根据需要选用本方案中的某些部分，而替换其他部分。例如，只要假设RNA具有正确的折叠构象且长度均一，R1ρ测量即可应用于采用任意方法制备的RNA样品。此外，本方案未包含RNA序列的共振峰归属信息——这是弛豫色散（RD）实验所必需的步骤——因为该内容在以往文献中已有详尽阐述19,37,38。部分标记、分段标记或位点特异性标记策略36,41,42,43,44&#160;有助于实现共振峰归属或减少RD实验中目标共振峰的重叠，相关方法在文献中已有广泛描述。本方法支持对任意核苷酸类型进行均匀标记，这本身已可显著简化共振峰归属过程。
本文介绍的体外转录（IVT）方法克服了其他方法在序列设计和标记方面已知的问题，提高了产量，同时降低了成本和操作时间。利用病毒起始序列可减少对反应条件优化的需求，而反应优化是该领域中一个众所周知的难题，耗时较长，且在非G起始的情况下往往只能产生少量转录本。T7体外转录与RNase H对串联转录本的切割可在同一反应体系中同时进行。在变性PAGE凝胶电泳中可观察到反应过程中出现多聚体串联重复的条带模式，当RNase H反应完成后，这些条带会合并为一条目标RNA的单一主带（图3A，泳道1和2b）。采用该方法的典型产量通常为每1 mL IVT反应生成30至70 nmol RNA。然而，基于RNase H切割串联重复序列的方法本身也存在某些局限性。当RNase H切割反应与T7转录同时进行时，切割反应常常无法完全完成（图3A，泳道2a）。
通过将切割向导与转录本退火并添加更多的RNase H，可完成串联单元的分离（图3A，泳道2b，步骤2.1.2）。由于大体积样品加热速度较慢，且会导致Mg2+催化的RNA水解，因此使用了常规微波炉，可在10-15秒内将样品加热至&#62;95 °C。迄今为止尚未观察到对所制备样品产生不利影响的情况。某些构建体会出现微弱的第二条带，优化反应条件也无法完全消除（图3A，泳道4）。通常情况下，若采用优化良好的洗脱梯度，这些条带在HPLC色谱图中会表现为较为明显的肩峰，并可通过后续步骤去除（步骤2.2.5）。以下讨论旨在强调本实验方案中的关键步骤，特别是针对获得高质量数据以解析构象动态的相关要点。
RNase 污染 
细胞外 RNase 无处不在且高度稳定，是影响 NMR 样品长期稳定性的最大威胁。因此，必须在无 RNase 的环境中操作，并确保所有试剂和塑料器皿均保持无 RNase 状态。建议使用滤芯吸头，甚至佩戴口罩。这一点在 HPLC 纯化后尤为重要。被 RNase 污染的 NMR 样品通常在数天或数周后，由于单核苷酸降解产物的产生，在 1H-1D 谱图中出现明显的窄峰。此类样品不适合进行 R1ρ&#160;测量。
NMR 样品 
由于 RNA 具有高度带电的特性，与大多数蛋白质相比，可以在不发生沉淀的情况下使用较高浓度。使用 Shigemi NMR 管（见材料表）具有优势，因为它能够在保持理想匀场和锁场条件的同时，将高浓度样品精确置于线圈中心，这得益于其磁化率匹配的玻璃底部和推杆设计。这种方法可降低 B1 场的不均匀性，从而获得更窄的谱线。NMR 管中典型的样品体积为 250 µL，典型浓度为 1–2 mM。不建议在 RD 实验中使用低于 500 µM 的样品，因为实验时间会过长且难以获得良好的匀场效果。同样，样品体积低于 200 µL 也不推荐，因为需要良好的匀场和磁场稳定性（锁场）。插入推杆时，必须避免在样品中产生气泡（步骤 2.4.5）。如果推杆未正确固定，可能会滑入样品中，导致可检测体积减少。此外，温度的快速变化可能导致样品中形成新的气泡。因此，在运输样品以及在 NMR 谱仪中调节探头温度时应格外小心。在长时间放置后重新测样时，应检查样品中是否存在气泡。
RNA折叠 
动态的RNA分子在未正确折叠时可能以多种构象存在。尽管二级结构的熔解温度可能仅略高于室温，但在测量前仍建议进行彻底的加热-快速冷却处理。在动力学控制下（加热-快速冷却）折叠的高浓度发夹结构RNA样品，随时间推移可能形成同源二聚体，因此每次核磁共振（NMR）测量前都必须严格控制RNA的折叠状态。如果待测RNA不是发夹结构，而是RNA双链体，则应采用在热力学控制下的缓慢折叠方法。
在此情况下，加热后的冷却过程应持续数小时，同时RNA应在NMR样品中使用其最终体积和浓度。初步统计预期的亚氨基和芳香族共振信号可提供有关样品均一性的信息。如果样品表现不符合预期，则应重新折叠。Mg2+（以氯化物盐形式加入）有助于RNA结构的折叠45。在实际操作中，折叠对照用于与已至少部分完成NMR共振信号归属并已通过实验解析二级结构的样品进行比较。
旋转锁定功率与加热因素考量 
如果要运行 1H R1ρ RD 实验作为二维概览实验时，SL 功率不应低于 1.2 kHz。射频发射频率应置于所关注峰的 ppm 区域的中央。例如，芳香族质子为7.5 ppm）。此时1.2 kHz的带宽足以对这些质子进行自旋锁定，而不会产生显著的失共振效应。此类效应可在弛豫色散（RD）谱图中被识别。若出现此类情况， R2+REX 数值随SL功率值增加而升高，而非降低，尤其是在低SL功率时更为明显。请检查所计算的SL功率值是否对应于实际传递至样品的功率。在实际操作中，若满足以下条件，可使用计算所得的SL功率值 1在较新的波谱仪上，H 90°硬脉冲已仔细校准；然而，也可通过针对每个所需带宽校准SL功率来验证。
可使用的SL功率范围，可用于 1H R1ρ RD实验范围很广，导致样品加热程度不同（HSQC的采样频率为1.2 kHz至15 kHz）&#160;基于HCP的序列用于SELOPE实验中的50 Hz至15 kHz范围。当比较低功率SL获得的1D谱时，样品加热不均可通过化学位移的微小变化检测到。 与高功率SLs。该效应在热补偿中通常未被考虑 R1ρ 对异核实验的热补偿。在这些实验中，热补偿通常用于校正由于每个自旋锁功率系列的可变延迟（vd）列表中指定的不同自旋锁持续时间所引起的加热差异。特别是对于SELOPE实验，应如文中所述，在所有施加的自旋锁（SL）强度范围内使用第二种热补偿。20.
vd 列表注意事项 
如前所述，vd 列表应包含足够长的时间点，以获得明显的信号强度衰减（理想情况下衰减至初始信号的 30%，或在探针规格允许范围内尽可能低，若无法达到 70% 衰减）。尽管该 vd 列表是在低 SL 功率（1.2 kHz）条件下优化的，但仍应在即将使用的最高 SL 功率下进行测试例如，15 kHz）。这是由于对于具有显著 REX 在高SL功率下，衰减会显著减慢，因此也必须在高SL功率下验证是否存在充分的衰减。在非共振实验中，对于高偏移量下的衰减行为也需同样考虑。在色散实验的不同区域，vd列表的理想最大时间点可能会有显著差异。在此情况下，可在vd列表中包含更多时间点，并在分析时根据其导致的低SINO（信噪比）舍弃针对高SL功率或高偏移量所对应的较长vd时间点。通常情况下，应考虑设置5至8个vd列表时间点，以便识别可能导致非指数衰减的潜在伪影，例如J耦合效应（见下文）。
1D-HCP 选择性注意事项 
在运行基于 HCP 的 1D 实验时，若目标峰在 1H 维度上与另一个峰在基于 2D HSQC 的实验中发生重叠，则必须格外谨慎。基于 HCP 的磁化转移具有很高的选择性，但从未达到 100% 完全选择性，因此在 1D 实验中，其他峰可能对目标峰的强度和衰减行为产生贡献。若使用标记实验的 1D 与 2D 方法测得的共振态 R1ρ 值存在差异，则提示可能存在此类干扰。
ROE 考虑事项： 
对于处于慢-中等交换状态的原子，可通过将测得的 Δω 与 NOESY 或 ROESY 谱图进行比较来识别 ROE 伪影。如果在对应于 Δω 的化学位移差处观察到交叉峰，则所观测到的激发态可能实际上为 ROE 伪影（例如，在芳香族质子之间发现 ROE，这些质子均处于相同的化学位移范围内，因此被这些离共振曲线所覆盖20）。根据经验，这种情况通常还会导致拟合效果较差且误差较大，可能是由于 ROE 随自旋锁（SL）功率增加的变化模式与 REX 不同所致。对于中等-快速交换情况，问题变得更加复杂。尽管共振曲线（通过与相邻核上获得的 13C 数据比较）仍能代表基态（GS）与激发态（ES）之间的交换过程，但离共振曲线会受到多种 ROE 伪影的影响。
在这种情况下，自旋锁定（SL）检测交换过程的功率较大（&#62;1.5 kHz），因此会影响更多质子，因为非共振曲线覆盖了各种ROE候选信号之间的化学位移差异（对于H8而言，这些信号包括：约±1000 Hz处的氨基质子、约-1200&#160;Hz处的H5/H1质子，以及约3500 Hz处的亚氨基质子）。迄今为止，尚未发现能够有效抑制此类ROE伪影的方法（部分氘代核苷酸的使用除外46），因此对于快速至中等交换过程，不应采集非共振数据，因为若无法通过NOESY谱排除NOE/ROE的贡献，则无法通过该方法可靠地提取真实的&#160;Δω&#160;信息。
J-耦合（Hartmann-Hahn）注意事项 
尽管同核J-耦合质子（如H6）的在共振曲线已成功记录10,20，但在进行离共振测量时必须格外谨慎，尤其是在低自旋锁定（SL）功率下，因为Hartmann-Hahn匹配条件可能覆盖较宽的偏移范围。Hartmann-Hahn伪影可在共振处的弛豫色散（RD）图中识别，表现为指数衰减上的振荡，或随着SL强度增加而升高的R2+REX值20。

RNA在细胞中执行多种调控1、催化2和结构3功能，其中许多功能与分子结构的灵活性及其复杂构象变化密切相关4,5,6,7。低布居态通常无法被大多数结构测定方法所观测，或难以实现对这些隐匿状态的高分辨率原子级研究。溶液态核磁共振（NMR）波谱技术结合了两方面的优势：既可针对单个原子核进行检测，又提供了丰富的实验工具箱，可用于研究跨越全时间尺度的动力学过程8。RD NMR实验可探测中间时间尺度上的构象交换，该过程中可预期发生碱基配对模式的变化以及局部结构的重排5,9,10,11,12,13,14。RD实验通常以长R2测量形式进行，采用Carr-Purcell-Meiboom-Gill脉冲序列15，或以旋转坐标系中的弛豫测量形式进行，即R1ρ RD实验16。
尽管两者均可用于提取激发态的布居数、交换速率和化学位移差异，但 R1ρ 弛豫色散（RD）实验还能提供激发态化学位移差异的符号信息。这使得可以推断二级结构，而二级结构与RNA结构中的化学位移密切相关17。化学位移在芳香族碱基质子和碳原子上是螺旋性的良好指标，在亚氨基质子上可指示碱基配对伙伴，在C4'和C1'原子上可反映糖环的构象18,19。需要注意的是，最近发表了一种使用更高自旋锁（SL）功率的化学交换饱和转移（CEST）实验，通过提高SL功率将CEST实验的应用范围扩展到更快的交换时间尺度，可作为仅存在一个激发态体系中R1ρ RD实验的替代方法。
尽管13C和15N同位素常被用于研究结构交换，本实验室近期的研究工作则采用芳香族和亚氨基质子作为构象交换的探针9,10。以1H作为观测核具有多项优势，例如可检测更快和更慢时间尺度上的交换过程、更高的灵敏度以及更短的测量时间。SELective Optimized Proton Experiment（SELOPE，选择性优化质子实验）方法进一步促进了这一技术的发展，该方法利用同核标量耦合对一维（1D）谱图进行去拥挤处理，从而获得芳香族质子信号，而无需依赖异核磁化转移，也无需使用同位素标记20。本实验方案适用于均匀标记13C/15N的样品以及未标记样品的1H R1ρ 弛豫色散（RD）实验测量。因此，本文介绍了一种被证明在不同样品制备需求下均具有高度通用性的样品制备方法21，并在文章最后一节讨论了其他可选方案（图1）。
此时，读者应注意，其他样本制备技术也可接受 1H R1ρ RD实验，并且使用所述技术合成的样品还可用于其他结构与功能分析方法。 1H R1ρ RD实验需要高浓度的RNA（理想情况下 &gt;1 mM）以及在RNA长度和结构构象上的高度均一性，以确保对分子动力学进行可靠表征。 体外 体外转录（IVT）是许多研究人员用于生产RNA的首选方法 13C/15由于标记的核苷三磷酸（NTPs）易于获得，并可在酶促反应中高效掺入，因此可制备含N标记的RNA样本22然而，广泛使用的T7 RNA聚合酶（T7RNAP）23,24,25 在某些起始序列情况下，存在5'端均一性低的问题26,27 并且在转录终止时通常还具有3'端均一性28目标RNA物种的纯化因需要大量（约200 nmol）而变得更加昂贵且耗时。此处所采用的方法此前已有报道，其优势已在先前研究中被广泛讨论。21简而言之，它通过转录出一个更长的串联转录本，随后由特定位点的酶对其进行特异性切割，从而解决上述问题。 大肠杆菌 由嵌合寡核苷酸引导的RNase H29,30 （参见 图2 详情请参见）。
在串联转录本的5'和3'末端引入间隔序列，可分别实现高效起始序列的使用以及去除靠近质粒模板线性化位点的末端突出部分（图 2B该方法被证明可显著提高产量，同时降低成本和劳动强度，但需要更复杂的模板合成，并额外使用一种酶和寡核苷酸。由于RNase H切割具有高特异性，且在相似大小范围内不存在其他RNA分子，因此有利于纯化。本方案采用本实验室近期发表的离子交换高效液相色谱（HPLC）步骤31，尽管其他方法也可作为替代方案。 1H R1ρ RD 通常可通过两种相应的脉冲序列在标记或未标记的样品上获得，即“标记” 1H R1ρ 基于异核单量子相干（HSQC）的实验 13C 间接维10 以及 “未标记” 1H R1ρ 基于SELOPE的实验 1H 间接维20.
这两种二维（2D）实验可作为初步检测手段，无论样品中是否存在 R1ρ 时间尺度上的动力学过程。通过这些实验可以获得谱图中所有可分辨峰的弛豫色散（RD）概览，并识别出适合进行更深入RD分析的目标峰。这意味着即使在尚未决定制备成本更高的同位素标记样品之前，也可先对未标记样品进行检测。一旦选定具有构象交换贡献的峰需进一步深入研究，最好转而采用上述实验的一维（1D）版本（前提是该峰仍可分辨），以开展所谓的离共振实验。对于标记样品，HSQC中向13C的转移步骤将被替换为选择性异核交叉极化（HCP）步骤，该步骤与13C R1ρ实验中所用方法相同32,33,34,35；而对于SELOPE实验，则直接以一维方式运行，这对于原本就位于二维谱对角线上的H8和H2信号尤其有用。在同时拥有标记与未标记样品的情况下，选择使用哪种序列的一个判断标准是：目标峰在这两种实验中的分离程度如何。
通常建议将 SELOPE 实验用于长度不超过 50 个核苷酸的 RNA 样品。对于更大的 RNA 分子，信号重叠会更严重；然而，结构上具有重要意义的核苷酸通常出现在化学位移区域中重叠较少的区域，因此即使在更大的 RNA 中仍可能被检测到。另一个考虑因素是，在未标记的样品中，1H 与 12C 之间不会发生 J-耦合。然而，由于标记实验中去耦所需的最低自旋锁定功率约为 1 kHz，因此在未标记实验中可以使用更宽范围的自旋锁定（SL）强度，从而探测更广时间尺度上的化学交换过程。这些离共振实验可提供除 kex 之外的额外信息，例如激发态（替代构象）的布居数 pES，以及非常有价值的化学位移差 Δω（基态与激发态之间的化学位移差异）。
<img alt="RNA construct workflow; steps in plasmid prep, IVT, HPLC, NMR folding, R1p screening (diagram)." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62470/62470fig1v2.jpg" data-altupdatedat="1762425657000" data-alt="Figure 1"> 
图1：本方案的工作流程。 大规模样本制备前的准备工作，包括模板制备及成功结果的确认 体外 转录与RNase H切割。大规模制备，包括HPLC纯化、NMR管填充及RNA折叠确认。若进行同位素标记合成，应在同一天使用未标记样品进行纯化，以优化梯度条件。通过NMR表征构象动态 R1ρ 实验。每个步骤均可独立进行， 例如， 这些 1H R1ρ RD分析可应用于通过其他方法制备的任何合适RNA样本。缩写：IVT = 体外 转录；HPLC = 高效液相色谱；NMR = 核磁共振；RD = 驰豫弥散 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62470/62470fig1v2large.jpg" target="_blank">请点击此处以查看此图的放大版本。</a>
本实验方案旨在提供利用1H R1ρ弛豫色散技术研究RNA发夹分子构象动力学的实用细节与关键参数。首先详细介绍了靶标RNA的设计、合成以及离子交换HPLC纯化流程，该流程可使用全部、部分或完全未标记的NTPs进行13C/15N标记。随后描述了完成NMR样品制备及通过核磁共振波谱确认构象交换的完整工作流程。最后，详细说明了在Bruker NMR波谱仪上设置1H R1ρ弛豫色散实验的步骤（图1）。本方案列出了为标记样品设置一维实验的每一步操作，并提供了附加说明和一个用于调整SELOPE版本设置的表格（表2）。在方案之后，还讨论了样品制备和1H R1ρ弛豫色散实验设置中的关键步骤以及可选替代方案。

<table><tbody><tr><td>40% 丙烯酰胺/双丙烯酰胺溶液</td><td>&amp;nbsp;Bio-Rad</td><td>&amp;nbsp;161-0144</td><td></td></tr><tr><td>5-alpha 感受态&amp;nbsp;&lt;em&gt;E. coli&lt;/em&gt;</td><td>NEB</td><td>C2987I</td><td></td></tr><tr><td>乙酸</td><td>&amp;nbsp;Sigma-Aldrich</td><td>49199</td><td></td></tr><tr><td>乙腈</td><td>&amp;nbsp;Sigma-Aldrich</td><td>34851</td><td></td></tr><tr><td>AFC-3000 HPLC 馏分收集器&amp;nbsp;</td><td>Thermo Scientific</td><td>5702.1</td><td></td></tr><tr><td>琼脂糖</td><td>&amp;nbsp;Sigma-Aldrich</td><td>&amp;nbsp;A9414</td><td></td></tr><tr><td>Amersham ImageQuant 800 UV</td><td>GE Healthcare</td><td>29399482</td><td>替代 LAS-4000 或同等产品</td></tr><tr><td>Amicon 超滤离心滤器</td><td>&amp;nbsp;Sigma-Aldrich</td><td>&amp;nbsp;UFC900324</td><td></td></tr><tr><td>过硫酸铵</td><td>&amp;nbsp;Sigma-Aldrich</td><td>&amp;nbsp;A3678</td><td></td></tr><tr><td>氨苄青霉素</td><td>&amp;nbsp;Sigma-Aldrich</td><td>&amp;nbsp;A9518</td><td></td></tr><tr><td>ATP</td><td>&amp;nbsp;Sigma-Aldrich</td><td>&amp;nbsp;A2383</td><td></td></tr><tr><td>ATP-13C10/15N5</td><td>&amp;nbsp;Sigma-Aldrich</td><td>645702</td><td></td></tr><tr><td>BamHI 限制性内切酶</td><td>NEB</td><td>&amp;nbsp;R0136L</td><td></td></tr><tr><td>瓶顶滤器&amp;nbsp;</td><td>VWR&amp;nbsp;</td><td>514-1019</td><td></td></tr><tr><td>溴酚蓝</td><td>&amp;nbsp;Sigma-Aldrich</td><td>1081220005</td><td></td></tr><tr><td>切割向导</td><td>IDT</td><td>N/A</td><td>或同等产品</td></tr><tr><td>CTP</td><td>&amp;nbsp;Sigma-Aldrich</td><td>&amp;nbsp;C1506</td><td></td></tr><tr><td>CTP-13C10/15N5</td><td>&amp;nbsp;Sigma-Aldrich</td><td>645699</td><td></td></tr><tr><td>D2O</td><td>&amp;nbsp;Sigma-Aldrich</td><td>151882</td><td></td></tr><tr><td>Dionex Ultimate 3000 UHPLC 系统&amp;nbsp;</td><td>Thermo Scientific</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>DL-二硫苏糖醇</td><td>&amp;nbsp;Sigma-Aldrich</td><td>43815</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>&amp;nbsp;Sigma-Aldrich</td><td>&amp;nbsp;D8418</td><td></td></tr><tr><td>DNAPac PA200 22x250 半制备柱&amp;nbsp;</td><td>Thermo Scientific</td><td>SP6734</td><td></td></tr><tr><td>DNAPac PA200 22x50 保护柱&amp;nbsp;</td><td>Thermo Scientific</td><td>SP6731</td><td></td></tr><tr><td>大肠杆菌 RNase H</td><td>&amp;nbsp;NEB</td><td>&amp;nbsp;M0297L</td><td>&amp;nbsp;或实验室自制，UniProt 参考号 P0A7Y4&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>EDTA</td><td>&amp;nbsp;Sigma-Aldrich</td><td>&amp;nbsp;E6758</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf 离心机，转子：A-4-44</td><td>Eppendorf&amp;nbsp;</td><td>5804R</td><td></td></tr><tr><td>95% 乙醇</td><td>&amp;nbsp;Fisher scientific</td><td>11574139</td><td></td></tr><tr><td>95% 变性乙醇</td><td>&amp;nbsp;VWR</td><td>85829.29</td><td></td></tr><tr><td>甲酰胺</td><td>&amp;nbsp;Sigma-Aldrich</td><td>47671</td><td></td></tr><tr><td>GelRed</td><td>&amp;nbsp;VWR</td><td>41003</td><td></td></tr><tr><td>GeneRuler 1kbp Plus</td><td>&amp;nbsp;Fisher Scientific</td><td>&amp;nbsp;SM1333</td><td>可选</td></tr><tr><td>GMP</td><td>&amp;nbsp;Sigma-Aldrich</td><td>&amp;nbsp;G8377</td><td></td></tr><tr><td>GMP-13C10/15N5</td><td>&amp;nbsp;Sigma-Aldrich</td><td>650684</td><td></td></tr><tr><td>GTP</td><td>&amp;nbsp;Sigma-Aldrich</td><td>&amp;nbsp;G8877</td><td></td></tr><tr><td>GTP-13C10/15N5</td><td>&amp;nbsp;Sigma-Aldrich</td><td>645680</td><td></td></tr><tr><td>盐酸</td><td>&amp;nbsp;Sigma-Aldrich</td><td>&amp;nbsp;H1758</td><td></td></tr><tr><td>无机焦磷酸酶</td><td>&amp;nbsp;Sigma-Aldrich</td><td>&amp;nbsp;I1643-100UN</td><td>&amp;nbsp;或实验室自制，UniProt 参考号 P0A7A9</td></tr><tr><td>Invitrogen UltraPure 10X TBE 缓冲液</td><td>&amp;nbsp;Sigma-Aldrich</td><td>&amp;nbsp;T4415</td><td></td></tr><tr><td>Julabo TW8 水浴锅&amp;nbsp;</td><td>VWR</td><td>461-3117</td><td></td></tr><tr><td>kuroGEL Midi 13 水平凝胶电泳仪</td><td>VWR</td><td>700-0056</td><td>或同类产品</td></tr><tr><td>LB 肉汤（Lennox）</td><td>&amp;nbsp;Sigma-Aldrich</td><td>&amp;nbsp;L3022</td><td></td></tr><tr><td>含琼脂的 LB 肉汤（Lennox）</td><td>&amp;nbsp;Sigma-Aldrich</td><td>&amp;nbsp;L2897</td><td></td></tr><tr><td>低分子量 ssRNA 标记物&amp;nbsp;</td><td>NEB</td><td>&amp;nbsp;N0364S</td><td>可选</td></tr><tr><td>LPG-3400RS 泵&amp;nbsp;</td><td>Thermo Scientific</td><td>5040.0036</td><td></td></tr><tr><td>六水合氯化镁</td><td>&amp;nbsp;Sigma-Aldrich</td><td>63068</td><td></td></tr><tr><td>microRNA 标记物&amp;nbsp;</td><td>NEB</td><td>N2102S</td><td></td></tr><tr><td>微波炉</td><td>&amp;nbsp;Samsung</td><td>&amp;nbsp;MS23F301EAW</td><td></td></tr><tr><td>Mini-PROTEAN 电泳设备</td><td>&amp;nbsp;Bio-Rad</td><td>1658004</td><td></td></tr><tr><td>NucleoBond Xtra Maxi</td><td>&amp;nbsp;Machinery-Nagel</td><td>&amp;nbsp;740414.10M</td><td></td></tr><tr><td>含有串联插入片段的 pUC19 质粒</td><td>&amp;nbsp;Genscript</td><td>&amp;nbsp;N/A</td><td>或同等产品</td></tr><tr><td>RNaseZAP</td><td>&amp;nbsp;Sigma-Aldrich</td><td>&amp;nbsp;R2020</td><td></td></tr><tr><td>5 mm Shigemi 管&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z529427</td><td></td></tr><tr><td>一次性注射器，鲁尔锁头</td><td>VWR</td><td>613-2008</td><td></td></tr><tr><td>乙酸钠</td><td>&amp;nbsp;Sigma-Aldrich</td><td>&amp;nbsp;S2889</td><td></td></tr><tr><td>氯化钠</td><td>&amp;nbsp;Sigma-Aldrich</td><td>&amp;nbsp;730-1470</td><td></td></tr><tr><td>高氯酸钠</td><td>&amp;nbsp;Sigma-Aldrich</td><td>71853</td><td></td></tr><tr><td>磷酸氢二钠</td><td>&amp;nbsp;Sigma-Aldrich</td><td>&amp;nbsp;S3264</td><td></td></tr><tr><td>磷酸二氢钠</td><td>&amp;nbsp;Sigma-Aldrich</td><td>&amp;nbsp;S3139</td><td></td></tr><tr><td>三盐酸亚精胺</td><td>&amp;nbsp;Sigma-Aldrich</td><td>85578</td><td></td></tr><tr><td>SYBR Gold</td><td>&amp;nbsp;ThermoFisher</td><td>&amp;nbsp;S11494</td><td></td></tr><tr><td>注射器滤器</td><td>VWR</td><td>514-0061</td><td></td></tr><tr><td>T7 RNA 聚合酶</td><td>&amp;nbsp;Sigma-Aldrich</td><td>10881767001</td><td>&amp;nbsp;或实验室自制，UniProt 参考号 P00573</td></tr><tr><td>TCC-3000RS 柱温箱&amp;nbsp;</td><td>Thermo Scientific</td><td>5730</td><td></td></tr><tr><td>四甲基乙二胺</td><td>&amp;nbsp;Sigma-Aldrich</td><td>T9281</td><td></td></tr><tr><td>Tris 碱</td><td>&amp;nbsp;Fisher Scientific</td><td>10103203</td><td></td></tr><tr><td>UMP</td><td>&amp;nbsp;Sigma-Aldrich</td><td>U6375</td><td></td></tr><tr><td>UMP-13C9/15N2&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>651370</td><td></td></tr><tr><td>尿素</td><td>&amp;nbsp;Sigma-Aldrich</td><td>U5378</td><td></td></tr><tr><td>UTP</td><td>&amp;nbsp;Sigma-Aldrich</td><td>U6625</td><td></td></tr><tr><td>UTP-13C10/15N5</td><td>&amp;nbsp;Sigma-Aldrich</td><td>645672</td><td></td></tr><tr><td>VWD-3100 检测器&amp;nbsp;</td><td>Thermo Scientific</td><td>5074.0005</td><td></td></tr></tbody></table>

rna 的 1h r1ρ 弛豫色散实验的样品制备与设置实用要点

Practical Aspects of Sample Preparation and Setup of 1H R1&#961; Relaxation Dispersion Experiments of RNA

RNA 是一种高度灵活的生物大分子，其结构变化在 RNA 分子作为细胞信使和调控因子所执行的功能中起着关键作用。尽管这些动态状态对大多数结构研究方法而言难以观测，但 R1ρ 弛豫色散（RD）波谱技术能够在微秒至毫秒时间尺度上以原子分辨率研究构象动力学。1H 作为观测核的使用进一步拓展了可覆盖的时间范围，并可直接获取氢键和碱基配对信息。
此类研究中的难点在于高纯度和高产率的样品制备，样品可能需要进行13C和15N标记，以及实验的设置和数据拟合，以提取此前不可见状态的布居数、交换速率和二级结构。本方案提供了样品制备中的关键实操步骤，以确保获得合适的RNA样品，并对同位素标记和未标记的RNA样品进行1H R1ρ实验的设置。

RNA合成方案通过生成高纯度转录本，实现了高效的纯化。图3A展示了多个串联转录本的切割反应结果，包括成功与失败的反应实例。泳道1显示了最佳情况，即转录本完全切割，仅残留微量副产物。泳道2a显示切割不完全，可通过重新退火并添加更多RNase H来解决（泳道2b，步骤2.1.2）。泳道1、2a和2b中的RNA构建体相同。泳道3的样品显示切割失败。对此反应的故障排查应包括检查切割引导序列、DNA模板纯度以及退火温度。在某些情况下，RNase H切割可能需要在T7体外转录（IVT）之后进行，如样品2所示。
第4泳道的样品显示出大量切割副产物，这些副产物通过离子交换HPLC难以去除。对此类样品进行故障排除时，可采取以下措施：(a) 降低反应温度、RNase H用量或反应时间；(b) 减小洗脱梯度和进样体积，尝试将目标组分与副产物分离。Karlsson 等人已讨论了如何提高离子交换HPLC纯化分辨率的更多细节31。HPLC可将目标RNA与较长或较短的核酸以及蛋白质或小分子污染物分离开来。图3B展示了离子交换HPLC纯化的最佳结果。应选择合适的洗脱梯度，使目标RNA物种的洗脱时间至少比下一个较小物种晚一个柱体积（本例中为35 mL），并比下一个较大物种早一个柱体积。
本方法中的较小组分包括单核苷酸、截短产物（8-12 nt）、3' 和 5' 间隔序列（5-14 nt）以及切割引导序列（12 nt 杂合核酸），而较长的序列则可能为未切割的串联重复序列和质粒。当获得分离良好的洗脱峰时，纯化规模可扩大至每次进样相当于约 20 mL 的体外转录（IVT）反应产物。RNA 样品的正确折叠对 RD 实验至关重要，每次测量前均需确认其折叠状态。图 4 展示了在应用步骤 2.4 的折叠程序之前（蓝色）和正确折叠完成后（红色）的 A 标记 22-mer RNA 结果。Mc-Fold 二级结构预测（图 4C）表明该发夹结构包含 4 个碱基对，可产生 5 个亚氨基信号。
两张光谱图均显示 图 4A 验证这些预测信号，尽管相对强度略有不同，这表明某些错误折叠结构（此处为二聚体）仅通过该方法评估可能存在困难 1H 1D 谱。芳香族 1H,13C-HSQC 谱（图4B），但显示折叠程序前样品（蓝色）仅有3个芳香信号，而按步骤2.4折叠后的样品（红色）则显示出全部4个信号。蓝色样品可能形成了同源二聚体（结构推测如 图4D）会产生与发夹结构相同的亚氨基信号。A13H2的信号似乎因交换而变宽。这些结果有助于强调在每次RD实验前，通过亚氨基和芳香区指纹图谱实验来确认折叠构象的重要性。 1H R1ρ 本方案中描述的脉冲序列可用于检测中间交换态下的动力学过程。首先记录一个在共振状态下的曲线，如果特定残基存在动力学过程，则在获得的数据中可观察到弥散现象 R2+REX 数值，而无交换的残基则呈现平坦的曲线。
图5 显示了在合成RNA发夹结构中针对两个不同H8原子获得的代表性共振曲线（图 5A），其中 G6H8 发生交换（图 5C），而A4H8则不会图5B）。由于该样品中的交换速率相对较慢（kEX = 292 ± 40 Hz）时，利用SELOPE实验实现低射频场强度的优势，采用该脉冲序列的一维版本记录了两条在共振条件下的曲线。随后使用相同的脉冲序列获取在共振谱图中显示色散的残基在非共振条件下的数据。 图5D 显示所获得的 R1ρ 数值 与 偏移，其中曲线的轻微不对称性已指示出符号 Δω.
在去除 R1 贡献的 R2+REX 图中（图5E），这一现象更加明显。同一图的右列展示了在交换速率较快的另一种合成RNA发夹结构中，两个不同的H8原子所获得的代表性共振内曲线：其中G6H8经历交换（图5G），而A4H8则未发生交换（图5F）。由于交换速率较快（kEX = 43,502 ± 38,478 Hz），可利用SELOPE二维版本同时记录所有芳香族质子的弛豫色散（RD）数据，以获取共振内和共振外数据（G6H8数据展示于图5H,I）。
阳性与阴性结果的通用判定标准 
串联体外转录（IVT）和RNase H切割反应中的阳性结果可依据以下特征进行判断：1）目标条带为变性PAGE凝胶中最明显的条带。2）主条带周围无条带或仅有微弱条带。3）无或仅有微弱的高分子量条带。4）HPLC色谱图显示目标RNA具有良好的分离峰。5）当收集主峰组分时，在变性PAGE凝胶上仅出现单一清晰条带。
串联IVT和RNase H切割出现阴性结果的表现如下：1）在变性PAGE凝胶上无主条带或仅有微弱的主条带可见；2）可见来自RNA串联重复序列的高分子量条带模式；3）尽管存在主条带，但在主条带上下±3 nt范围内出现强度相近的其他条带。
一个正确折叠的样品可通过以下方式识别：1）观察到的亚氨基质子数目与根据二级结构模拟所预期的亚氨基质子数目相符（例如，Mc-Fold39, 图 4A）。2）若存在，UUCG环中的顺式G-U摆动碱基对在约9.5 ppm处可见，有时仅在较低温度下可见。Fürtig及其同事已描述了对UUCG环的进一步指纹特征分析。403) 芳香族指纹图谱与先前已确认正确折叠的样品相符图4C).
可通过以下方式识别错误折叠或降解的样品：1）亚氨基信号数量多于二级结构模拟预测的结果（注意：亚氨基信号较少并不一定意味着错误折叠，因为末端碱基对通常不可见，且构象交换会导致谱线展宽）。2）缺乏亚氨基信号。3）芳香区出现高强度窄峰，提示存在单核苷酸降解产物。4）亚氨基或芳香区信号与已确认正确折叠的参考样品之间存在差异（图4C）。
在可检测的时间尺度内不发生交换的原子可按如下方式识别：1）通过一条平坦的弛豫色散（RD）曲线（由于缺乏随施加的自旋锁（SL）功率变化的 REX 贡献）（图5B 和 图5F）。2）当交换速率 kEX 与化学位移差 Δω 量级相当时，属于慢-中等交换情形，需特别注意。在此情况下，共振条件下的贡献可能非常小，如 图5C 所示（本例中拟合参数为 kEX = 292 ± 40 Hz 和 Δω = 112 ± 4 Hz）。若有疑问，可记录一条低功率、离共振的SL曲线以进行验证。
在中间时间尺度上发生交换的原子可通过以下方式识别：1）在共振RD实验中呈现非平坦的弛豫色散曲线（图5B 和 图5F）；2）在HSQC或SELOPE实验中谱线宽度更宽也可能提示存在交换。
为非共振曲线选择合适的SL功率值（图5E，F）：1）具有显著的 kEX 共振曲线中的贡献（所选的SL功率值已在图中标明） 图5C 和 图 5G2) 由于需针对至少3个饱和脉冲（SL）功率值测量偏共振曲线，所选的SL功率值应在共振曲线的相应区域内合理分布。 kEX 贡献。3）导致非平面 R2+REX 拉盖尔拟合后的曲线（例如, 图 5D：SL 强度为 25、50 和 75 Hz； 图5E).  
为非共振曲线选择不合适的SL功率值（图5E、F）会导致拉盖尔拟合后的R2+REX曲线呈平坦状。如图5E所示，100 Hz的非共振曲线非常平坦，因此无法提供关于Δω的显著信息。
旋转坐标系核Overhauser效应（ROE）伪影的判断依据：1）从离共振曲线获得的Δω值与空间邻近质子的化学位移一致，或与在核Overhauser效应谱（NOESY）中与目标峰出现交叉峰的质子化学位移一致。（例如，图5I显示了符合快速至中等交换特征的宽泛离共振曲线，但曲线中也存在更尖锐的特征峰，例如在-3000 Hz和+1500 Hz处。这些信号极有可能源于ROE伪影，而非该H8在不同构象体中的化学位移）。2）Laguerre拟合虽可进行，但在共振峰及至少3条离共振曲线上的拟合效果不佳（产生高误差或物理上不可能的数值），即使这些指数衰减数据来自信噪比高（&gt;20）的实验（例如，kEX = 43,502 ± 38,478 Hz）。通常每条自旋锁（SL）曲线可单独良好拟合，但联合拟合时误差显著升高；而真实的激发态应表现出相反的行为。
“真实”交换的指征 Δω：1) 由非共振曲线获得的 Δω 与空间邻近质子的化学位移不一致，或与 NOESY 谱中与目标峰存在交叉峰的质子化学位移不一致（例如，图5E）。2) 拉盖尔拟合在共振曲线以及至少三条非共振曲线上均给出较低的误差（例如，图5E 对比 图5I，拟合结果见图注）。
<img alt="RNA分析和切割模式的电泳结果与色谱图。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62470/62470fig3v5.jpg" data-altupdatedat="1762425657000" data-alt="图3"> 
图3：通过T7串联体外转录（IVT）和RNase H切割反应制备样品。（A）串联IVT和RNase H切割反应的阳性与阴性结果的变性PAGE电泳图。Ladder高度代表RNA参照物，12*代表嵌合切割引导链。泳道1：成功生成了20 nt的目标RNA，仅有少量较短和较长的副产物。泳道2a：串联转录本切割不完全。尽管可通过HPLC纯化，但会浪费大量材料。泳道2b：对泳道2a继续进行RNase H切割，可获得干净的样品，可直接用于HPLC上样（与泳道1相同）。泳道4：RNase H切割基本失败，未产生目标条带，全长串联转录本在600 nt处仍清晰可见。泳道5：产生了目标条带，但存在明显的-1条带。虽然可进行HPLC纯化，但必须仔细去除副产物。（B）成功的HPLC上样示例。38分钟处的峰包含目标长度的纯净RNA，而较长和较短的产物与目标RNA实现了良好分离。图B经21修改。缩写：IVT = in vitro transcription（体外转录）；HPLC = high-performance liquid chromatography（高效液相色谱）；nt = nucleotides（核苷酸）；AU = arbitrary units（任意单位）。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62470/62470fig3v2large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="折叠前（蓝色）和折叠后（红色）的RNA结构的核磁共振谱图和序列示意图；分析图表。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62470/62470fig4v2.jpg" data-altupdatedat="1762425657000" data-alt="图4"> 
图4：RNA发夹结构在折叠步骤2.4（见实验方案）前（蓝色）和后（红色）的核磁共振（NMR）示例。（A）A标记的22-mer RNA的1H-1D谱图中的亚氨基区域。下方灰色区域标示了亚氨基信号对应的碱基配对预期位置。（B）来自A图RNA的芳香族共振1H,13C-HSQC谱图。折叠后的样品（红色）显示出预期的4个信号，而折叠前的样品（蓝色）仅显示3个信号。（C）Mc-Fold对22-mer RNA形成发夹结构的预测。该二级结构应产生五个亚氨基信号，在A图的两个样品中均可观察到。（D）由22-mer RNA形成的同源二聚体的拟议结构，其形成与发夹结构相同的五个碱基对。缩写：NMR = nuclear magnetic resonance（核磁共振）；1D = one-dimensional（一维）；HSQC = heteronuclear single quantum correlation（异核单量子相关）；ppm = parts per million（百万分之一）。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62470/62470fig4v2large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>
<img alt="RNA 动力学 SL 强度和偏移图；在共振/离共振分析，NMR 波谱数据。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62470/62470fig5v2.jpg" data-altupdatedat="1762425657000" data-alt="图 5"> 
图 5：1H R1ρ RD 在基于 RNA 发夹结构的两种不同构建体上的代表性结果。(A) 左列为在凸起 U 上方含有 C-G 碱基对的 RNA 上获得的结果，右列为在将该碱基对替换为 G-C 的样品上获得的结果。(B) 和 (F) 显示了 A4H8 在两种构建体上获得的平坦色散曲线，表明无构象交换。(C–E) 显示了在 (G-C) 构建体中 G6 的在共振、离共振及拟合数据。Laguerre 拟合得到以下结果：R1 = 2.87 ± 0.01 Hz，R2 = 7.76 ± 0.03 Hz，kEX = 292 ± 40 Hz，pES = 0.31 ± 0.03 %，Δω = 112 ± 4 Hz。(G–I) 显示了在 (G-C) 构建体中 G6 的在共振、离共振及拟合数据。Laguerre 拟合得到以下结果：R1 = 1.93 ± 0.02 Hz，R2 = 6.71 ± 0.86 Hz，kEX = 43,502 ± 38,478 Hz，pES = 27 ± 16 %，Δω = 203 ± 166 Hz。本图改编自 20。缩写：SL = 自旋锁定。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62470/62470fig5v2large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>

我们介绍了一种利用1H R1ρ弛豫色散核磁共振（NMR）光谱法测定13C/15N标记及未标记RNA上微秒至毫秒动力学过程的实验方案。本方案的重点在于高纯度样品的制备以及NMR实验的设置。

RNA 的 1H R1ρ 弛豫色散实验的样品制备与设置实用要点

RNA 是一种高度灵活的生物大分子，其结构变化在 RNA 分子作为细胞信使所执行的功能中起着至关重要的作用……

本方案描述了用于质子R1rho弛豫色散测量的RNA样品制备和核磁共振（NMR）设置，以研究RNA分子中的构象交换。由于检测对象为质子，该方法无需同位素标记，可直接获取碱基配对偏移等结构特征。该流程具有较强的模块化特性，即使样品采用其他方法制备，仍可进行R1rho弛豫色散测量。首先，按照文稿中的描述准备质粒样品，并设置体外转录和切割反应。将反应体系在37摄氏度下孵育1小时。然后，取1微升样品，用上样溶液稀释10倍。取一微升样品在变性PAGE凝胶上进行电泳。如果切割反应成功，将反应体系放大至所需体积并过夜运行。然后再次进行变性PAGE凝胶电泳，以评估切割反应是否已完成。若切割不完全，将反应液置于普通微波炉中，以450瓦加热15秒。随后将溶液缓慢冷却至37摄氏度，持续40分钟，以使RNA与切割向导重新退火。注意观察是否有新的沉淀物形成。加入更多的无机焦磷酸酶和RNase H。在37摄氏度下孵育反应1至3小时。然后通过变性PAGE确认切割反应的完成情况。当RNase H切割反应完成后，加入EDTA至终浓度为50毫摩尔，以终止反应。充分涡旋混匀。通过0.2微米注射器滤膜过滤溶液。将溶液浓缩至可注入HPLC系统进行纯化的体积。在将浓缩和纯化的样品加入核磁共振管之前，先用大量水冲洗以清洗管子，随后依次使用RNase去污染试剂、水和95%乙醇冲洗。最后一次用水冲洗后，将其静置晾干。用水冲洗推杆，然后使用无绒擦拭布蘸取RNase去污染试剂和95%乙醇进行清洁。待NMR管和推杆干燥后，向NMR样品中加入10%D2O。使用大口径移液枪头将RNA样品沿管壁缓缓转移至NMR管中。通过快速旋转下压的方式将活塞插入管中，以排除气泡，然后缓慢向上拉动活塞，避免产生新的气泡。用石蜡膜固定。基于用于全标记RNA样品的RNA归属分析的芳香族质子-碳HSQC数据集创建一个新的数据集。设置通用参数和RD特异性参数。然后将质子自旋锁功率设为1.2千赫兹进行测试。生成仅包含一个条目（0毫秒）的测试vd列表，将TDF1设为1，并更新D30以运行测试谱。设置测试的 vd 列表后，更新 D30 和 TDF1，并绘制不同自旋锁长度下峰强度的变化图。确定原始峰强度降至三分之一时所对应的自旋锁长度。根据测试运行的结果，创建实验中将使用的最终 vd 列表。选择扫描次数，使得列表中最弱峰的信噪比至少为 10。此处展示了多个串联转录本切割反应的结果。在成功反应中生成了20个核苷酸的目标RNA。失败的反应导致样品切割不完全或失败。RNA样品的HPLC进样在38分钟时显示出纯目标RNA的峰。尽管较长和较短的产物与目标峰分离良好。对RNA发夹结构的分析显示，观测到的亚氨基质子数目与二级结构模拟所预期的亚氨基质子数目一致。RNA芳香族共振的质子-碳HSQC谱在折叠后显示出四个信号。折叠前仅有三个信号。在针对两个不同H8原子和两个不同合成RNA发夹结构获得的代表性共振曲线中，G6H8存在构象交换，而A4H8则不存在。对于G6H8，选择了着色的自旋锁定功率并记录了离共振数据。在交换较慢的CG构建体中，R1rho行值随偏移量变化的曲线已显示出轻微的不对称性，表明化学位移差delta omega的符号。在去除R1贡献的R2加REX图中，这一现象更加明显。另一方面，GC结构表现出更快的交换，其R1rho值随偏移量变化的曲线呈现更宽的峰形，即使在R2加REX图谱中，delta omega的提取也变得不那么明显。一旦揭示了RNA的动力学特性，便可对这些状态进行表征并加以捕获。这些被捕获的状态例如可用于生物学实验检测。该方法可使我们观察到活性microRNA（miRNA）复合物中具有功能意义的碱基配对变化、核糖体RNA中的环区重排，以及单核苷酸凸起结构的碱基对稳定性。

practical-aspects-sample-preparation-setup-1h-r1-relaxation

Research

科研

JoVE Journal

Biochemistry

生物化学

1H R1 + RNA 放松分散实验样品制备和设置的实用方面

本视频介绍了利用核磁共振波谱技术研究15N标记的野生型和突变型envoplakin蛋白与未标记的vimentin蛋白之间相互作用的方法。野生型envoplakin与vimentin成功相互作用会导致核磁共振谱图中谱线显著展宽和信号峰消失；而突变型envoplakin与vimentin之间缺乏相互作用，则在核磁共振谱图中呈现分辨良好的信号峰。...

利用核磁共振研究原子水平的蛋白质-蛋白质相互作用

高通量选择性2'羟基酰化结合引物延伸分析（SHAPE）利用一种新型化学探针技术，结合逆转录、毛细管电泳和二级结构预测软件，以单核苷酸分辨率测定长度从数百到数千个核苷酸的RNA结构。...

利用高通量SHAPE进行RNA二级结构预测

RNA聚合酶II合成的前体RNA会延伸至成熟mRNA的3'末端之外。成熟RNA的末端在转录过程中由RNA序列决定的位置通过切割复合物的核酸内切酶活性生成。本文详细描述了研究切割反应的方法 体外.

无细胞系统中RNA加工反应的分析：前体mRNA底物的3'端切割 体外

本文介绍了一种分析RNA/蛋白质相互作用的实验方案。电泳迁移率变动分析（EMSA）基于RNA/蛋白质复合物与游离RNA在非变性凝胶电泳中迁移速率的差异。通过使用放射性标记的RNA探针，可利用放射自显影技术对RNA/蛋白质复合物进行可视化检测。...

研究RNA-蛋白质相互作用的电泳迁移率变动分析（EMSA）：以IRE/IRP为例

我们描述了一种利用紫外光介导的光交联和质谱技术在活细胞中鉴定RNA结合蛋白并绘制其RNA结合区域的实验方案。...

基于质谱的RNA结合区域鉴定的样品制备

本文详细介绍了在C2'位点修饰的十二聚体RNA的固相合成、纯化及表征方法O-位置。采用紫外-可见吸收光谱和圆二色光谱分析来定量并表征结构特征，...

含2'-O-苯硫甲基修饰的RNA寡聚物的固相合成方案及圆二色性表征

本文详细描述了在实验室中通过溶液核磁共振波谱法获取和分析15N弛豫色散谱的实验方案。...

15N CPMG 驰豫弥散用于研究蛋白质构象动力学的 µs-ms 时间尺度

本方案介绍了一种利用光镊研究RNA-蛋白质相互作用的完整实验流程。文中概述了多种可能的实验装置，包括光镊与共聚焦显微镜联用的设置。...

利用光镊研究翻译调控中的RNA-蛋白质相互作用

采用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（MALDI-TOF）对氧化RNA与外切核糖核酸酶Xrn-1反应产生的片段进行表征。本方案所描述的方法可应用于涉及RNA和/或DNA的其他过程。...

利用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱鉴定酶降解产生的RNA片段

核磁共振（NMR）波谱法能够以残基特异性的方式表征蛋白质的结构动力学。本文提供了一套实用的实验方案，用于采集对皮秒到纳秒时间尺度敏感的NMR 15N R1 和 R2...

NMR 15N 弛豫实验用于研究蛋白质的皮秒至纳秒级结构动力学

本方案描述了一种利用分裂型 Broccoli RNA 报告系统进行的可视化检测方法，用于检测和定量 RNA 簇中的分子间碱基配对 体外.

分子间RNA碱基配对的可视化与定量分析 体外 利用分裂型 Broccoli RNA 报告系统检测 RNA 簇

学习RNA样品制备与R1rho核磁共振实验设置，用于研究RNA构象动态交换。该方法无需同位素标记即可直接观测碱基配对变化，为微秒至毫秒时间尺度的RNA动力学提供原子级分辨率。

RNA 的 ¹H R_1ρ 弛豫色散实验的样品制备与设置实用要点

探索更多视频