Name: 使用注射器和针头模拟血液学应激对循环肿瘤细胞的影响 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-04-27T14:30:00.000+00:00
Duration: 5 min 49 s
Description: 了解使用注射器和针头系统对悬浮癌细胞施加短暂高脉冲流体剪切应力的方法。该技术模拟转移性癌细胞在循环系统中经历的血液动力学应激，用于研究机械力对癌细胞存活和生物学特性的影响。

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本模型的开发得到了美国国防部资助项目W81XWH-12-1-0163、美国国立卫生研究院资助项目R21 CA179981和R21 CA196202以及Sato转移研究基金的支持。

1. 细胞准备
<ol>
	<li>当细胞融合度达到70-90%时，按照所用细胞系的推荐方案从组织培养皿中释放细胞。
	<ol>
		<li>例如，吸除PC-3细胞的生长培养基，并用5 mL无钙、无镁的磷酸盐缓冲液（PBS）清洗10 cm培养皿中的细胞。</li>
		<li>根据生产商的操作说明，在加入1 mL 0.25%胰蛋白酶前，先吸除PBS。</li>
		<li>在倒置显微镜下观察到细胞脱落之后，加入5 mL含10%胎牛血清的DMEM:F12培养基以抑制胰蛋白酶活性。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将细胞悬液转移至锥形离心管中。</li>
	<li>测定细胞浓度及总细胞数。</li>
	<li>通过离心（300 × g，3分钟）沉淀细胞，吸除上清液，并将细胞重悬于无血清的组织培养基中，调整细胞密度至5 × 105 个细胞/mL。 
	&#8203;注意：检测培养基中必须至少含有1.17 mM Ca++，因为已有研究表明细胞外Ca++是细胞抵抗流体剪切应力（FSS）所必需的15。</li>
</ol>
2. 流体剪切应力处理
<ol>
	<li>在将细胞暴露于流体剪切应力（FSS）之前，沿14 mL聚苯乙烯圆底管的7 mL刻度线处剪断。混匀细胞悬液，取5 mL悬液加入剪断后的试管中，收集静态对照样品。 
	注意：静态样品所需的收集体积取决于所使用的活力检测方法（见步骤3）。</li>
	<li>将细胞悬液吸入一支5 mL注射器中，并连接一根30 G ½"针头。取下针帽，将注射器安装到注射泵上并固定，设定流速以达到所需的FSS水平。 
	注意：表1列出了不同针头和流速下的最大管壁剪切应力，以及根据细胞大小（10、15和20 µm）决定的最小FSS水平。使用前应检查针头是否弯曲；如有疑问，请更换新针头。针头的完整性会显著影响施加的FSS水平。</li>
	<li>启动注射泵，将剪切后的样品收集到剪断的试管中，收集时保持试管约45°倾斜，以减少起泡。根据活力检测或后续实验的需求收集适量样品。
	<ol>
		<li>小心地将注射器和针头从注射泵上取下，使用镊子将针头从注射器上取下，注意不要触碰针头。 
		注意：为提高安全性，可使用非斜面针头替代斜面针头。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将剪切后的悬液重新吸入注射器，使用镊子小心地重新安装针头，并将其放回注射泵中。</li>
	<li>重复步骤2.3和2.4，直至细胞悬液接受了预定次数的FSS脉冲刺激。 
	&#8203;注意：为评估细胞抵抗FSS机械破坏的能力，通常对细胞悬液施加10次FSS脉冲。然而已有研究表明，细胞在经历2次FSS脉冲后即开始发生生物学适应24。</li>
</ol>
3. 活性测定
注意：细胞活力可通过酶学检测法（如荧光素酶、刃天青和WST-1）、计数完整细胞、流式细胞术或克隆形成实验进行评估。
<ol>
	<li>在进行细胞FSS暴露前，应采集样本以进行各项活力检测。
	<ol>
		<li>进行酶学检测时，取两份100 µL等分试样，加入96孔板中。</li>
		<li>进行流式细胞术时，取一份500 µL等分试样，放入1.5 mL离心管中。</li>
		<li>进行克隆形成实验时，收集100 µL等份试样。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>酶活性测定
	<ol>
		<li>在施加1、2、4、6、8和10次FSS暴露后，分别收集100 µL样品，并置于96孔板中。</li>
		<li>加入所需的底物，并按照所用检测方法的方案进行操作：
		<ol>
			<li>对于刃天青，向每个孔中加入20 µL浓度为0.15 mg/mL的溶液。向仅含100 µL培养基的孔中加入20 µL浓度为0.15 mg/mL的刃天青溶液。在37 °C组织培养孵育箱中孵育2小时。使用能够检测荧光的酶标仪测定吸光度（激发波长579，发射波长584）。</li>
			<li>对于表达荧光素酶的细胞，将100 µL 15 mg/mL的D-荧光素加入5 mL培养基中。向每孔含细胞的培养孔中加入100 µL该溶液。孵育5分钟后，使用支持化学发光检测的酶标仪读取结果。</li>
			<li>对于WST-1，向每个孔中加入10 µL WST-1，包括仅含培养基的孔。孵育4小时后，使用酶标仪在420至480 nm波长范围内测定吸光度。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>将每个经FSS处理的样本的平均信号与静态对照样本的平均信号进行比较，以获得活细胞百分比。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>流式细胞术24
	<ol>
		<li>在施加1、2、5和10次FSS脉冲后，分别收集500 µL样品并置于1.5 mL离心管中。</li>
		<li>离心样品（500 × g 3 分钟后，弃去上清液。</li>
		<li>用1 mL无钙、无镁的PBS重悬沉淀，然后离心样品（300 × g 3 分钟）。</li>
		<li>将沉淀物用500 µL荧光激活细胞分选（FACS）缓冲液（含0.5%牛血清白蛋白和0.1%叠氮化钠的PBS）重悬&#160;叠氮化物）与计数微球及膜不渗透性或活死染料（如碘化丙啶（1.75 µg/mL））共同孵育。</li>
		<li>通过比较剪切样品与静态样品中经计数微球归一化的活细胞比例，确定细胞活力。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>克隆形成实验
	<ol>
		<li>取100 µL静态样品，加入900 µL培养基，制成1:10稀释液。</li>
		<li>取100 µL 1:10稀释的样品，加入900 µL培养基，制成最终1:100的稀释液。</li>
		<li>将100 µL的1:100稀释样品加入含2 mL培养基的6孔板中的3个孔内。</li>
		<li>重复步骤 3.4.1–3.4.3，使用经过 10 次流体剪切应力脉冲处理的样品。</li>
		<li>让细胞在不更换培养基的情况下生长7-10天，观察克隆形成情况。当出现由≥50个细胞组成的克隆时，吸除生长培养基，每孔用1 mL磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤，吸除PBS，然后加入1 mL预冷的70%乙醇（EtOH）固定5分钟。重要的是，剪切力处理组和静态对照组应同时进行固定处理。</li>
		<li>固定样品后，吸除乙醇，加入1至2 mL结晶紫溶液（0.1%结晶紫溶于90% H2O₂，10% EtOH）中孵育5分钟。</li>
		<li>用大量水冲洗，并让平板自然晾干</li>
		<li>计数静态组和剪切组样本中的克隆（细胞数≥50的细胞簇）。通过比较剪切样本的平均克隆数与静态样本的平均克隆数的比值，评估细胞存活率。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

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<li>Xin, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanics+and+actomyosin-dependent+survival%2Fchemoresistance+of+suspended+tumor+cells+in+shear+flow%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Mechanics and actomyosin-dependent survival/chemoresistance of suspended tumor cells in shear flow.</a> Biophysical Journal. 116 (10), 1803-1814 (2019).</li>
</ol>

MDH 是 SynderBio 公司的联合创始人、总裁兼股东。DLM 是 SynderBio 公司的顾问。

本文演示了使用注射器和针头将流体剪切应力（FSS）应用于悬浮状态的癌细胞。利用该模型，已证明癌细胞对短暂的高强度FSS的耐受性高于未转化的上皮细胞15,22,24。此外，使用该模型暴露于FSS可导致细胞刚度迅速增加，RhoA活化，以及基于皮层F-肌动蛋白和肌球蛋白II的收缩力增强24,27。快速的机械适应（循环肿瘤细胞（CTC）根据环境条件变得更硬或更软的能力）可能防止CTC的机械性破坏，并促进转移定植的其他方面24,28。事实上，使用该体外（in vitro）模型获得的研究结果已在动物模型的实验性CTC中得到验证24。这种快速的机械适应很可能解释了在此模...

转移，即癌症从原发肿瘤部位扩散至其他组织，是导致癌症死亡的主要因素1在转移过程中，癌细胞利用循环系统作为通道，扩散至全身各处的远端部位。2,3。尽管 途中 与这些位点相比，循环肿瘤细胞（CTCs）存在于一种动态的流体微环境中，不同于其原始原发性肿瘤的微环境3,4,5有研究提出，这种液体微环境是阻碍转移的多重屏障之一4关于转移效率低下的概念存在广泛共识，即大多数进入循环系统的循环肿瘤细胞（CTCs）会死亡或无法形成有效的转移性病灶。6,7,8然而，从单个循环肿瘤细胞（CTC）的角度来看，转移效率低下的原因尚不明确，仍是当前研究的活跃领域。CTC脱离了细胞外基质，缺乏原发肿瘤中可能存在的可溶性生长和存活因子，并且与原发肿瘤中的情况相比，其暴露于免疫系统和血流动力学作用的方式也大不相同。4上述每个因素都可能导致循环肿瘤细胞（CTCs）存活率低下，但各因素的相对贡献尚不明确。本文探讨了血流动力学力如何影响CTCs的问题。
研究血流动力学力对循环肿瘤细胞（CTCs）的影响具有相当大的挑战性。目前尚无任何工程化的体外（in vitro）系统能够完全模拟人类血管系统的全部时空动态（从心脏到毛细血管）和流变学特性。此外，CTCs 在循环系统中所经历的环境尚不完全明确。实验证据表明，大多数癌细胞并不像血细胞那样持续循环。相反，由于其相对较大的尺寸（直径10-20 µm），大多数 CTCs 会在毛细血管床（直径6-8 µm）中被暂时截留，截留时间长短不一（数秒至数天），在此期间它们可能死亡、发生外渗，或被推移至下一个毛细血管床8,9,10,11。然而，也有证据表明 CTCs 的尺寸在体内（in vivo）可能更具异质性，并且可检测到较小的 CTCs12。因此，根据距离和血流速度估算，CTCs 可能仅在这些截留事件之间自由循环数秒，尽管目前尚缺乏对该行为的定量描述13。
此外，根据循环肿瘤细胞（CTCs）进入血液循环的位置不同，它们在到达最终靶器官前，可能会经过肺部及其他外周部位的多个毛细血管床，并流经右心和左心。在此过程中，CTCs会暴露于多种血流动力学应力之下，包括流体剪切应力（FSS）、在微循环中被截留时所受的压缩力，以及在某些情况下沿血管壁表现出类似白细胞滚动时可能承受的牵引力14。因此，无论是对血液循环的建模能力，还是对CTCs行为的理解都存在局限性。鉴于这种不确定性，任何来自体外（in vitro）模型系统的发现都应在实验性脊椎动物模型中加以验证，并最终在癌症患者中进行确认。
在前述注意事项的前提下，本文展示了一种相对简单的模型，用于将流体剪切应力（FSS）施加于悬浮细胞，以研究2012年首次报道的FSS对循环肿瘤细胞（CTCs）的影响15。FSS源于血流与血管壁之间的摩擦，在较大血管的层流条件下会产生抛物线形的速度梯度。细胞在靠近血管壁处经历较高的FSS，而在血管中心附近则较低。流体黏度、流速以及流动通道的尺寸均会影响FSS，这可通过哈根-泊肃叶方程（Hagen-Poiseuille equation）进行描述。该方程适用于表现为牛顿流体的血流情况，但不适用于微循环。生理条件下的FSS跨越多个数量级，淋巴系统中的水平最低（&#60;1 dyn/cm2），而心脏瓣膜周围和动脉粥样硬化斑块区域则最高（&#62;500 dyn/cm2）5。动脉中的平均壁面剪切应力为10–70 dyn/cm2，静脉中则为1–6 dyn/cm216,17。
在心脏中，细胞可能会暴露于瓣膜瓣叶周围的湍流中，从而经历极高强度但极短时间的流体剪切应力18,19尽管生物加工领域长期以来一直在研究流体剪切力（FSS）对悬浮培养哺乳动物细胞的影响，但这些信息在理解FSS对循环肿瘤细胞（CTCs）的作用方面可能价值有限，因为相关研究通常关注的是长时间施加的较低水平FSS20如以下所述，使用注射器和针头，可施加相对较高的压力（数十至数千达因/厘米）2) 在毫秒级的短暂时间内对细胞悬液施加FSS。自从该模型首次被描述以来15，其他研究者已采用该方法研究流体剪切应力对癌细胞的影响21,22,23. 多个 &#34;脉冲&#34; FSS 可在短时间内施加于细胞悬液，以促进后续实验分析。例如，可通过测量细胞活力随施加脉冲次数的变化，利用该模型评估细胞抵抗 FSS 机械破坏的能力。或者，可通过收集细胞进行多种下游分析，探究 FSS 暴露对癌细胞生物学特性的影响。重要的是，需保留部分细胞悬液作为静态对照，以区分 FSS 的效应与细胞脱落及悬液中停留时间所可能带来的影响。

<table><tbody><tr><td>0.25% 胰蛋白酶</td><td>Gibco</td><td>25200-056</td><td></td></tr><tr><td>14 mL 圆底管</td><td>Falcon - Corning</td><td>352059</td><td></td></tr><tr><td>30 G 1/2&quot; 针头</td><td>BD</td><td>305106</td><td></td></tr><tr><td>5 mL 注射器</td><td>BD</td><td>309646</td><td></td></tr><tr><td>96 孔黑底板</td><td>Costar - Corning</td><td>3915</td><td></td></tr><tr><td>生物发光检测仪</td><td>AMI</td><td>AMI HTX</td><td></td></tr><tr><td>牛血清白蛋白，第五组分（BSA, Fraction V）</td><td>Sigma</td><td>10735086001</td><td></td></tr><tr><td>Cell Titer Blue</td><td>Promega</td><td>G8081</td><td></td></tr><tr><td>结晶紫</td><td>Sigma</td><td>C0775</td><td></td></tr><tr><td>D-荧光素</td><td>GoldBio</td><td>D-LUCK</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Gibco</td><td>11965-092</td><td></td></tr><tr><td>胎牛血清（FBS）</td><td>Atlanta Biologicals</td><td>S11150</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Gibco</td><td>10010023</td><td></td></tr><tr><td>酶标仪</td><td>BioTek</td><td>Synergy HT</td><td></td></tr><tr><td>叠氮化钠（NaN&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;）</td><td>Sigma</td><td>S2002</td><td></td></tr><tr><td>注射泵</td><td>Harvard Apparatus</td><td>70-3005</td><td></td></tr></tbody></table>

利用注射器和针头模拟血流动力学应力对循环肿瘤细胞的影响

Modeling the Effects of Hemodynamic Stress on Circulating Tumor Cells using a Syringe and Needle

在转移过程中，来自实体组织（包括上皮组织）的癌细胞进入淋巴系统和血行循环，在此过程中因血流动力学流动而暴露于机械应力之下。循环肿瘤细胞（CTCs）所经历的应力之一便是流体剪切应力（FSS）。尽管癌细胞在肿瘤内部可能因间质液流动而经历较低水平的FSS，但CTCs在缺乏细胞外基质附着的情况下，会暴露于显著更高的FSS水平中。生理状态下，FSS的范围跨越3至4个数量级：淋巴系统中FSS水平较低（&#60;1 dyne/cm2），而当细胞流经心脏及心脏瓣膜时，FSS可短暂达到最高水平（&#62;500 dynes/cm2）。目前已开发出少数几种in vitro模型，用于模拟不同时间尺度下生理范围内的剪切应力。本文介绍一种利用简单的注射器-针头系统，研究高强度FSS的短暂（毫秒级）脉冲对癌细胞生物学影响的模型。

先前的研究表明，与未转化的上皮细胞对照相比，多种癌细胞系以及直接从肿瘤组织中新鲜分离的癌细胞对流体剪切力（FSS）诱导的机械破坏具有增强的抗性，这一表型在多种癌症中具有保守性15,24。本研究进一步检测了来源于不同组织的其他癌细胞系（表2），结果显示其中大多数细胞在250 µL/s流体剪切力下经受10次脉冲处理后，存活率仍可达≥20%。唯一的例外是MiaPaCa2细胞，其对FSS引起的机械破坏相对敏感（存活率≤10%）。为准确描述一个细胞系的FSS抗性特征，建议至少进行n ≥ 3次生物学重复实验。
作为对比，所有检测的非转化上皮细胞均具有活力 &lt; 10% 在这些条件下15,24因此，尽管观察到不同细胞系对流体剪切应力（FSS）的抵抗能力存在差异，但大多数受试的癌细胞系表现出比非转化细胞更强的FSS抵抗能力。癌细...

本文展示了一种对悬浮状态下的癌细胞施加流体剪切应力的方法，用于模拟血流动力学应力对循环肿瘤细胞的影响。

在转移过程中，来自实体组织（包括上皮组织）的癌细胞进入淋巴循环和血行循环，在此过程中它们会暴露于……

本方案通过短暂的流体剪切应力处理悬浮状态的癌细胞，以模拟转移性癌细胞在循环系统中所受血流动力学力的某些方面。该技术相对简单，可施加短暂的高强度流体剪切应力。在实施本方案时，需注意未封帽的针头，切勿弯折，以免改变施加的剪切力。该操作可能产生气溶胶，因此需采取适当的安全防护措施。首先，吸除培养基，用五毫升不含钙和镁的 PBS 洗涤 10 厘米培养皿，使 PC3 细胞从培养皿上脱落，此时细胞融合度应达到 70% 至 90%。随后吸除 PBS，加入一毫升 0.25% 胰蛋白酶。胰蛋白酶消化后，在倒置显微镜下观察细胞脱落情况。为终止胰蛋白酶作用，加入5 mL含10% FBS的DMEM/F12培养基。随后，将细胞悬液转移至锥形管中，测定细胞浓度及总细胞数量。将细胞悬液在300 × g离心3分钟，然后吸除上清液，并将沉淀重悬于无血清的组织培养基中。在14毫升聚苯乙烯管的7毫升刻度线处剪去管底，将混合的细胞悬液加入该剪切过的管中。在施加流体剪切应力前，单独收集细胞的静态对照样品，用于后续检测分析。为了使剩余的细胞悬液样品暴露于流体剪切应力，将细胞悬液吸入一支5毫升注射器中，并连接一个30号半英寸针头。将装有未加盖针头的注射器固定在注射泵上，设置流速以达到所需的流体剪切应力水平。启动注射泵，并以约45度角将剪切后的样品收集到已切割的试管中，以减少泡沫产生。小心地将注射器从注射泵上取下，并使用钳子取下针头，注意不要触碰针头。重复该操作，直至细胞悬液经受了所需次数的流体剪切应力脉冲。在将细胞暴露于流体剪切应力之前，先对静态样本进行活力检测。进行酶学检测时，将静态样品各100微升等份重复转移至96孔板中。随后，收集经流体剪切应力处理后的样品各100微升，并置于96孔板中。向每个样品孔以及含有100微升单独培养基的孔中加入20微升浓度为0.15毫克/毫升的刃天青溶液。将培养板置于37摄氏度的组织培养孵育箱中孵育两小时，然后使用酶标仪检测荧光和吸光度，并通过将各流体剪切应力处理样本的平均信号与静态对照样本的平均信号进行比较，计算活细胞百分比。同样，从静态样本中收集等分试样，用于进行流式细胞术和克隆形成实验，具体操作如文本稿件中所述。在代表性分析中，通过将同源活检来源的乳腺上皮癌细胞暴露于多种流体剪切应力脉冲后，采用刃天青还原法评估其存活率。尽管每种细胞系表现出不同的耐药特征，但在经历10次流体剪切应力暴露后，其存活率无显著差异。来自不同组织来源的其他癌细胞系在经历10次流体剪切应力后均表现出超过20%的存活率，唯有MIA PaCa-2细胞因对流体剪切应力引起的机械破坏较为敏感，其存活率低于10%。在施加流体剪切应力之前采集静态样本时，应确保细胞悬液充分混匀，呈均一状态。使用镊子小心地取下针头，切勿弯曲或触碰针头。除了检测细胞活力外，还可以评估基因表达、细胞信号传导、增殖和迁移的变化。以此作为流体剪切应力暴露的模型，可以研究癌细胞抵抗流体剪切应力破坏的机制，同时评估流体剪切应力对癌细胞生物学特性的影响。本实验室及其他研究团队已采用该技术来探究流体剪切应力对循环肿瘤细胞的影响。这些研究表明，流体剪切应力会迅速改变癌细胞的力学特性，而这种改变有助于癌细胞抵抗流体剪切应力造成的破坏。

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Research

科研

JoVE Journal

Cancer Research

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