使用注射器和针头模拟血液学应激对循环肿瘤细胞的影响

该协议将悬浮中的癌细胞暴露在液切变应力的短暂脉冲中，以模拟转移性癌细胞在循环系统中如何暴露于血液动力的某些方面。应用高水平流体剪切应力的短暂脉冲是一种相对简单的技术。在尝试此协议时，小心未封顶的针头，不要弯曲它们，因为这将改变施加力剪切应力。

此程序可能会产生气溶胶，因此请使用适当的安全措施。首先，通过吸气生长介质，用5毫升无钙和无镁PBS清洗10厘米的盘，从组织培养皿中释放70%至90%的聚合PC3细胞。然后，吸气PBS，并添加一毫升0.25%的试用素。

尝试后，观察倒置显微镜下细胞的分离。要抑制试丁香，添加5毫升DMEM/F12介质含有10%FBS。接下来，将细胞悬浮放入圆锥管中，确定细胞浓度和细胞总数。

将细胞悬浮离心在 300 x g 下三分钟，然后吸气超纳特，并在无血清组织培养介质中重新吸气颗粒。在 7 毫升线处切开 14 毫升聚苯乙烯管的底部，并将混合细胞悬架放入切割管中。单独收集细胞静态控制样本，然后再进行液切应力暴露，用于执行检测。

要将剩余的细胞悬浮样品暴露在液切变应力下，请将细胞悬浮液拉入 5 毫升注射器中，并连接 30 米半英寸针头。将带未封盖针头的注射器放置并固定在注射器泵上，并设置流速，以达到所需的液切变应力水平。运行注射器泵，以大约 45 度角在切管中收集剪切样品，以减少发泡。

小心地从注射器泵中取出注射器，并用钳子取出针头，注意不要触摸针头。重复此过程，直到细胞悬浮暴露在所需的液切变应激脉冲数量。在使细胞暴露在液切变应力之前，对静态样品进行可行性分析。

对于酶检测，将 100 微升从重复中的静态样品中转移到 96 井板中。然后，在液体剪切应力暴露后收集 100 微升样品，并将其放置在 96 井板中。在每口样品井和仅含有100微升中等微升的油井中加入20微升每毫升0.15毫克的再沙祖林溶液。

在37摄氏度的组织培养孵化器中孵育井板两小时，然后使用板读器测量荧光和吸收，并通过将每个流体剪应力暴露样品的平均信号与静态控制样本进行比较，获得活细胞的百分比。同样，从静态样本中收集阿利报价，以执行文本手稿中描述的流细胞学和克隆性测定。在具有代表性的分析中，在使细胞暴露在一些液切变应激脉冲中后，使用再沙祖林转化来评估合成活检乳腺上皮癌细胞的可行性。

尽管每个细胞系都显示不同的电阻型材，但在10次液切变应激暴露脉冲后，其生存能力没有显著差异。来自各种组织起源的其他癌细胞系表明，在10脉冲的液切变应激之后，其生存能力超过20%，但MIA PaCa-2细胞除外，由于对液切变应激的机械破坏敏感性，其生存能力低于10%。在应用流体剪切应力之前收集静态样品时，确保细胞悬浮是同质混合的。

小心地用钳子取下针头，不要弯曲或触摸针头。除了测量细胞的生存能力外，人们还可以评估基因表达、细胞信号、增殖和迁移的变化。以此作为接触液切变应激的模型，可以研究癌细胞如何抵抗液切变应激的破坏，并评估液切变应激对癌细胞生物学的影响。

本技术已被我们的实验室和其他人用于探索液切变应力对循环肿瘤细胞的影响。这些研究表明，液切变应力迅速改变癌细胞的机械特性，这有助于癌细胞抵抗液切变应力破坏的能力。