建立来自口腔的共生糖杆菌稳定二元培养物

放线菌门细菌（Saccharibacteria）是专性寄生菌，必须与合适的宿主细菌共培养。由于人类口腔中的放线菌门细菌可通过已知的宿主菌种从大多数个体中轻松分离，本实验方案可使任何研究人员或实验室在二元共培养体系中分离获得属于自己的菌株。

该技术使用大多数微生物学实验室中常见的简单设备，已成功用于培养代表六种糖杆菌的30多种分离株。如果能够鉴定并分离出适当的放线菌宿主，本方案可能有助于从不同环境和其他哺乳动物中分离其他候选门辐射物种以及糖杆菌。本实验操作将由本实验室前博士后研究员Andrew Collins进行演示。

首先，开始培养宿主细菌，例如丙酸节杆菌（arachnia propionica），并留出足够时间使其生长至早期稳定期。接种时，取两到五毫升含0.1%酵母提取物的胰蛋白胨大豆肉汤，接入丙酸节杆菌（arachnia propionica），于37摄氏度培养24小时。接下来，将核孔径为0.2微米的滤膜安装至滤器支架中。

用锡箔纸包裹，并与离心管及管盖组件一同进行高压灭菌。为防止意外接触非无菌表面，应额外灭菌备用物品。使用无菌纸尖、Gracey刮治器、无菌牙签或无菌移液器吸头沿牙龈线刮取牙菌斑，并将其转移至适当的缓冲液中，如MRD或PBS。

将样品置于冰上保存，直至准备进行下一步操作。使用小吸头通过涡旋振荡和移液相结合的方式剧烈重悬牙菌斑，然后将重悬后的菌斑样品加入含有九毫升 MRD 缓冲液的离心管中。采用无菌技术小心拆开无菌滤器组件的包装。

旋转四分之一圈松开，然后重新拧紧滤器支架，以确保螺纹正确啮合，并且装置完全闭合。使用注射器将10毫升MRD缓冲液通过装置，以清洗滤膜。将样品加至清洗后的滤膜时，需从注射器上取下活塞，并将注射器连接到滤器装置上。

将一支无菌离心管置于滤器装置下方以收集滤液，然后将分散的牙科样本倒入注射器中，并将其加载到滤器上。轻轻推动推杆，使样本通过滤膜。再用另外10毫升MRD缓冲液冲洗膜，将流出液收集到与滤过样本相同的离心管中。

然后无菌条件下盖上管盖，并置于冰上保存。在管壁和管盖上做一个方向标记，以确定离心后细胞沉淀的位置。将离心管放入高速离心机中，使标记朝向上方，于4°C条件下以60,000 ×g离心一小时。

离心后，小心倒出上清液，使沉淀物保持在管子的上方。然后通过剧烈涡旋，将沉淀物重悬于一到两毫升的MRD缓冲液中。通过将两毫升适当的生长培养基分装到各管中，准备培养管。

然后，向每支试管中加入200微升宿主生物的过夜培养物以及100至200微升重悬的过滤样品。将混合样品在适合宿主生物生长的条件下进行孵育。每隔两到三天，将200微升二元培养物转移至新试管中含2毫升新鲜培养基的容器内，进行细胞传代。

如果传代培养物在加入200微升未感染的宿主培养物后未显示生长，则在传代细胞时，将接种后的试管放回培养箱。将24微升PCR预混液分装至0.2毫升PCR管中。取1微升感染了拟杆菌的培养物，将试管放入热循环仪中。

按照文稿中所述设置PCR程序。将PCR产物上样并在1%琼脂糖凝胶上电泳。出现一条约600个碱基的条带即可证实唾液菌的存在。

为确认阳性培养物的纯度，将共生培养的共生菌在无菌缓冲液中进行10倍系列稀释，并取100微升涂布于琼脂平板上。在适当的生长条件下培养，并观察是否存在污染微生物。约600个碱基的条带可证实共生菌的存在。

在初始感染培养中，由于共生纤毛菌（saccharibacteria）数量较少，PCR 检测结果可能呈阴性。然而，经过数次传代后，应出现明显的 PCR 扩增产物，表明已建立稳定的感染。使用相同的共生纤毛菌滤液对多个宿主物种进行测试，通常成功率较低。

由于共生体与宿主的相互作用具有高度特异性，随着感染培养物的生长，应出现正常的浑浊生长。当共生关系建立后，感染培养物的浑浊度将低于未感染宿主生物的培养物。

可通过平板接种后挑取被感染的菌落来纯化受污染的培养物。有时可通过与未感染菌落相比菌落形态不规则来识别被感染的菌落。规则菌落所占比例取决于二元培养物中糖杆菌的滴度。

如果滴度较低，则较少的菌落会呈现不规则形态，从而易于挑选出被感染的菌落并建立纯的双元培养物。某些培养物可能在连续传代数次后才呈现阳性结果，因此可能需要一些患者样本。

还需要定期检查双元培养物是否受到污染，因为污染可能导致培养物失稳并引起糖杆菌的死亡。该双元培养物可用于各种实验室实验。可分别提取DNA和RNA用于基因组测序和转录组分析。

也可使用动物模型来研究致病性。