一种用于多重微球流式分析系统的快速、多重双报告基因IgG和IgM SARS-CoV-2中和检测方法

据我们所知，这是首个采用两种报告信号同时检测每种分析物两项结果的基于微球的多重检测方案。该技术使用户能够同时测定抗原特异性的IgM和IgG，所需样本量更少，且检测时间更短。尽管这种双报告信号方法目前专用于抗体亚型鉴定，但其也可被改进用于检测其他成对分析物，例如翻译后修饰或游离与结合态药物形式。

今天为我们演示实验步骤的是 Luminex Corporation 的高级现场应用科学家 Steve Angeloni 博士。开始进行双重报告基因 IgG 和 IgM 血清学检测时，需从单独的偶联微球和对照微球储备液中配制所需的多重微球混合液，浓度为每毫升 1 × 10⁶ 个微球。接下来，将血清样本用 PBS-TBN 缓冲液进行 100 倍稀释，即在 990 微升 PBS-TBN 缓冲液中加入 10 微升血清；然后再进行 10 倍稀释，即取 20 微升 1:100 稀释液加入 180 微升 PBS-TBN 缓冲液中。

当磁珠混合物和血清样本准备就绪后，将50 µL多重磁珠混合物加入指定的96孔非结合微孔板孔中，然后向相应的孔中加入50 µL稀释后的血清样本。所有样本加样完成后，用微孔板铝箔封膜覆盖，并在37°C的加热板振荡器中孵育15分钟。随后，将微孔板置于磁性板分离器上2分钟，使磁珠与反应混合物分离。

将培养板保持在磁铁上，移去封口箔膜。然后小心地将培养板倒置在废液容器上方，轻轻弹动以弃去孔中的上清液。在仍将培养板置于磁铁上的同时，用吸水纸轻压培养板进行吸液。

为清洗反应孔，将酶标板从磁板架上取下，向每孔加入150微升PBS-TBN。用新的铝箔封膜覆盖酶标板，置于加热振荡器上孵育2分钟，然后放回磁板架上再静置2分钟。保持酶标板始终置于磁板架上，将其倒置以弃去上清液，并在吸水纸上轻拍酶标板以去除残留液体。

第二次 PBS-TBN 洗涤后，将板从磁铁上取下，并向每个孔中加入 100 微升新鲜的检测试剂混合液。用微孔板铝箔封膜覆盖板后，将其置于加热振荡仪上孵育 15 分钟，随后置于磁性板分离器上 2 分钟。当板处于磁铁上时，将板倒置在废液容器上方，弃去检测试剂混合液，并在吸水纸上轻拍以吸干残留液体。

用 PBS-TBN 缓冲液洗涤反应孔，重复两次，操作如前所述，然后将反应板从磁铁上取下。向每孔加入 100 µL PBS-TBN 缓冲液，用铝箔封膜覆盖反应板，在 37°C 下振荡孵育 2 分钟。移除铝箔封膜，随后在流式分析仪中读取每孔 50 µL 样品。

读取酶标板时，选择左上角的下拉菜单，进入“板配置”（Plate Configuration），加载先前配置好的酶标板，然后选择“运行板”（Run Plate）。点击“弹出”（Eject）图标将板架弹出，将酶标板放入板架中，再点击“收回”（Retract）图标以收回板架。当板架完全进入分析仪后，点击“运行”（Run）图标开始读取酶标板。

对于双报告基因中和实验，将50微升多重微球混合物加入指定的96孔非结合微孔板孔中，然后向每孔加入25微升浓度为每毫升2微克的ACE2，并用铝箔封膜覆盖板孔。在加热平板振荡器上孵育2分钟后，向指定孔中加入25微升1:500稀释的血清。待所有样品加入后，按照血清学实验 previously demonstrated 的孵育、洗涤、检测和分析步骤进行操作。

使用发病后5至60天内的血清样本以及IgG条带血清样本，对与DyLight 405报告染料偶联的抗IgM进行检测，结果显示刺突抗原未产生高信号。对于IgM中等荧光强度较高的样本，受体结合域和核衣壳抗原的信号最强。尽管部分样本中的IgM滴度应有所升高，但观察到的中等荧光强度水平并未超过140 MFI单位。

此外，在使用与抗 IgM 抗体偶联的 DyLight 405 时，IgM 的对照微球在中位荧光强度上缺乏显著的动态范围，而相同浓度下使用藻红蛋白标记的抗 IgM 抗体则表现较好。对于 IgG 的检测，与荧光染料 Super Bright 436 的链霉亲和素偶联物相比， Brilliant Violet 偶联物具有更高的中位荧光强度信号。然而，Brilliant Violet 偶联物的信号强度在 ACE2 滴定过程中存在波动。

这种由明亮紫色偶联物在不同ACE2浓度下产生的信号波动，也干扰了在IgG滴度范围内确定ACE2对结合的抑制百分比。在IgM检测中，藻红蛋白标记的抗IgM抗体产生的信号高于DyLight 549标记的抗人IgM抗体。在测定ACE2对IgM结合的抑制百分比时，这两种IgM检测试剂之间存在轻微但无统计学意义的差异。

因此，该实验步骤中最关键的环节之一是从单个微球储备液中正确配制多重微球混合液，并确保操作无误。该方法还可用于评估疫苗的有效性，并监测针对其他病原体的免疫应答。