Name: 基于多路复用珠子的流量分析系统的快速、多路双记者 IgG 和 Igm SARS-CoV-2 中和检测 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-04-06T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 8 s
Description: 学习基于多路复用珠子的双报告系统同时检测SARS-CoV-2的IgG和IgM抗体。该方法减少样本用量并缩短检测时间，适用于疫苗效果评估和免疫监测研究。

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本报告由美国奥斯汀的Luminex公司资助。作者感谢马修·西尔弗曼博士（Biomedical Publishing Solutions，佛罗里达州德尔雷比奇）在科学编辑方面提供的协助。

本研究使用了先前用于SARS-CoV-2诊断分析的剩余人血清样本，该研究已获得罗切斯特大学机构审查委员会的批准。
1. 试剂与设备
<ol>
	<li>从商业来源获取冠状病毒抗原以及人源 IgG 和 IgM。</li>
	<li>从仪器供应商处获取质控（AC）微球试剂盒（编号 45 和 220）。AC 微球试剂盒 45 用于监测单报告通道（RP1）仪器上的中位荧光强度（MFI）采集情况，AC 微球试剂盒 220 用于监测第二报告通道（RP2）上的 MFI 采集情况。</li>
	<li>获取检测抗体，以及用于偶联验证的抗原特异性兔血清和抗体。</li>
	<li>使用生物素标记的抗体进行检测，检测时可选用链霉亲和素-R-藻红蛋白偶联物（SAPE）或链霉亲和素-荧光染料 Super Bright 436 偶联物（SASB；激发波长 405 纳米（nm），发射波长 436 nm）。</li>
	<li>获取人 ACE2 蛋白（即 SARS 受体）。使用前，将冻干的 ACE2 蛋白溶于无核酸酶水（非 DEPC 处理，经高压灭菌并用 0.2-µm 滤膜除菌）中，配制成 1 mg/mL 的浓度，并在 4 °C 下保存。</li>
	<li>所有反应均在 96 孔非结合表面（NBS）黑色平底板中进行。在检测孵育步骤中，使用 96 孔微孔板铝膜密封。洗涤步骤使用磁板分离器进行。</li>
</ol>
2. 抗原偶联和抗体偶联对照微球的制备
<ol>
	<li>按照 Cameron 等人1所述方法，将磁性、聚苯乙烯、颜色编码的微球（直径 6.5 µm）与 S、RBD 和 Nc 抗原共价偶联。冠状病毒抗原的偶联浓度为：S 抗原 10 pmol/106 微球，RBD 和 Nc 抗原均为 100 pmol/106 微球。对照微球使用人 IgG 或 IgM 进行偶联，制备方法见先前文献1，IgG 和 IgM 的偶联浓度为 5 µg/106 微球。</li>
	<li>偶联完成后，测定微球浓度，并按照所述程序6将每种储备液稀释至 1 × 106 微球/mL。</li>
	<li>按照 Cameron 等人1所述方法，使用兔源抗原特异性抗体或阳性人血清验证抗原偶联效果。
	<ol>
		<li>使用本检测中的生物素化抗人 IgG/SAPE 检测试剂验证人 IgG 的偶联，使用藻红蛋白（PE）标记的山羊抗人 IgM 验证 IgM 的偶联。 
		注：由于尚不明确这些试剂的最佳使用浓度，因此需通过抗原特异性血清或抗体的梯度稀释实验进行偶联验证。对于血清，采用连续倍比稀释；对于以 mg/mL 为单位的抗体原液，则采用连续 µg/mL 稀释系列。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>在用于多重微球混合液之前，将用于监测两个报告通道 MFI 采集的检测对照（AC）微球稀释至 1 × 106 微球/mL 的浓度。</li>
</ol>
3. 新鲜多重微球混合液的制备
<ol>
	<li>每天新鲜配制多重微球混合液，从各自偶联微球和对照微球储备液中配制，浓度为 1 × 106 个微球/mL。 
	&#8203;注意：多重微球混合液的配制应确保在 50 µL 体积中每种微球区域含有 2,500 个微球。有关如何为任意数量反应配制多重微球混合液的计算方法，参见 Angeloni (2020)6 发表的博客。</li>
</ol>
4. 样品稀释
<ol>
	<li>通过混合10 μL血清样本与990 μL稀释液，制备1:100的血清样本稀释液 &#181;L 血清加入 990 &#181;含0.05% Tween 20、0.02%叠氮化钠和1%牛血清白蛋白（BSA）的磷酸盐缓冲液（PBS）（PBS-TBN缓冲液）</li>
	<li>将样本再次稀释10倍，加入20 &#181;1:100 稀释液的 L 加至 180 &#181;L PBS-TBN 
	&#8203;注意：血清样本包括阴性血清（来自2019年即COVID-19大流行前采集的标本）和阳性血清（来自SARS-CoV-2 PCR阳性患者），代表低滴度和高滴度抗体水平。阳性样本采集于 &#8776;3 至 &#62;症状出现后60天（DFSO）。所有血清样本和IgG去除的阴性对照血清按如下所述稀释至1:1000。中和试验中，血清按如下中和试验方案（第6和第8节）所述稀释至1:500。</li>
</ol>
5. 单报告基因血清学检测方案
<ol>
	<li>向每孔分配好的 96 孔非结合微孔板中加入 50 µL 多重微球混合液。</li>
	<li>用移液器向相应孔中加入 50 µL 1:1000 稀释的血清或 PBS-TBN；孔中血清的最终稀释度为 1:2000。</li>
	<li>用微孔板铝箔封膜覆盖板孔，置于 37 °C 加热板式振荡器上，以 600 rpm 振荡孵育 15 分钟。</li>
	<li>从板式振荡器上取下微孔板，放置于磁板分离器上 2 分钟，使微球与反应混合液分离。</li>
	<li>保持微孔板在磁板上，取下铝箔封膜，小心将微孔板倒置于废液容器上方，轻轻甩去孔内上清液。</li>
	<li>在保持微孔板置于磁板上的同时，用吸水纸轻压微孔板底部吸除残留液体。</li>
	<li>按以下步骤洗涤反应孔（第一次样品孵育后洗涤）。
	<ol>
		<li>将微孔板从磁板上取下，向每孔加入 150 µL PBS-TBN。</li>
		<li>用新的铝箔封膜覆盖微孔板，于 37 °C 以 600 rpm 振荡 2 分钟。</li>
		<li>从板式振荡器上取下微孔板，放回磁板上静置 2 分钟，使微球与反应混合液分离。</li>
		<li>保持微孔板在磁板上，取下铝箔封膜，小心将微孔板倒置于废液容器上方，轻轻甩去孔内上清液。</li>
		<li>在保持微孔板置于磁板上的同时，用吸水纸轻压微孔板底部吸除残留液体。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>按以下步骤洗涤反应孔（第二次样品孵育后洗涤）。
	<ol>
		<li>将微孔板从磁板上取下，向每孔加入 150 µL PBS-TBN。</li>
		<li>用新的铝箔封膜覆盖微孔板，于 37 °C 以 600 rpm 振荡 2 分钟。</li>
		<li>从板式振荡器上取下微孔板，放回磁板上静置 2 分钟，使微球与反应混合液分离。</li>
		<li>保持微孔板在磁板上，取下铝箔封膜，小心将微孔板倒置于废液容器上方，轻轻甩去孔内上清液。</li>
		<li>将微孔板从磁板上取下。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将生物素标记的抗人 IgG 与 SAPE 新鲜混合，将抗体稀释至 0.62 µg/mL，SAPE 稀释至 1 µg/mL，然后向每孔加入 100 µL。</li>
	<li>用微孔板铝箔封膜覆盖，置于 37 °C 加热板式振荡器上，以 600 rpm 振荡孵育 15 分钟。</li>
	<li>从板式振荡器上取下微孔板，放置于磁板分离器上 2 分钟，使微球与反应混合液分离。</li>
	<li>保持微孔板在磁板上，取下铝箔封膜，小心将微孔板倒置于废液容器上方，轻轻甩去孔内上清液。</li>
	<li>在保持微孔板置于磁板上的同时，用吸水纸轻压微孔板底部吸除残留液体。</li>
	<li>按以下步骤洗涤反应孔（第一次检测抗体孵育后洗涤）。
	<ol>
		<li>将微孔板从磁板上取下，向每孔加入 150 µL PBS-TBN。</li>
		<li>用新的铝箔封膜覆盖微孔板，于 37 °C 以 600 rpm 振荡 2 分钟。</li>
		<li>从板式振荡器上取下微孔板，放回磁板上静置 2 分钟，使微球与反应混合液分离。</li>
		<li>保持微孔板在磁板上，取下铝箔封膜，小心将微孔板倒置于废液容器上方，轻轻甩去孔内上清液。</li>
		<li>在保持微孔板置于磁板上的同时，用吸水纸轻压微孔板底部吸除残留液体。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>按以下步骤洗涤反应孔（第二次检测抗体孵育后洗涤）。
	<ol>
		<li>将微孔板从磁板上取下，向每孔加入 150 µL PBS-TBN。</li>
		<li>用新的铝箔封膜覆盖微孔板，于 37 °C 以 600 rpm 振荡 2 分钟。</li>
		<li>从板式振荡器上取下微孔板，放置于磁板分离器上 2 分钟，使微球与反应混合液分离。</li>
		<li>保持微孔板在磁板上，取下铝箔封膜，小心将微孔板倒置于废液容器上方，轻轻甩去孔内上清液。</li>
		<li>将微孔板从磁板上取下。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>向每孔加入 100 µL PBS-TBN。</li>
	<li>用铝箔封膜覆盖，于 37 °C 振荡 2 分钟。</li>
	<li>从板式振荡器上取下微孔板，取下铝箔封膜，按照用户手册在流式分析仪上读取每孔 50 µL 样品。以下提供简要说明。
	<ol>
		<li>点击屏幕左上角的下拉菜单，进入板配置界面。</li>
		<li>选择运行板。</li>
		<li>点击弹出图标，弹出板载架。</li>
		<li>将微孔板放入板载架，点击收回图标，将板载架收回。</li>
		<li>点击运行图标，开始运行微孔板。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
6. 单一报告基因中和实验方案
<ol>
	<li>按照上述第3节所述方法，制备新鲜的多重微球混合液。</li>
	<li>将患者和对照血清稀释1:500，步骤如下：
	<ol>
		<li>取10 µL血清加入990 µL PBS-TBN中，制成1:100稀释血清。</li>
		<li>取40 µL 1:100稀释血清加入160 µL PBS-TBN中，进一步稀释5倍。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>向96孔非结合型微孔板的每个指定孔中加入50 µL多重微球混合液。</li>
	<li>向每孔中加入25 µL浓度为2 µg/mL的ACE2稀释液。</li>
	<li>用微孔板铝箔封膜密封板孔，置于加热板式振荡器上，37 °C、600 rpm条件下振荡孵育2分钟。</li>
	<li>从振荡器上取出微孔板，揭去铝箔封膜。</li>
	<li>向指定孔中加入25 µL 1:500稀释的血清或PBS-TBN。</li>
	<li>用微孔板铝箔封膜密封板孔，置于加热板式振荡器上，37 °C、600 rpm条件下振荡孵育15分钟。</li>
	<li>后续实验步骤，请参照上述5.4至5.18.5步骤进行。</li>
</ol>
7. 转换为双报告基因 IgG 和 IgM 血清学检测方法
<ol>
	<li>按照上述第2节所述制备抗原偶联微球。 
	注意：额外加入一组与人IgM偶联的微球，用于监测抗IgM检测试剂的添加情况；同时加入另一组AC微球（220），用于监测RP2的MFI采集。所有微球储备液浓度均为1 × 106 个微球/mL，用于按如下说明配制多重微球混合液。</li>
	<li>按照上述第3节所述新鲜配制多重微球混合液。</li>
	<li>按照上述第4节所述，将血清样本和去IgG阴性对照血清稀释至1:1000。</li>
	<li>向96孔非结合微孔板中每个指定孔加入50 µL多重微球混合液。</li>
	<li>用移液器向相应孔中加入50 µL 1:1000稀释的血清或PBS-TBN，孔中血清的最终稀释倍数为1:2000。</li>
	<li>用微孔板铝箔封膜覆盖板子，置于37 °C加热板式振荡器上，以600 rpm振荡孵育15分钟。</li>
	<li>从振荡器上取下板子，放置于磁板分离器上2分钟，使微球与反应混合液分离。</li>
	<li>保持板子在磁板上，移除铝箔封膜，小心将板子倒置于废液容器上方，轻轻甩出各孔中的上清液。</li>
	<li>在仍保持板子置于磁板上的同时，将板子在吸水纸上轻拍以去除残留液体。</li>
	<li>按以下步骤洗涤反应孔（样品孵育后第一次洗涤）。
	<ol>
		<li>将板子从磁板上取下，向每孔加入150 µL PBS-TBN。</li>
		<li>用新的铝箔封膜覆盖板子，于37 °C以600 rpm振荡2分钟。</li>
		<li>从振荡器上取下板子，放回磁板分离器上2分钟，使微球与反应混合液分离。</li>
		<li>保持板子在磁板上，移除封膜，小心将板子倒置于废液容器上方，轻轻甩出各孔中的上清液。</li>
		<li>在仍保持板子置于磁板上的同时，将板子在吸水纸上轻拍以去除残留液体。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>再次使用PBS-TBN洗涤反应孔（样品孵育后第二次洗涤），步骤与上述7.10.1–7.10.5完全相同。</li>
	<li>将板子从磁板上取下。</li>
	<li>新鲜配制所需组合的检测试剂混合液，并向每孔加入50 µL或100 µL。 
	注意：由于可用的储备试剂有限，含与BV421报告染料（激发波长405 nm，发射波长421 nm）偶联的抗人IgG抗体的检测试剂混合液每孔使用50 µL；其他所有检测试剂混合液每孔使用100 µL。</li>
	<li>用微孔板铝箔封膜覆盖板子，置于37 °C加热板式振荡器上，以600 rpm振荡孵育15分钟。</li>
	<li>从振荡器上取下板子，放置于磁板分离器上2分钟，使微球与反应混合液分离。</li>
	<li>保持板子在磁板上，移除铝箔封膜，小心将板子倒置于废液容器上方，轻轻甩出各孔中的上清液。</li>
	<li>在仍保持板子置于磁板上的同时，将板子在吸水纸上轻拍以去除残留液体。</li>
	<li>使用PBS-TBN按以下步骤洗涤反应孔（检测抗体孵育后第一次洗涤）。
	<ol>
		<li>将板子从磁板上取下，向每孔加入150 µL PBS-TBN。</li>
		<li>用新的铝箔封膜覆盖板子，于37 °C以600 rpm振荡2分钟。</li>
		<li>从振荡器上取下板子，放回磁板分离器上2分钟，使微球与反应混合液分离。</li>
		<li>保持板子在磁板上，移除封膜，小心将板子倒置于废液容器上方，轻轻甩出各孔中的上清液。</li>
		<li>在仍保持板子置于磁板上的同时，将板子在吸水纸上轻拍以去除残留液体。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>再次使用PBS-TBN洗涤反应孔（检测抗体孵育后第二次洗涤），步骤与上述7.17.1–7.17.5完全相同。</li>
	<li>将板子从磁板上取下。</li>
	<li>向每孔加入100 µL PBS-TBN。</li>
	<li>用铝箔封膜覆盖，于37 °C振荡2分钟。</li>
	<li>从振荡器上取下板子，移除封膜，按照上述步骤5.18.1–5.18.5所述，用流式分析仪读取每孔50 µL样本。</li>
</ol>
8. 转换为双报告基因中和实验
<ol>
	<li>使用如上步骤 7.1 所述的偶联微球。</li>
	<li>按照步骤 7.2 所述制备新鲜的多重微球混合液。</li>
	<li>将血清样本和 IgG 去除的阴性对照血清按 1:500 进行稀释，方法如下：
	<ol>
		<li>通过将 10 µL 血清加入 990 µL PBS-TBN 中，制备 1:100 的稀释液。</li>
		<li>将 1:100 的稀释液进一步稀释 5 倍：取 40 µL 的 1:100 稀释液加入 160 µL PBS-TBN 中。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>向 96 孔非结合微孔板的每个指定孔中加入 50 µL 多重微球混合液。</li>
	<li>向每孔中加入 25 µL 浓度为 2 µg/mL 的 ACE2 稀释液。</li>
	<li>用微孔板铝箔封膜覆盖，置于 37 °C 加热板式振荡器上，以 600 rpm 振荡孵育 2 分钟。</li>
	<li>从振荡器上取下微孔板，移除铝箔封膜。</li>
	<li>向指定孔中加入 25 µL 1:500 稀释的血清或 PBS-TBN。</li>
	<li>用铝箔封膜覆盖，置于 37 °C 加热板式振荡器上，以 600 rpm 振荡孵育 15 分钟。</li>
	<li>从振荡器上取下微孔板，置于磁性板分离器上 2 分钟，使微球与反应混合液分离。</li>
	<li>保持微孔板在磁体上，移除铝箔封膜，小心地将微孔板倒置于废液容器上方，轻轻弹击以去除各孔中的上清液。</li>
	<li>在保持微孔板处于磁体上的同时，用吸水纸轻拍微孔板底部以吸除残留液体。</li>
	<li>按以下方法清洗反应孔（第一次样品孵育后洗涤）：
	<ol>
		<li>将微孔板从磁体上取下，向每孔中加入 150 µL PBS-TBN。</li>
		<li>用新的铝箔封膜覆盖，于 37 °C 以 600 rpm 振荡 2 分钟。</li>
		<li>从振荡器上取下微孔板，置于磁性板分离器上 2 分钟，使微球与反应混合液分离。</li>
		<li>保持微孔板在磁体上，移除铝箔封膜，小心地将微孔板倒置于废液容器上方，轻轻弹击以去除各孔中的上清液。</li>
		<li>在保持微孔板处于磁体上的同时，用吸水纸轻拍微孔板底部以吸除残留液体。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>再次使用 PBS-TBN 清洗反应孔（第二次样品孵育后洗涤），操作与上述步骤 8.13.1–8.13.5 完全相同。</li>
	<li>将微孔板从磁体上取下。</li>
	<li>根据所需试剂组合制备新鲜的检测试剂混合液，并向每孔中加入 50 µL 或 100 µL。 
	注：由于储备试剂用量有限，含与 BV 报告染料偶联的抗人 IgG 的检测试剂混合液每孔使用 50 µL（参见材料表）。其他所有检测试剂混合液每孔使用 100 µL。</li>
	<li>用微孔板铝箔封膜覆盖，置于 37 °C 加热板式振荡器上，以 600 rpm 振荡孵育 15 分钟。</li>
	<li>从振荡器上取下微孔板，置于磁性板分离器上 2 分钟，使微球与反应混合液分离。</li>
	<li>保持微孔板在磁体上，移除铝箔封膜，小心地将微孔板倒置于废液容器上方，轻轻弹击以去除各孔中的上清液。</li>
	<li>在保持微孔板处于磁体上的同时，用吸水纸轻拍微孔板底部以吸除残留液体。</li>
	<li>按以下方法清洗反应孔（第一次检测抗体孵育后洗涤）：
	<ol>
		<li>将微孔板从磁体上取下，向每孔中加入 150 µL PBS-TBN。</li>
		<li>用新的铝箔封膜覆盖，于 37 °C 以 600 rpm 振荡 2 分钟。</li>
		<li>从振荡器上取下微孔板，置于磁性板分离器上 2 分钟，使微球与反应混合液分离。</li>
		<li>保持微孔板在磁体上，移除铝箔封膜，小心地将微孔板倒置于废液容器上方，轻轻弹击以去除各孔中的上清液。</li>
		<li>在保持微孔板处于磁体上的同时，用吸水纸轻拍微孔板底部以吸除残留液体。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>再次使用 PBS-TBN 清洗反应孔（第二次检测抗体孵育后洗涤），操作与上述步骤 8.21.1–8.21.5 完全相同。
	<ol>
		<li>将微孔板从磁体上取下，向每孔中加入 150 µL PBS-TBN。</li>
		<li>用新的铝箔封膜覆盖，于 37 °C 以 600 rpm 振荡 2 分钟。</li>
		<li>从振荡器上取下微孔板，置于磁性板分离器上 2 分钟，使微球与反应混合液分离。</li>
		<li>保持微孔板在磁体上，移除铝箔封膜，小心地将微孔板倒置于废液容器上方，轻轻弹击以去除各孔中的上清液。</li>
		<li>将微孔板从磁体上取下。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>向每孔中加入 100 µL PBS-TBN。</li>
	<li>用铝箔封膜覆盖，于 37 °C 振荡 2 分钟。</li>
	<li>从振荡器上取下微孔板，移除铝箔封膜，按照步骤 5.18.1–5.18.5 所述，用流式分析仪读取每孔 50 µL 的信号。</li>
</ol>

<ol><li>Cameron, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+multiplex+microsphere+IgG+assay+for+SARS-CoV-2+using+ACE2-mediated+inhibition+as+a+surrogate+for+neutralization%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Microbiology%22%5BJournal%5D)">A multiplex microsphere IgG assay for SARS-CoV-2 using ACE2-mediated inhibition as a surrogate for neutralization.</a> Journal of Clinical Microbiology. 59 (2), 02489(2020).</li>
<li>Waterboer, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiplex+human+papillomavirus+serology+based+on+in+situ-purified+glutathione+s-transferase+fusion+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Multiplex human papillomavirus serology based on in situ-purified glutathione s-transferase fusion proteins.</a> Clinical Chemistry. 51 (10), 1845-1853 (2005).</li>
<li>Pickering, J. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+multiplexed+fluorescent+microsphere+immunoassay+for+antibodies+to+pneumococcal+capsular+polysaccharides%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Clinical+Pathology%22%5BJournal%5D)">A multiplexed fluorescent microsphere immunoassay for antibodies to pneumococcal capsular polysaccharides.</a> American Journal of Clinical Pathology. 117 (4), 589-596 (2002).</li>
<li>Ayouba, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+sensitive+and+specific+serological+assay+based+on+Luminex+technology+for+detection+of+antibodies+to+Zaire+Ebola+virus%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Development of a sensitive and specific serological assay based on Luminex technology for detection of antibodies to Zaire Ebola virus.</a> Journal of Clinical Microbiology. 55 (1), 165-176 (2017).</li>
<li>Hornbeck, P., Fleisher, T. A., Papadopoulos, N. M. Isotype determination of antibodies. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aHornbeck%2C+P+%22Current+Protocols+in+Immunology%22">Current Protocols in Immunology</a>. Vastl, J. 116, 1-7 (2017).</li>
<li>Angeloni, S. Multiplex Bead Mixes Made Easy with an Excel-Based Bead Calculator. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.luminexcorp.com/blog/mmultiplex-bead-mixes-made-easy-with-an-excel-based-bead-calculator/">https://www.luminexcorp.com/blog/mmultiplex-bead-mixes-made-easy-with-an-excel-based-bead-calculator/</a> (2020).</li>
<li>EUA Authorized Serology Test Performance. FDA. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.fda.gov/medical-devices/coronavirus-disease-2019-covid-19-emergency-use-authorizations-medical-devices/eus-authorized-serology-test-performance">https://www.fda.gov/medical-devices/coronavirus-disease-2019-covid-19-emergency-use-authorizations-medical-devices/eus-authorized-serology-test-performance</a> (2020).</li>
<li>Indirect ELISA protocol. Abcam. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.abcam.com/ps/pdf/protocols/Indirect%20ELISA%20protocol.pdf">https://www.abcam.com/ps/pdf/protocols/Indirect%20ELISA%20protocol.pdf</a> (2021).</li>
<li>Baker, H. N., Murphy, R., Lopez, E., Garcia, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conversion+of+a+capture+ELISA+to+a+Luminex+xMAP+assay+using+a+multiplex+antibody+screening+method%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Conversion of a capture ELISA to a Luminex xMAP assay using a multiplex antibody screening method.</a> Journal of Visualized Experiments. (65), e4084(2012).</li>
<li>Pickering, J. W., Martins, T. B., Schroder, M. C., Hill, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+a+multiplex+flow+cytometric+assay+with+enzyme-linked+immunosorbent+assay+for+auantitation+of+antibodies+to+tetanus%2C+diphtheria%2C+and+Haemophilus+influenzae+Type+b%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+and+Diagnostic+Laboratory+Immunology%22%5BJournal%5D)">Comparison of a multiplex flow cytometric assay with enzyme-linked immunosorbent assay for auantitation of antibodies to tetanus, diphtheria, and Haemophilus influenzae Type b.</a> Clinical and Diagnostic Laboratory Immunology. 9 (4), 872-876 (2002).</li>
</ol>

Stephen Angeloni 和 Sherry Dunbar 是 Luminex Corporation 的员工，该公司生产了本研究中使用的一些试剂和仪器。&#160;本文的开放获取出版由 Luminex Corporation 资助

本研究拓展了一种多重荧光微球检测方法3Flex的功能，该方法可定性评估针对SARS-CoV-2感染的IgG免疫应答1。尽管目前许多针对COVID-19的血清学检测仅检测单一抗原，但该检测可同时评估S、RBD和Nc抗原，并包含内部抗体同种型对照7。此外，该方法使用ACE2作为指示剂，用于检测针对SARS-CoV-2的中和抗体滴度。
多抗原检测在未来可能特别有助于区分感染者与疫苗接种者的免疫反应。对于SARS-CoV-2，如果仅评估S蛋白和RBD抗体，则无法判断抗体反应是源于既往感染还是疫苗接种。目前所有在用的疫苗均未靶向Nc抗原，因此通过同时检测S/RBD和Nc抗原，可以区分既往病毒感染（Nc和S/RBD抗体阳性）与疫苗接种反应（仅S/RBD抗体阳性，Nc抗体阴性）。
在本研究中，3Flex 血清学和中和试验（第5和第6节）已转移至一种新型双报告基因流式分析仪器（第7和第8节）。基于微球的多重检测的典型免疫测定方案与标准ELISA方案相似，均遵循类似的步骤，包括样本孵育、检测抗体/报告分子孵育以及结果分析8。先前的研究也已证明，标准ELISA检测可成功转移至基于微球的多重检测平台9。
检测方案可从之前的单报告基因仪器无缝转移至新的双报告基因系统，测试样本和对照的结果证实了这一点（图4 和 图5）。在血清学检测中，所有阳性血清样本均表现出典型的剂量依赖性信号下降，该下降与样本稀释倍数增加及检测抗体浓度降低相对应，而阴性样本的信号则保持在背景水平。类似地，在中和检测中，S蛋白和RBD的信号随ACE2竞争物浓度的增加而降低，而Nc蛋白的信号则无此变化；相比之下，经IgG去除处理的血清在加入ACE2后信号变化较小。将磁珠与ACE2预先孵育2分钟后再加入血清样本（如第6和第8节所述），与将磁珠、ACE2和血清同时混合的方法进行了比较，结果显示两者差异不大（数据未显示）。然而，由于采用磁珠与ACE2预孵育步骤所得结果更为一致，因此该步骤被最终确定为中和检测方案的正式操作流程（第6和第8节）。
由于双报告系统引入了第二个荧光报告通道，因此将两种检测方法均改造为分型检测，以同时测量IgG和IgM反应。流式分析仪的双报告功能可在每个样本的多重检测中，针对每种分析物收集两种报告检测试剂的荧光信号，从而有效使每个样本在单次检测中产生的数据量翻倍。为开发和优化双报告检测方案，评估了多种市售的报告染料和检测抗体在新RP2通道中的表现（图7 和 图8），以确定当前可用的最佳选项。与DL 405报告染料偶联的抗IgM抗体在RP2通道中表现不佳（图7），因此后续评估了生物素标记的抗IgG抗体联合SASB在RP2通道中的检测效果（图8）。在双报告中和检测中，比较了三种RP1与RP2检测试剂的组合（表1 和 图9），以确定同时检测IgG和IgM中和抗体的最佳组合。尽管在使用PE-抗IgM的RP1通道与使用DL 549-抗IgM的RP2通道之间，信号强度存在显著差异，但在ACE2的结合抑制率测定结果上并无显著差异。
目前的方法和本研究存在若干局限性。首先，方法开发和优化过程中测试和使用的样本数量仅限于8至11个样本。在后续扩大研究中将测试更多样本，以验证该方法是否已完全优化。其次，所测试的报告荧光染料及报告染料组合数量有限。未来需对所有可用报告染料进行所有可能组合的进一步测试，以确定哪些试剂可在本方法中成功应用。实验中使用的与生物素偶联的抗IgG抗体不同于与BV 421报告染料偶联的抗IgG抗体。因此，尽管BV 421标记的抗IgG信号强度存在变异，但这种差异可能源于抗体特异性，而非报告染料本身所致。测试其他可用的BV 421偶联抗体，可能发现另一种在RP2通道中表现良好的抗体。后续研究还将评估PE标记的抗IgM与BV 421标记的抗人IgG组合，分别用于RP1和RP2通道的检测。最后，尽管仪器具备双报告通道功能，但每个反应仅限检测两种同种型（两个参数）。若需检测更多同种型或实现完整的同种型分析，则需在不同孔中使用相同的两个报告通道进行额外的独立反应。
基于微球的多重检测技术可实现快速灵活的实验设计，并易于整合到常规实验室工作流程中3,4,10。本研究展示了将先前描述的SARS-CoV-2 3Flex血清学和中和抗体检测方法转移至流式分析系统的过程简便性：使用单一报告分子可检测IgG，或经轻微修改后，利用两种报告分子同时检测IgG和IgM反应。与单报告分子平台相比，双报告分子方案具有明显优势，因其可在反应孔数量减半、样本用量减半的情况下，获得每样本两倍的数据量。通过选用合适的报告荧光染料和检测抗体，可在双报告分子流式分析仪上轻松开发并执行分型检测。

新型冠状病毒肺炎（COVID-19）大流行凸显了快速开发和实施快速、高通量、高性能血清学检测方法的重要性，这类方法可用于新发病原体（如SARS-CoV-2）的诊断与监测。多重血清学检测在大流行期间具有极高价值，因其可同时分析针对多种抗原的抗体，从而实现广泛的病原体覆盖，并控制病原体本身及宿主感染应答中的变异性。近期已有研究报道了一种基于荧光微球的多重检测方法——SARS-CoV-2 IgG 3Flex（3Flex），该方法可检测针对SARS-CoV-2刺突（S）蛋白、刺突蛋白与血管紧张素转换酶2（ACE2）受体结合域（RBD）以及核衣壳（Nc）蛋白的抗体1。研究表明，3Flex在症状出现后≥21天采集的血清样本中，其性能与参考的SARS-CoV-2 IgG检测相当；而在症状出现后≤5天采集的样本中，其灵敏度更高。此外，在中和实验体系中，通过使用可溶性ACE2证实了其对S和RBD抗原抗体结合的抑制作用。基于微球的多重检测技术已被广泛采纳为一种成熟的多重血清学检测平台，在大规模筛查中具有明显优势，包括结果出具时间短、样本需求量小以及人力成本降低2,3,4。
近期，一种新型流式分析仪器已投入使用，该仪器具备先前研究中所展示系统相同的高重数、高通量能力1，并新增了两个报告通道的优势。在单个反应中同时检测两种荧光报告信号的能力，使得每个样本的每种分析物可获得两项检测结果，特别适用于通常需在不同反应孔中分别进行的同种型检测应用5。双报告通道功能可在一半数量的反应孔中、使用一半的样本体积，获得每个样本两倍的数据，因此相较于单报告系统具有明显优势。本研究详细阐述了标准血清学检测方案，并描述了其向中和检测的转化过程。此外，本文还介绍了将单报告检测转化为双报告血清学检测，进而转化为双报告中和检测的方法，以同时测定针对SARS-CoV-2 S蛋白、RBD及Nc抗原的IgG和IgM同种型中和抗体。检测流程的可视化概览见图1。

<table><tbody><tr><td>ACE2（人源）（重组）</td><td>AdipoGen Life Sciences</td><td>AG-40B-0192-3050</td><td></td></tr><tr><td>生物素-SP（长间隔）AffiniPure 山羊抗人 IgG，Fc&amp;gamma; 片段特异性</td><td>Jackson ImmunoResearch Laboratories</td><td>109-065-098</td><td></td></tr><tr><td>牛血清白蛋白</td><td>MilliporeSigma</td><td>A7888</td><td>Sigma-Aldrich</td></tr><tr><td>Branson 1800 清洗/水浴超声仪</td><td>Various</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Brilliant Violet 421 AffiniPure 驴抗人 IgG（H+L）</td><td>Jackson ImmunoResearch Laboratories</td><td>709-675-149</td><td></td></tr><tr><td>Corning 96 孔黑色平底聚苯乙烯 NBS 微孔板</td><td>Corning</td><td>3650</td><td></td></tr><tr><td>Corning 96 孔微孔板铝封膜（非无菌）</td><td>Corning</td><td>6570</td><td></td></tr><tr><td>DyLight 405 AffiniPure 山羊抗人 IgM，Fc5&amp;mu;&amp;nbsp;片段特异性</td><td>Jackson ImmunoResearch Laboratories</td><td>109-475-043</td><td></td></tr><tr><td>DyLight 549 AffiniPure F(ab')&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; 山羊抗人 IgM Fc5&amp;mu; 特异性</td><td>Jackson ImmunoResearch Laboratories</td><td>109-506-129</td><td>已停产，但可从多个供应商处获得</td></tr><tr><td>eBioscience 链霉亲和素 Super Bright 436 偶联物</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>62-4317-82</td><td></td></tr><tr><td>Fisherbrand 微孔板孵育振荡器</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>02-217-757</td><td>Fisher Scientific</td></tr><tr><td>山羊抗兔 IgG（H+L）交叉吸附二抗，PE 标记</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>P-2771MP</td><td></td></tr><tr><td>Luminex 磁性微孔板分离器</td><td>Luminex Corporation</td><td>CN-0269-01</td><td></td></tr><tr><td>MagPlex 微球</td><td>Luminex Corporation</td><td>MC100XX-ID</td><td></td></tr><tr><td>PE AffiniPure F(ab')&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; 山羊抗人 IgM Fc5&amp;mu; 特异性</td><td>Jackson ImmunoResearch Laboratories</td><td>109-116-129</td><td></td></tr><tr><td>磷酸盐缓冲液</td><td>MilliporeSigma</td><td>P3813</td><td>Sigma-Aldrich</td></tr><tr><td>SARS 核衣壳蛋白抗体</td><td>Novos Biologicals</td><td>NB100-56683</td><td>未偶联，兔源，多克隆，Protein G 纯化</td></tr><tr><td>SARS 核衣壳蛋白抗体</td><td>Novos Biologicals</td><td>NB100-56049</td><td>未偶联，兔源，多克隆，Protein A 纯化</td></tr><tr><td>SARS 刺突蛋白抗体</td><td>Novos Biologicals</td><td>NB100-56047</td><td>未偶联，兔源，多克隆，Protein G 纯化</td></tr><tr><td>SARS 刺突蛋白抗体</td><td>Novos Biologicals</td><td>NB100-56048</td><td>未偶联，兔源，多克隆，Protein G 纯化</td></tr><tr><td>SARS-CoV-2（2019-nCoV）刺突蛋白 S1 抗体，兔单克隆抗体</td><td>SinoBiological</td><td>40150-R007</td><td></td></tr><tr><td>叠氮化钠</td><td>MilliporeSigma</td><td>S2002</td><td>Sigma-Aldrich</td></tr><tr><td>链霉亲和素-R-藻红蛋白偶联物（SAPE）</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>S21388</td><td>优级品</td></tr><tr><td>试管旋转混合仪</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>88881001</td><td></td></tr><tr><td>TWEEN 20</td><td>MilliporeSigma</td><td>P9416</td><td>Sigma-Aldrich</td></tr><tr><td>xMAP 抗体偶联试剂盒</td><td>Luminex Corporation</td><td>40-50016</td><td></td></tr><tr><td>xMAP INTELLIFLEX DR-SE</td><td>Luminex Corporation</td><td>INTELLIFLEX-DRSE-RUO</td><td></td></tr></tbody></table>

一种用于多重微球流式分析系统的快速、多重双报告基因igg和igm sars-cov-2中和检测方法

A Rapid, Multiplex Dual Reporter IgG and IgM SARS-CoV-2 Neutralization Assay for a Multiplexed Bead-Based Flow Analysis System

新型冠状病毒肺炎（COVID-19）大流行凸显了对新型病原体（如SARS-CoV-2）进行快速、高通量、高灵敏度和高特异性血清学检测方法的迫切需求。多重血清学检测具有显著优势，因其可同时分析针对多种抗原的抗体，从而优化病原体覆盖范围，并控制病原体变异及个体宿主反应差异带来的影响。本文介绍一种基于荧光微球的SARS-CoV-2 IgG三重检测方法，可同时检测针对三种主要SARS-CoV-2抗原的IgM和IgG抗体，即刺突（S）蛋白、刺突蛋白与血管紧张素转换酶2（ACE2）受体结合域（RBD）以及核衣壳（Nc）蛋白。该检测方法在症状出现21天及以上采集的血清样本中，IgG检测性能与SARS-CoV-2参考检测方法相当；而在症状出现5天内采集的样本中，其灵敏度更高。此外，采用可溶性ACE2进行中和检测时，证实了抗体对S蛋白和RBD的结合可被有效抑制。

单报告分子血清学检测的优化。 
所有 SARS-CoV-2 抗原的偶联策略已在 Cameron 等人，20201 以及上述步骤 2.1 中描述。偶联确认策略在上述步骤 2.3 中说明。为实现高效偶联，中位荧光强度（MFI）值应显著高于无血清/无抗体阴性对照反应，并且随着检测试剂用量减少，MFI 信号应呈现剂量依赖性下降。通常，MFI 信号比背景 MFI 高约 1,000 MFI 单位或以上，表明蛋白偶联效率良好，且该结果依赖于所用检测试剂的浓度和特异性。采用该方法，对两批微球进行了 S、RBD 和 Nc 抗原偶联情况的检测（图 2）。所有抗原的 MFI 信号均显著高于背景 MFI，并在检测试剂梯度稀释时表现出剂量反应关系。数据还显示，两批偶联微球之间的 MFI 水平具有良好的重复性。
单报告基因检测的优化方法如 Cameron 等人 2020 年所述1。每种抗原均以不同的包被浓度进行测试，并使用代表高、中、低及阴性水平的多个血清样本进行不同稀释度检测。此外，由于该检测用于测定 IgG 滴度，因此还使用经 IgG 去除处理的血清作为额外的阴性对照样本。不同抗原包被水平下代表性样本稀释系列的结果如图 3所示。该初步稀释系列实验采用固定浓度的检测试剂，以获得代表性的抗原特异性信号及背景 MFI 水平的可能范围。根据这些数据，进一步确定并测试了额外的样本稀释范围和抗原包被水平（数据未显示）。
接下来，针对不同的血清稀释度和抗原偶联水平，优化了检测试剂的浓度。图中展示了使用6个阳性样本和2个阴性样本的代表性数据 图4在对数百份新冠流行前的阴性血清样本进行额外测试后，最终确定了最佳抗原偶联水平和检测试剂浓度，并据此制定了最终的检测方案，详见第5节。
转化为单报告基因中和试验 
通过在加入血清样本之前，使用ACE2（作为竞争性试剂）与磁珠进行孵育，可将单报告基因血清学检测转化为中和试验。通过滴定所添加ACE2的量，可观察到IgG与S蛋白和RBD抗原结合受到抑制，如图5所示。尽管11份患者血清中IgG滴度各不相同，但随着ACE2浓度增加，每份血清的MFI信号均显著降低。与预期一致，ACE2仅影响S蛋白和RBD的MFI信号，而对Nc抗原无影响。
相对于残余MFI信号的百分比 0 µg/mL 所有样品的 ACE2 表达情况如图所示 图6对于大多数样品，会出现信号损失 &gt;随着ACE2浓度的增加，S蛋白和RBD的信号分别增加了30%。与预期一致，ACE2对Nc信号无影响。
转化为双报告基因IgG和IgM血清学检测方法 
在双报告基因IgG和IgM检测中，采用标准的单报告基因检测条件，测试了两种报告基因通道中不同抗体与报告分子的组合。RP1通道与以往的流式分析仪器类似，可检测PE等报告染料的“橙色”荧光。第二个通道RP2则采用紫色激发激光，用于检测在402 nm激发、发射光谱峰值位于421–441 nm范围内的染料所发出的“蓝色”荧光。
测试了多种不同浓度的抗人IgG和IgM抗体组合，样本稀释倍数为标准的2,000倍，孵育条件详见第6节。初步测试使用与DyLight 405报告染料（DL 405；激发波长400 nm，发射波长420 nm）偶联的抗IgM抗体作为RP2通道检测试剂，检测一组包含11份PCR阳性样本（病程从5天至>60天不等）以及一份IgG去除血清样本。该检测试剂在RP2通道未产生强信号，如图7A、B、C所示。对于IgM RP2 MFI较高的样本，RBD和Nc抗原的信号最强（图7B、C）。尽管部分样本在此阶段IgM滴度应有所升高，但使用IgM检测试剂时，观察到的MFI值并未超过140 MFI单位。此外，与相同浓度下使用的PE标记抗IgM RP1报告试剂相比，采用DL 405偶联抗IgM时，IgM对照微球的MFI动态范围显著不足（图7D）。
由于缺乏适用于IgM的合适RP2报告标记检测试剂，因此测试了原始的生物素标记抗IgG抗体与SASB联用在RP2通道中的应用效果。使用SASB时，IgG在RP2通道中的信号动态范围虽不及SAPE，但仍具有适合检测S、RBD和Nc特异性IgG滴度的范围（图8）。这些结果促使我们进一步测试了不同的RP1 IgM和RP2 IgG检测试剂组合，如下所述。
转换为双报告基因中和试验 
通过在添加血清样本之前增加一步与ACE2和磁珠的孵育，将双报告基因血清学检测转换为中和试验。使用起始浓度为16 µg/ml的ACE2进行2倍系列稀释，并按照上述方法对11个样本组及去抗体血清进行检测。此外，还测试了三种不同的RP1 IgM和RP2 IgG检测抗体组合，所用样本组包括11个样本及去抗体血清对照。最终确定的最佳组合及试剂浓度详见表1。
在IgG检测中，测试了原始单报告分子检测中使用的生物素标记抗人IgG/SASB以及另一种与BV报告染料偶联的抗IgG。尽管BV偶联物在RP2上的MFI信号较高，但其IgG滴度的MFI信号强度在不同ACE2滴定浓度下存在差异（图9A、C、E）。与BV偶联物相比，生物素标记抗人IgG/SASB组合在ACE2滴定过程中表现出更一致的MFI信号下降趋势，显示出剂量反应关系，尽管其MFI信号水平较低。此外，BV偶联物在不同ACE2浓度下的信号波动也干扰了在不同IgG滴度范围内准确评估ACE2抑制率的能力，而生物素标记抗人IgG/SASB组合则无此问题（图9B、D、F）。对于MFI信号较低的样本（如DFSO 3样本），其滴度不足以评估这些试剂的性能或测定IgG的中和能力。
为确定RP1通道中的IgM滴度，将PE标记的抗IgM抗体与DyLight 549报告染料（DL 549；激发波长562 nm，发射波长576 nm）标记的抗人IgM抗体在表1所列浓度下进行了比较。在这两种试剂中，PE标记的抗IgM在所测试样本中产生的平均荧光强度（MFI）高于DL 549标记的抗人IgM（图9A、C、E）。用于检测试剂添加情况的IgM对照微球，其平均MFI分别为：PE标记抗IgM约17,000，DL 549结合物为2,723。尽管存在这些差异，使用DL 549结合物仍可检测到不同ACE2浓度对MFI的影响。在测定ACE2对IgM结合的抑制百分率时，两种IgM检测试剂之间差异微小且无统计学意义（图9B、D、F）。
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td rowspan="2">组合</td>
			<td rowspan="2">报告分子</td>
			<td colspan="2">孔中终浓度 (µg/mL)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RP1</td>
			<td>RP2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="3">1</td>
			<td>PE 抗 IgM</td>
			<td>2</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>生物素标记 Ig</td>
			<td>-</td>
			<td>0.62</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SASB</td>
			<td>-</td>
			<td>4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="2">2</td>
			<td>DyLight 549 抗人 IgM</td>
			<td>1</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brilliant Violet 421 抗人 IgG</td>
			<td>-</td>
			<td>1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="3">3</td>
			<td>DyLight 549 抗人 IgM</td>
			<td>1</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>生物素标记 Ig</td>
			<td>-</td>
			<td>0.62</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SASB</td>
			<td>-</td>
			<td>4</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表1：测试的RP1和RP2报告染料组合列表。评估了多种不同的RP1和RP2报告染料，用于检测IgG和IgM滴度。上述三种组合在不同的RP1检测模式下进行了测试，并用于中和实验的优化。对于使用SASB的RP2组合，显示了生物素化检测抗体和SASB的浓度。*终浓度表示在反应孔中的最终浓度。
<img alt="血清学与中和试验流程图，展示步骤及样品制备过程。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62487/62487fig01.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图1"> 
图1：突出显示主要检测方案步骤的流程图。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62487/62487fig01large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="S、RBD、Nc 偶联确认柱状图；蛋白质相互作用分析；稀释度与 MFI 结果。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62487/62487fig02.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Figure 2"> 
图 2：抗原偶联的确认。 抗原以每 106 个微球 100、10 和 1 pmol 的浓度进行偶联。对于 S 和 RBD 抗原，使用兔抗 S 血清，并用 PE 标记的抗兔 IgG 进行检测。对于 Nc 抗原，使用 Protein G 纯化的兔多克隆抗 Nc 抗体。图中显示了以 10 pmol S 偶联的微球（A）、100 pmol RBD 偶联的微球（B）以及 100 pmol Nc 偶联的微球（C）的滴定曲线。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62487/62487fig02large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="偶联优化柱状图；稀释度与MFI；高/中/低血清水平；实验结果。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62487/62487fig03.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图3"> 
图3：不同抗原偶联水平下血清稀释度的优化。 使用不同 pmol 抗原/106 微球的偶联条件，检测了代表高、中、低及阴性水平的血清样本。采用第5节所述检测方案，对四倍梯度稀释的血清样本使用多种偶联抗原微球混合物进行检测。图中显示了S（A）、RBD（B）和Nc（C）抗原的滴定曲线对应的MFI值。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62487/62487fig03large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="样本/检测试剂优化柱状图；μg/mL 检测抗体水平。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62487/62487fig04.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图 4"> 
图 4：最佳血清稀释度和检测试剂浓度的确定。 对8份血清样本（包括2份阴性患者样本和6份低至高阳性的样本）在不同血清稀释度下，使用三种不同浓度的检测试剂进行了检测。S（A）、RBD（B）和Nc（C）的MFI结果如图所示。根据本实验及其他未展示的数据，最终选定血清稀释度为1:2,000，生物素化检测抗体浓度为0.62 µg/mL。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62487/62487fig04large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="中和作用优化曲线图；血清比较与ACE2结合；实验结果图表。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62487/62487fig05.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图5"> 
图5：单报告基因中和试验的优化。 如第6节所述，通过添加以ACE2作为竞争物的孵育步骤，将单报告基因血清学检测方法改进为中和抗体检测方法。采用标准检测条件，对一组共11份样本（涵盖低至高滴度阳性的血清）以及一份IgG条带型血清样本进行检测，ACE2浓度从4 µg/mL开始进行两倍系列稀释。在此ACE2浓度范围内，S抗原（A）和RBD抗原（B）的MFI值随ACE2浓度增加而降低，但Nc抗原（C）无此现象。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62487/62487fig05large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="血清分析中ACE2介导的S、RBD、Nc抑制信号的柱状图比较。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62487/62487fig06.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图6"> 
图6：ACE2存在下的信号抑制百分比。 显示了11个样本（来自图4）的残余信号百分比。对于每个样本，无论其IgG滴度如何，在最高ACE2浓度下，S抗原（A）和RBD抗原（B）的MFI信号最大降低均达到≥30%。而对于Nc抗原（C），在所测试的任何浓度ACE2下均未观察到显著的信号抑制。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62487/62487fig06large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="IgM检测的ELISA结果；柱状图显示了各种条件和对照下的信号数据。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62487/62487fig07.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图7"> 
图7：使用DyLight 405标记的抗IgM作为RP2 IgM检测试剂的测试结果。 采用一组11个样本及IgG去除血清，测试DL 405标记的抗IgM作为RP2检测试剂的效果。图中显示了S（A）、RBD（B）和Nc（C）的RP2 IgM MFI信号。在所有抗原和样本中，RBD与样本H组合产生的MFI信号最高，约为140 MFI单位（B）。即使在IgM对照微球组上，RP2通道在整个抗体滴度范围内的信号也低于1,000 MFI，且未表现出在RP1通道中使用PE标记抗IgM检测抗体时所观察到的动态范围增加现象（D）。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62487/62487fig07large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="血清样本中S IgG、RBD IgG和Nc IgG信号的比较图；μg/mL SASB；RP2 MFI" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62487/62487fig08.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Figure 8"> 
图8：使用Biotin anti-IgG作为RP2报告分子优化SASB。 采用一组11个样本及IgG去除血清，测试在标准0.62 µg/mL Biotin anti-IgG条件下SASB的系列稀释效果。结果显示了S（A）、RBD（B）和Nc（C）在RP2通道中的IgG MFI值。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62487/62487fig08large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="数据分 析图表，带颜色编码结果的六面板电子表格对比，科研分析。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62487/62487fig09.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图9"> 
图9三种不同RP1 IgM与RP1 IgG检测混合物组合的比较 测试了三种不同的检测抗体混合物，对象为11个样本及IgG去除血清。所使用的组合及终浓度详见 表1所有样品均采用2倍稀释的ACE2进行检测，起始浓度为 16 µg/mLDFS0 为 3、12 和 30 天的样本数据如图所示。RP1 IgM（橙色）和 RP2 IgG（蓝色）的 MFI 信号如图所示。 A (DFSO 3) C （DFSO 12），以及 E （DFSO 30）。ACE2 百分比残余 MFI 显示如下 B (DFSO 3) D （DFSO 12），以及 F （DFSO 30）。代表一个的信号 &gt;与无 ACE2 对照组相比减少 30% 的结果以浅绿色突出显示。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62487/62487fig09large.jpg" target="_blank">请点击此处以查看此图的放大版本。</a>

采用一种用于基于微球的多重检测的流式分析系统，该系统提供双报告信号读出，用于开发多重血清学和抗体中和检测方法，可同时检测SARS-CoV-2的中和性IgG和IgM抗体。

一种用于多重微球流式分析系统的快速、多重双报告基因IgG和IgM SARS-CoV-2中和检测方法

新型冠状病毒肺炎（COVID-19）大流行凸显了对快速、高通量、高灵敏度和高特异性血清学检测新发病原体感染方法的迫切需求……

据我们所知，这是首个采用两种报告信号同时检测每种分析物两项结果的基于微球的多重检测方案。该技术使用户能够同时测定抗原特异性的IgM和IgG，所需样本量更少，且检测时间更短。尽管这种双报告信号方法目前专用于抗体亚型鉴定，但其也可被改进用于检测其他成对分析物，例如翻译后修饰或游离与结合态药物形式。今天为我们演示实验步骤的是 Luminex Corporation 的高级现场应用科学家 Steve Angeloni 博士。开始进行双重报告基因 IgG 和 IgM 血清学检测时，需从单独的偶联微球和对照微球储备液中配制所需的多重微球混合液，浓度为每毫升 1 × 10⁶ 个微球。接下来，将血清样本用 PBS-TBN 缓冲液进行 100 倍稀释，即在 990 微升 PBS-TBN 缓冲液中加入 10 微升血清；然后再进行 10 倍稀释，即取 20 微升 1:100 稀释液加入 180 微升 PBS-TBN 缓冲液中。当磁珠混合物和血清样本准备就绪后，将50 µL多重磁珠混合物加入指定的96孔非结合微孔板孔中，然后向相应的孔中加入50 µL稀释后的血清样本。所有样本加样完成后，用微孔板铝箔封膜覆盖，并在37°C的加热板振荡器中孵育15分钟。随后，将微孔板置于磁性板分离器上2分钟，使磁珠与反应混合物分离。将培养板保持在磁铁上，移去封口箔膜。然后小心地将培养板倒置在废液容器上方，轻轻弹动以弃去孔中的上清液。在仍将培养板置于磁铁上的同时，用吸水纸轻压培养板进行吸液。为清洗反应孔，将酶标板从磁板架上取下，向每孔加入150微升PBS-TBN。用新的铝箔封膜覆盖酶标板，置于加热振荡器上孵育2分钟，然后放回磁板架上再静置2分钟。保持酶标板始终置于磁板架上，将其倒置以弃去上清液，并在吸水纸上轻拍酶标板以去除残留液体。第二次 PBS-TBN 洗涤后，将板从磁铁上取下，并向每个孔中加入 100 微升新鲜的检测试剂混合液。用微孔板铝箔封膜覆盖板后，将其置于加热振荡仪上孵育 15 分钟，随后置于磁性板分离器上 2 分钟。当板处于磁铁上时，将板倒置在废液容器上方，弃去检测试剂混合液，并在吸水纸上轻拍以吸干残留液体。用 PBS-TBN 缓冲液洗涤反应孔，重复两次，操作如前所述，然后将反应板从磁铁上取下。向每孔加入 100 µL PBS-TBN 缓冲液，用铝箔封膜覆盖反应板，在 37°C 下振荡孵育 2 分钟。移除铝箔封膜，随后在流式分析仪中读取每孔 50 µL 样品。读取酶标板时，选择左上角的下拉菜单，进入“板配置”（Plate Configuration），加载先前配置好的酶标板，然后选择“运行板”（Run Plate）。点击“弹出”（Eject）图标将板架弹出，将酶标板放入板架中，再点击“收回”（Retract）图标以收回板架。当板架完全进入分析仪后，点击“运行”（Run）图标开始读取酶标板。对于双报告基因中和实验，将50微升多重微球混合物加入指定的96孔非结合微孔板孔中，然后向每孔加入25微升浓度为每毫升2微克的ACE2，并用铝箔封膜覆盖板孔。在加热平板振荡器上孵育2分钟后，向指定孔中加入25微升1:500稀释的血清。待所有样品加入后，按照血清学实验 previously demonstrated 的孵育、洗涤、检测和分析步骤进行操作。使用发病后5至60天内的血清样本以及IgG条带血清样本，对与DyLight 405报告染料偶联的抗IgM进行检测，结果显示刺突抗原未产生高信号。对于IgM中等荧光强度较高的样本，受体结合域和核衣壳抗原的信号最强。尽管部分样本中的IgM滴度应有所升高，但观察到的中等荧光强度水平并未超过140 MFI单位。此外，在使用与抗 IgM 抗体偶联的 DyLight 405 时，IgM 的对照微球在中位荧光强度上缺乏显著的动态范围，而相同浓度下使用藻红蛋白标记的抗 IgM 抗体则表现较好。对于 IgG 的检测，与荧光染料 Super Bright 436 的链霉亲和素偶联物相比， Brilliant Violet 偶联物具有更高的中位荧光强度信号。然而，Brilliant Violet 偶联物的信号强度在 ACE2 滴定过程中存在波动。这种由明亮紫色偶联物在不同ACE2浓度下产生的信号波动，也干扰了在IgG滴度范围内确定ACE2对结合的抑制百分比。在IgM检测中，藻红蛋白标记的抗IgM抗体产生的信号高于DyLight 549标记的抗人IgM抗体。在测定ACE2对IgM结合的抑制百分比时，这两种IgM检测试剂之间存在轻微但无统计学意义的差异。因此，该实验步骤中最关键的环节之一是从单个微球储备液中正确配制多重微球混合液，并确保操作无误。该方法还可用于评估疫苗的有效性，并监测针对其他病原体的免疫应答。

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免疫学与感染

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