基于HiBiT生物报告系统的SARS-CoV-2受体结合域抗体检测 SARS-CoV-2, 受体结合域, 抗体检测, HiBiT, 生物报告系统, 免疫分析, 发光检测, 血清学检测, 病毒中和抗体, 体外检测

我的实验室一直致力于 COVID-19 的研究，近期开发出一种新型检测方法，可快速、准确地检测 SARS-CoV-2 抗体。本方案概述了一种高通量检测患者血清样本中抗 SARS-CoV-2 抗体的方法，在当前大流行的背景下，这一方法至关重要。目前大多数血清学检测方法在灵敏度和速度之间难以兼顾，往往牺牲其一。

我们的数据表明，该检测方法既灵敏又具有快速的响应时间。为了生产足量的高HiBiT-RBD生物报告分子，请首先准备细胞培养。第一步，配制含有10%胎牛血清和1%青霉素-链霉素的完全杜尔贝科改良伊格尔培养基。

然后将培养基置于37摄氏度水浴中预热。打开生物安全柜，并使用70%乙醇对柜内表面进行消毒。培养细胞系时，从-80摄氏度冰箱或液氮中取出细胞，于37摄氏度水浴中快速解冻。

将解冻的细胞与至少10毫升完全培养基混合。用移液器将细胞悬液加入一个15厘米的培养皿中，并轻轻晃动培养皿使细胞均匀分布。将培养皿置于37摄氏度、5%二氧化碳、85%至95%湿度的细胞培养孵箱中。

在显微镜下观察细胞，直至细胞融合度达到80%至90%。当细胞融合度较高时，移除培养基，用预温的PBS洗涤细胞，并加入3至5毫升0.25%胰蛋白酶-EDTA溶液，使细胞从培养表面脱落。约5分钟后，在显微镜下观察细胞。若所有细胞均已悬浮，加入至少4毫升培养基，将细胞悬液转移至新的无菌离心管中。

使用血细胞计数板对细胞进行计数，并将一百万个细胞加入六孔板的每个孔中用于转染。转染HiBiT-RBD质粒时，使用一微克HiBiT-RBD表达质粒与适当的转染试剂。室温孵育10至15分钟，然后将总体积逐滴加入到六孔板的每个孔中。

第二天，将含有转染混合物的培养基更换为完全培养基。转染后48小时观察转染对照孔。用1.5毫升微量离心管收集上清液。

向细胞中加入 500 微升 1× 被动裂解缓冲液（PLB），然后在室温下孵育并振荡培养板 15 分钟，以实现细胞裂解。接下来，为了使用荧光素酶检测法评估生物报告系统的发光信号，首先准备反应组分，并以裂解后的上清液作为生物报告系统的来源。使用前将大片段 BiT 和底物稀释至 1×。

从每个孔或试管中转移50微升上清液至96孔板中，每孔加入50微升1X大BiT。室温孵育5分钟。打开化学发光仪软件，每孔加入50微升1X底物，将板放入化学发光仪中并运行软件。

为了进行 HiBiT-RBD 抗体检测实验，按先前所述方法制备 HiBiT-RBD 生物报告分子，并将含有 HiBiT-RBD 的上清液 50 微升与 1 微克市售 SARS-CoV-2 RBD 抗体在 1.5 毫升微量离心管中混合。向溶液中加入 20 微升免疫球蛋白结合蛋白或 Protein G。用 PBS 补足总体积至 300 微升。

将离心管置于摇床或旋转仪上孵育30分钟。在12,000 G条件下离心30秒。弃去上清液，并用PBS洗涤。

重复该步骤三次，以去除游离的 HiBiT-RBD。将细胞重悬于 50 微升 PBS 中，并转移至 96 孔板。加入 50 微升 1X 大型 BiT，静置五分钟。

然后每孔加入 50 µL 1× NanoLuc 底物，立即使用发光仪读取发光信号。为进行高通量检测，可制备较大量 HiBiT-RBD 生物报告分子，并在 96 孔板的每个孔中，将 20 µL 磁性 Protein G 与 50 µL HiBiT-RBD 上清液混合，每份样品对应一孔。

向每个孔中加入10微升血清样本，并加入PBS使总体积达到150微升。在室温下于摇床上孵育30分钟。然后将板置于磁力洗涤仪上，使Protein G抗体复合物沉淀。

弃去每个孔中间部分的溶液，加入 PBS 进行洗涤。重复洗涤步骤至少三次，以去除过量的 HiBiT-RBD。每孔加入 50 微升 1× PBS 和 50 微升 1× 大型 BiT，室温孵育至少五分钟。

准备化学发光仪软件。然后加入 50 µL 的 1X 底物。将酶标板放入仪器中，运行软件并记录信号。

比较血清样本、对照样本以及空孔的背景信号。记录转染细胞中含有HiBiT-RBD的细胞裂解液和上清液的信号，以评估合适的蛋白来源。数据显示，当两部分合并时，背景信号较低，而特异性信号较强。

加入Protein G有助于抗体沉淀。该实验用于比较商业化的SARS-CoV-2中和抗体与对照IgG的信号。特异性抗体信号较强，而对照抗体信号接近发光背景水平。

使用在M蛋白第51位点发生突变并表达外源性RBD的重组减毒溶瘤型水泡性口炎病毒（VSV）对小鼠进行免疫。采集免疫后小鼠的血清，其检测信号显著强于注射对照VSV小鼠的血清（后者无信号）。该方案可用于检测患者血清样本中的SARS-CoV-2抗体。

在使用Protein G孵育后的洗涤步骤对于降低背景信号至关重要。此外，应尽快加入底物，以避免信号损失。通过增加若干额外的优化步骤，该检测方法也可用于分析血液样本，可能成为检测患者血液中抗SARS-CoV-2抗体的有效方法。