Name: 使用基于HiBiT的生物报告器检测SARS-CoV-2受体结合域抗体 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-08-12T13:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 44 s
Description: 了解基于HiBiT的生物报告器检测SARS-CoV-2受体结合域抗体的高通量方法。该技术结合快速响应与高灵敏度，适用于患者血清样本的大规模检测，为COVID-19血清学研究提供可靠工具。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

我们衷心感谢何晓红、Ricardo Marius、Julia Petryk、Bradley Austin 和 Christiano Tanese De Souza 提供的技术支持。同时感谢 Mina Ghahremani 提供的平面设计工作。我们还要感谢所有参与本研究并捐献血液样本的志愿者。DWC 的研究工作部分由渥太华大学医学院及其内科系提供支持。

注意：以下所述方案符合伦理指南，方案编号为 20200371-01H。
1. HiBiT-RBD 生物报告系统的制备与评价
<ol>
	<li>生产足量的HiBiT-RBD生物报告分子
	<ol>
		<li>准备细胞培养
		<ol>
			<li>配制完全杜尔贝科改良伊格尔培养基（DMEM），其中含10%胎牛血清和1%青霉素/链霉素。随后将培养基置于37 °C水浴中预热。</li>
			<li>开启生物安全柜（BSC），使用70% v/v乙醇对柜内表面进行消毒。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>培养细胞系
		<ol>
			<li>从-80 °C或液氮中取出细胞系，在37 °C水浴中解冻。 
			注：合适的细胞系应易于培养、转染效率高，并适用于外源蛋白的表达。本实验方案使用人胚胎肾HEK293细胞。</li>
			<li>将解冻后的细胞与至少10 mL完全培养基混合，用移液器将细胞悬液转移至10 cm培养皿中，轻轻晃动培养皿使细胞均匀分布。将培养皿置于37 °C、5% CO2、85–95%湿度的细胞培养箱中培养。</li>
			<li>在显微镜下观察细胞，待细胞融合度达到80–90%时，吸除培养基，用预热的磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤细胞，然后加入1 mL 0.25%胰蛋白酶-乙二胺四乙酸（EDTA）使细胞从培养皿表面脱落。 
			注：HEK293细胞较易脱落，因此洗涤步骤应轻柔操作，以避免细胞意外脱落和损失。</li>
			<li>约5分钟后，在显微镜下观察细胞。若所有细胞均已悬浮，加入至少4 mL培养基，将细胞悬液转移至新的无菌离心管中。使用血细胞计数板计数细胞，并将1 × 106个细胞接种至6孔板的每个孔中用于转染。 
			注：24小时后，细胞融合度应达到80%或以上。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>HiBiT-RBD质粒的转染
		<ol>
			<li>使用1 µg HiBiT-RBD表达质粒与合适的转染试剂混合。室温孵育10–15分钟，然后将全部混合液体逐滴加入6孔板的各孔中。 
			注：请遵循转染试剂生产商提供的转染操作说明。本实验中，将一定量的转染试剂与DMEM混合后加入已用DMEM稀释的质粒（1 µg）中（参见材料表）。可使用含报告基因（如绿色荧光蛋白[GFP]）的质粒作为对照，以监测转染效率。</li>
			<li>次日，将含有转染混合物的培养基更换为完全培养基。转染后48小时观察转染对照孔。 
			注：若转染成功且效率较高（超过80%的细胞表达GFP），则细胞已准备好用于收集HiBiT-RBD生物报告分子。该表达载体还包含His标签，可用于纯化蛋白，替代使用总上清液。</li>
			<li>将上清液收集至1.5 mL微量离心管中。向细胞中加入500 µL 1×被动裂解缓冲液（PLB），室温孵育并轻轻振荡15分钟以裂解细胞。 
			注：上清液和裂解液可在-20 °C保存至少6个月，完整性仅有轻微损失。根据Azad等人的研究22，该报告分子在广泛的pH范围（4–12）和温度范围（4–42 °C）内均具有良好的稳定性。</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>通过荧光素酶检测评估生物报告分子的发光信号
	<ol>
		<li>准备反应组分
		<ol>
			<li>使用上清液作为生物报告分子的来源。 
			注：上清液和裂解液均含有HiBiT-RBD生物报告分子，均可用于检测。但基于下述原因，推荐使用上清液作为检测来源。</li>
			<li>使用前将LgBiT和底物稀释至1×（储存浓度为100×）。 
			注：有关LgBiT的详细信息，请参见材料表。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>荧光素酶检测
		<ol>
			<li>将每个孔或离心管中的50 µL上清液转移至96孔板中，每孔加入50 µL 1× LgBiT，室温孵育5分钟。</li>
			<li>打开化学发光仪软件，向每孔加入50 µL 1×底物（furimazine），将96孔板放入化学发光仪中，运行检测程序。 
			&#8203;注：为防止活性酶在信号检测前消耗底物，应在读板前立即加入底物。</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 使用快速且灵敏的检测方法检测抗RBD抗体
<ol>
	<li>HiBiT-RBD 抗体检测实验
	<ol>
		<li>按照方案第 1.1 节所述方法制备 HiBiT-RBD 生物报告分子。 
		注意：建议在后续实验中使用上清液，因其更易于收集，且含有成熟糖基化的蛋白形式。此外，裂解液中含有多种其他蛋白，可能干扰 HiBiT-RBD 与抗体的相互作用。</li>
		<li>在 1.5 mL 微量离心管中，将 50 µL 含 HiBiT-RBD 的上清液与 1 µg 商品化 SARS-CoV-2-RBD 抗体混合。向溶液中加入 20 µL 免疫球蛋白结合蛋白（Protein G）。用 PBS 补足总体积至 300 µL。 
		注意：混合物的总体积可减少至 150 µL。不建议使用更低的总体积，因其可能导致抗体与生物报告分子混合不充分。</li>
		<li>将离心管置于管式振荡器或旋转混合仪上孵育 30 分钟。在 12,000 × g 条件下离心 30 秒，弃去上清液，并用 PBS 洗涤。重复该步骤三次，以去除未结合的 HiBiT-RBD。最后用 50 µL PBS 重悬沉淀，转移至 96 孔板中。</li>
		<li>加入 50 µL 1× LgBiT，静置 5 分钟。随后加入 50 µL 1× NanoLuc 底物，立即使用化学发光仪读取发光信号。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. 从患者血清样本中高通量检测 SARS-CoV-2 特异性抗体
<ol>
	<li>按照方案第1.1节操作，制备大量HiBiT-RBD生物报告分子，用于高通量检测。</li>
	<li>每个样本在96孔板的一个孔中，将20 µL磁珠蛋白G与50 µL HiBiT-RBD上清液混合。向每孔加入10 µL血清样本，并用PBS补足至总体积150 µL。 
	注意：如步骤2.1.2所述，应同时使用非特异性IgG（阴性对照）和SARS-CoV-2中和抗体（阳性对照），浓度均为1 µg/mL。此外，也可检测来自免疫小鼠的血清样本中的抗体。本实验中所用血清样本来自渥太华综合医院院区，经批准的程序采集，并获得个体知情同意。</li>
	<li>在室温下振荡孵育30分钟。将板置于磁力洗涤仪上，使蛋白G-抗体复合物沉淀。 
	注意：磁力洗涤仪的特定结构会将复合物沉淀在各孔的侧壁上。</li>
	<li>弃去每孔中间部分的溶液，加入PBS进行洗涤。至少重复洗涤三次，以去除过量的HiBiT-RBD。每孔加入50 µL 1× PBS和50 µL 1× LgBiT，室温孵育至少5分钟。</li>
	<li>准备好发光仪软件，然后加入50 µL 1×底物。将板放入仪器中，运行软件并记录信号。比较血清样本、对照样本和背景（空孔）的信号值。</li>
</ol>

<ol><li>Ullah, H., Ullah, A., Gul, A., Mousavi, T., Khan, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+coronavirus+2019+%28COVID-19%29+pandemic+outbreak%3A+A+comprehensive+review+of+the+current+literature%5BTitle%5D)+AND+%22Vacunas%22%5BJournal%5D)">Novel coronavirus 2019 (COVID-19) pandemic outbreak: A comprehensive review of the current literature.</a> Vacunas. , (2020).</li>
<li>Coronavirus update (Live). Worldometer. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.worldometers.info/coronavirus/">https://www.worldometers.info/coronavirus/</a> (2021).</li>
<li>Cacciapaglia, G., Cot, C., Sannino, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Second+wave+COVID-19+pandemics+in+Europe%3A+a+temporal+playbook%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Second wave COVID-19 pandemics in Europe: a temporal playbook.</a> Scientific Reports. 10 (1), 15514(2020).</li>
<li>World Health Organization. COVID-19 vaccines. World Health Organization. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.who.int/emergencies/diseases/novel-coronavirus-2019/covid-19-vaccines">https://www.who.int/emergencies/diseases/novel-coronavirus-2019/covid-19-vaccines</a> (2021).</li>
<li>Hueston, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+antibody+response+to+SARS-CoV-2+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Open+Forum+Infectious+Diseases%22%5BJournal%5D)">The antibody response to SARS-CoV-2 infection.</a> Open Forum Infectious Diseases. 7 (9), (2020).</li>
<li>Lan, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+of+the+SARS-CoV-2+spike+receptor-binding+domain+bound+to+the+ACE2+receptor%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Structure of the SARS-CoV-2 spike receptor-binding domain bound to the ACE2 receptor.</a> Nature. 581 (7807), 215-220 (2020).</li>
<li>Azad, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Implications+for+SARS-CoV-2+vaccine+design%3A+fusion+of+Spike+glycoprotein+transmembrane+domain+to+receptor-binding+domain+induces+trimerization%5BTitle%5D)+AND+%22Membranes%22%5BJournal%5D)">Implications for SARS-CoV-2 vaccine design: fusion of Spike glycoprotein transmembrane domain to receptor-binding domain induces trimerization.</a> Membranes. 10 (9), 215(2020).</li>
<li>Piccoli, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mapping+neutralizing+and+immunodominant+sites+on+the+SARS-CoV-2+Spike+receptor-binding+domain+by+structure-guided+high-resolution+serology%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Mapping neutralizing and immunodominant sites on the SARS-CoV-2 Spike receptor-binding domain by structure-guided high-resolution serology.</a> Cell. 183 (4), 1024-1042 (2020).</li>
<li>Premkumar, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+receptor-binding+domain+of+the+viral+spike+protein+is+an+immunodominant+and+highly+specific+target+of+antibodies+in+SARS-CoV-2+patients%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Immunology%22%5BJournal%5D)">The receptor-binding domain of the viral spike protein is an immunodominant and highly specific target of antibodies in SARS-CoV-2 patients.</a> Science Immunology. 5 (48), (2020).</li>
<li>Walls, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Elicitation+of+potent+neutralizing+antibody+responses+by+designed+protein+nanoparticle+vaccines+for+SARS-CoV-2%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Elicitation of potent neutralizing antibody responses by designed protein nanoparticle vaccines for SARS-CoV-2.</a> Cell. 183 (5), 1367-1382 (2020).</li>
<li>Azad, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanoluciferase+complementation-based+biosensor+reveals+the+importance+of+N-+linked+glycosylation+of+SARS-CoV-2+Spike+for+viral+entry%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Ther%22%5BJournal%5D)">Nanoluciferase complementation-based biosensor reveals the importance of N- linked glycosylation of SARS-CoV-2 Spike for viral entry.</a> Mol Ther. , 0074-0075 (2021).</li>
<li>Bastos, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diagnostic+accuracy+of+serological+tests+for+covid-19%3A+systematic+review+and+meta-analysis%5BTitle%5D)+AND+%22BMJ%22%5BJournal%5D)">Diagnostic accuracy of serological tests for covid-19: systematic review and meta-analysis.</a> BMJ. 370, 2516(2020).</li>
<li>Bioluminescent Reporters | Reporter Gene Applications | An Introduction to Reporter Genes. Promega. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.promega.ca/resources/guides/cell-biology/bioluminescent-reporters/#references-6d127eb8-eeae-40b7-86e9-fe300545e8fa">https://www.promega.ca/resources/guides/cell-biology/bioluminescent-reporters/#references-6d127eb8-eeae-40b7-86e9-fe300545e8fa</a> (2021).</li>
<li>Fleiss, A., Sarkisyan, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+brief+review+of+bioluminescent+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Genetics%22%5BJournal%5D)">A brief review of bioluminescent systems.</a> Current Genetics. 65 (4), 877-882 (2019).</li>
<li>Nouri, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+kinome-wide+screen+using+a+NanoLuc+LATS+luminescent+biosensor+identifies+ALK+as+a+novel+regulator+of+the+Hippo+pathway+in+tumorigenesis+and+immune+evasion%5BTitle%5D)+AND+%22The+FASEB+Journal%22%5BJournal%5D)">A kinome-wide screen using a NanoLuc LATS luminescent biosensor identifies ALK as a novel regulator of the Hippo pathway in tumorigenesis and immune evasion.</a> The FASEB Journal. 33 (11), 12487-12499 (2019).</li>
<li>Boute, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NanoLuc+Luciferase+-+a+multifunctional+tool+for+high+throughput+antibody+screening%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">NanoLuc Luciferase - a multifunctional tool for high throughput antibody screening.</a> Frontiers in Pharmacology. 7, 27(2016).</li>
<li>Nouri, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+celastrol+as+a+novel+YAP-TEAD+inhibitor+for+cancer+therapy+by+high+throughput+screening+with+ultrasensitive+YAP%2FTAZ-TEAD+biosensors%5BTitle%5D)+AND+%22Cancers%22%5BJournal%5D)">Identification of celastrol as a novel YAP-TEAD inhibitor for cancer therapy by high throughput screening with ultrasensitive YAP/TAZ-TEAD biosensors.</a> Cancers. 11 (10), 1596(2019).</li>
<li>Azad, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SARS-CoV-2+S1+NanoBiT%3A+A+nanoluciferase+complementation-based+biosensor+to+rapidly+probe+SARS-CoV-2+receptor+recognition%5BTitle%5D)+AND+%22Biosensors+and+Bioelectronics%22%5BJournal%5D)">SARS-CoV-2 S1 NanoBiT: A nanoluciferase complementation-based biosensor to rapidly probe SARS-CoV-2 receptor recognition.</a> Biosensors and Bioelectronics. 180, 113122(2021).</li>
<li>Brown, E. E. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+critical+determinants+of+ACE2-SARS+CoV-2+RBD+interaction%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Molecular+Sciences%22%5BJournal%5D)">Characterization of critical determinants of ACE2-SARS CoV-2 RBD interaction.</a> International Journal of Molecular Sciences. 22 (5), 2268(2021).</li>
<li>Azad, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+gain-of-functional+screen+identifies+the+Hippo+pathway+as+a+central+mediator+of+receptor+tyrosine+kinases+during+tumorigenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">A gain-of-functional screen identifies the Hippo pathway as a central mediator of receptor tyrosine kinases during tumorigenesis.</a> Oncogene. 39 (2), 334-355 (2020).</li>
<li>Schwinn, M. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR-Mediated+tagging+of+endogenous+proteins+with+a+luminescent+peptide%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Chemical+Biology%22%5BJournal%5D)">CRISPR-Mediated tagging of endogenous proteins with a luminescent peptide.</a> ACS Chemical Biology. 13 (2), 467-474 (2018).</li>
<li>Azad, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+high-throughput+NanoBiT-based+serological+assay+detects+SARS-CoV-2+seroconversion%5BTitle%5D)+AND+%22Nanomaterials%22%5BJournal%5D)">A high-throughput NanoBiT-based serological assay detects SARS-CoV-2 seroconversion.</a> Nanomaterials. 11 (3), 807(2021).</li>
</ol>

作者声明无利益冲突。

感染SARS-CoV-2的人数不断上升，以及全球疫苗接种工作的持续推进，迫切需要灵敏且快速的血清学检测方法，以便用于大规模血清学调查。近期研究表明，基于分裂纳米荧光素酶的生物报告系统可用于开发此类检测方法。我们近期开发了HiBiT-RBD生物报告系统，用于设计一种能够快速、可靠地检测患者血清中SARS-CoV-2特异性抗体的检测方法（图4C）。
该实验中有几个关键步骤。由于系统效率依赖于RBD蛋白的表达，因此应通过蛋白质印迹法（western blotting）验证蛋白表达水平。此外，必须使用阳性对照（例如针对RBD的商用抗体）和阴性对照抗体。建议添加Nanoluciferase蛋白作为生物发光检测的阳性对照。该蛋白产物还含有His标签，可用于大量血清样本的纯化。
与其它竞争性方法相比，使用该生物报告系统具有多项优势。首先，有经验的操作者可在不到一小时内完成完整的检测流程，显著快于ELISA等现有检测方法。其次，该检测所需的最少样品制备和操作步骤，使其在低成本大规模生...

新型冠状病毒SARS-CoV2的近期出现1截至3月30日，已导致超过280万例死亡和1.28亿例感染th, 20212由于缺乏可靠且成熟的SARS-CoV-2临床治疗方案，人们已做出诸多努力以限制病毒的进一步传播，更重要的是，致力于开发有效的、可靠的治疗方法或疫苗3迄今为止，世界卫生组织报告已有50多种COVID-19疫苗候选物处于临床试验阶段4检测抗SARS-CoV-2抗体对于确定疫苗接种后体液免疫应答的长期稳定性以及评估COVID-19康复患者的免疫状态具有重要意义5一些研究表明，康复的 SARS-CoV-2 患者在 1 年后可能会失去大部分针对 RBD 的结合抗体5,6,7,8,9需要进一步研究以更好地理解持久免疫力，而更灵敏的抗体检测平台将有助于推动相关工作。关于轻症 SARS-CoV-2 感染后免疫力持续存在的报道提示可能存在长期抗体应答，这也是一个值得关注且有价值的研究方向。快速且准确的检测方法对于监测个体血清中的抗体至关重要，可为了解人群免疫状况提供更多信息。
与其他冠状病毒类似，SARS-CoV-2 通过其突出的刺突糖蛋白与血管紧张素转换酶-2（ACE2）结合，从而启动一系列事件，导致病毒膜与细胞膜融合6,7。最近多项研究已证实，刺突蛋白的受体结合域（RBD）在引发针对 SARS-CoV-2 的强效且特异性抗体反应中起关键作用8,9,10,11。特别是 Premkumar 等人观察到患者血浆中 RBD 结合抗体滴度与 SARS-CoV-2 中和活性之间存在相关性，这进一步支持 RBD 是病毒结构中具有免疫原性的区域9。鉴于此，目前可用于检测 SARS-CoV-2 抗体的许多诊断方法耗时且成本较高，需要长时间的孵育和洗涤步骤（如酶联免疫吸附测定 [ELISA]），或存在灵敏度和准确性不足的问题（如侧向流动免疫分析 [LFIA]）12。因此，开发一种定量、快速、高灵敏度、响应迅速且相对低成本的 COVID-19 来源抗体血清学补充检测方法，将有助于满足 SARS-CoV-2 流行病学监测对可靠血清学检测的需求。
目前血清学检测方法的局限性促使研究人员探索生物发光报告系统作为未来血清学调查中潜在诊断工具的可能性。生物发光是一种自然界中存在的酶与底物反应，伴随光的发射。Nanoluc 荧光素酶是目前已知最小的（19 kDa）且最亮的系统，相较于Renilla 荧光素酶（36 kDa）和萤火虫荧光素酶（61 kDa）具有显著优势13,14。此外，Nanoluc 在前述系统中具有最高的信噪比和稳定性。其高强度的信号输出使得即使极低水平的报告融合蛋白也能被有效检测15。Nanoluc 双分子技术（NanoBiT）是 Nanoluc 系统的一种分裂形式，由两个片段组成：小片段 BiT（11 个氨基酸；SmBiT）和大片段 BiT（LgBiT），二者通过低亲和力相互作用（KD = 190 µM）结合形成发光复合物16。NanoBiT 已被广泛应用于多种研究中，包括蛋白质-蛋白质相互作用的鉴定15,17,18,19以及细胞信号通路的研究11,20,21。
最近，一种对 LgBiT 具有显著更高亲和力（KD = 0.7 nM）的小肽被引入，即以 HiBiT Nano-Glo 系统取代 SmBiT。由于 Nano-Glo &#34;加样-混匀-检测&#34; 检测方法具有高亲和力和强信号，HiBiT 成为一种适用于定量检测的发光肽标签。在该方法中，通过构建对目标蛋白结构干扰最小的表达载体，将 HiBiT 标签连接至目标蛋白。HiBiT 与蛋白融合后可主动结合 LgBiT 亚基，形成功能完整的高活性荧光素酶，在加入检测试剂后产生可检测的生物发光信号（图1）。类似地，我们开发了一种基于 HiBiT Nano-Glo 的系统，用于快速测定 SARS-CoV-2 康复个体血清中的中和抗体滴度，并已成功构建了带有 HiBiT 标签的 SARS-CoV-2 受体结合域（RBD）。本文描述了使用常规实验室设备和标准操作流程制备 HiBiT-RBD 生物报告分子的详细方案，并展示了该生物报告分子如何应用于一种快速高效的检测方法，用于检测靶向 SARS-CoV-2 RBD 的抗体。

<table><tbody><tr><td>5倍被动裂解缓冲液</td><td>Promega</td><td>E194A</td><td>30 mL</td></tr><tr><td>Bio-Plex 手持式磁力洗涤仪</td><td>Bio-Rad</td><td>171020100</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Sigma</td><td>D6429-500ml</td><td></td></tr><tr><td>Dual-Glo 荧光素酶检测试剂系统</td><td>Promega</td><td>E2940</td><td>100 mL 试剂盒</td></tr><tr><td>胎牛血清（FBS）</td><td>Sigma</td><td>F1051</td><td></td></tr><tr><td>HiBiT-RBD 质粒</td><td></td><td></td><td>gacggatcgggagatctcccgatcccctatggt gcactctcagtacaatctgctctgatgccgcata gttaagccagtatctgctccctgcttgtgtgttgg aggtcgctgagtagtgcgcgagcaaaattta agctacaacaaggcaaggcttgaccgacaa ttgcatgaagaatctgcttagggttaggcgttttg cgctgcttcgcgatgtacgggccagatatacgc gttgacattgattattgactagttattaatagt aatcaattacggggtcattagttcatagcccat atatggagttccgcgttacataacttacggtaa atggcccgcctggctgaccgcccaacgaccc ccgcccattgacgtcaataatgacgtatgttccc atagtaacgccaatagggactttccattgacgtc aatgggtggagtatttacggtaaactgcccact tggcagtacatcaagtgtatcatatgccaagta cgccccctattgacgtcaatgacggtaaatgg cccgcctggcattatgcccagtacatgaccttat gggactttcctacttggcagtacatctacgtat tagtcatcgctattaccatggtgatgcggtttt ggcagtacatcaatgggcgtggatagcggtttg actcacggggatttccaagtctccaccccattg acgtcaatgggagtttgttttggcaccaaaatc aacgggactttccaaaatgtcgtaacaactccg ccccattgacgcaaatgggcggtaggcgtgta cggtgggaggtctatataagcagagctctctgg ctaactagagaacccactgcttactggcttatcg aaattaatacgactcactatagggagacccaa gctggctagcgtttaaacttaagcttggtaccga gctcggatccgccaccATGGAGACAGA CACACTCCTGCTATGGGTACTGC TGCTCTGGGTTCCAGGTTCCAC TGGTGACtctggctctagcggctctggctct agcggcggcATGGTGAGCGGCTG GCGGCTGTTCAAGAAGATTAGC tctagcggcGACTACAAGGACC ACGACGGTGACTACAAGGACCA CGACATCGACTACAAGGACGAC GACGACAAGggcagcggctccggca gcagcggaggaggaggctctggaggagga ggctctagcggcggcaacatcacaaatctgtg cccattcggcgaggtgtttaacgccaccagat ttgccagcgtgtatgcctggaaccggaagaga atctctaattgcgtggccgactatagcgtgct gtacaatagcgcctccttctctacctttaagt gctatggcgtgtcccccacaaagctgaacgac ctgtgcttcaccaacgtgtacgccgactcttttgt gatcaggggcgatgaggtgcgccagatcgc acctggacagacaggcaagatcgccgactac aactataagctgccagacgatttcaccggct gcgtgatcgcctggaatagcaacaatctggatt ccaaagtgggcggcaactacaattatctgtac cggctgttcagaaagagcaacctgaagccctt tgagcgggatatcagcacagegatctaccag gcaggctccaccccttgcaacggagtggagg gcttcaattgttattttcccctgcagagctacggc ttccagcctacaaatggcgtgggctatcagcca tacagggtggtggtgctgtcctttgagctgctg cacgcacctgcaaccgtgtcctctggacacatc gagggccgccacatgctggagatgggccatc atcaccatcatcaccaccaccaccactgatag cggccgctcgagtctagagggcccgtttaaac ccgctgatcagcctcgactgtgccttctagtt gccagccatctgttgtttgcccctcccccgtg ccttccttgaccctggaaggtgccactcccac tgtcctttcctaataaaatgaggaaattgcat cgcattgtctgagtaggtgtcattctattctgggg ggtggggtggggcaggacagcaaggggga ggattgggaagacaatagcaggcatgctggg gatgcggtgggctctatggcttctgaggcggaa agaaccagctggggctctagggggtatcccca cgcgccctgtagcggcgcattaagcgcggcg ggtgtggtggttacgcgcagcgtgaccgctac acttgccagcgccctagcgcccgctcctttcg ctttcttcccttcctttctcgccacgttcgccggctt tccccgtcaagctctaaatcgggggctcccttta gggttccgatttagtgctttacggcacctcgacc ccaaaaaacttgattagggtgatggttcacgta gtgggccatcgccctgatagacggtttttcgcc ctttgacgttggagtccacgttctttaatagtg gactcttgttccaaactggaacaacactcaacc ctatctcggtctattcttttgatttataagggatttt gccgatttcggcctattggttaaaaaatgagctg atttaacaaaaatttaacgcgaattaattctgt ggaatgtgtgtcagttagggtgtggaaagtccc caggctccccagcaggcagaagtatgcaaag catgcatctcaattagtcagcaaccaggtgtgg aaagtccccaggctccccagcaggcagaagt atgcaaagcatgcatctcaattagtcagcaac catagtcccgcccctaactccgcccatcccgc ccctaactccgcccagttccgcccattctccgcc ccatggctgactaattttttttatttatgcagaggc cgaggccgcctctgcctctgagctattccagaa gtagtgaggaggcttttttggaggcctaggcttttg caaaaagctcccgggagcttgtatatccattttc ggatctgatcaagagacaggatgaggatcgttt cgcatgattgaacaagatggattgcacgcagg ttctccggccgcttgggtggagaggctattcggc tatgactgggcacaacagacaatcggctgctct gatgccgccgtgttccggctgtcagcgcagggg cgcccggttctttttgtcaagaccgacctgtccgg tgccctgaatgaactgcaggacgaggcagcg cggctatcgtggctggccacgacgggcgttcct tgcgcagctgtgctcgacgttgtcactgaagcg ggaagggactggctgctattgggcgaagtgcc ggggcaggatctcctgtcatctcaccttgctcctg ccgagaaagtatccatcatggctgatgcaatg cggcggctgcatacgcttgatccggctacctgc ccattcgaccaccaagcgaaacatcgcatcg agcgagcacgtactcggatggaagccggtct tgtcgatcaggatgatctggacgaagagcat caggggctcgcgccagccgaactgttcgcca ggctcaaggcgcgcatgcccgacggcgagg atctcgtcgtgacccatggcgatgcctgcttg ccgaatatcatggtggaaaatggccgctttt ctggattcatcgactgtggccggctgggtgt ggcggaccgctatcaggacatagcgttggct acccgtgatattgctgaagagcttggcggcg aatgggctgaccgcttcctcgtgctttacgg tatcgccgctcccgattcgcagcgcatcgcc ttctatcgccttcttgacgagttcttctgagcg ggactctggggttcgaaatgaccgaccaag cgacgcccaacctgccatcacgagatttcgat tccaccgccgccttctatgaaaggttgggctt cggaatcgttttccgggacgccggctggatga tcctccagcgcggggatctcatgctggagt tcttcgcccaccccaacttgtttattgcagctta taatggttacaaataaagcaatagcatcacaa atttcacaaataaagcatttttttcactgcatt ctagttgtggtttgtccaaactcatcaatgtat cttatcatgtctgtataccgtcgacctctagct agagcttggcgtaatcatggtcatagctgtttc ctgtgtgaaattgttatccgctcacaattccacac aacatacgagccggaagcataaagtgtaaag cctggggtgcctaatgagtgagctaactcacat taattgcgttgcgctcactgcccgctttccagtc gggaaacctgtcgtgccagctgcattaatgaa tcggccaacgcgcggggagaggcggtttgcg tattgggcgctcttccgcttcctcgctcactgactc gctgcgctcggtcgttcggctgcggcgagcggt atcagctcactcaaaggcggtaatacggttatc cacagaatcaggggataacgcaggaaagaa catgtgagcaaaaggccagcaaaaggccag gaaccgtaaaaaggccgcgttgctggcgtttt tccataggctccgcccccctgacgagcatcac aaaaatcgacgctcaagtcagaggtggcgaa acccgacaggactataaagataccaggcgtt tccccctggaagctccctcgtgcgctctcctgtt ccgaccctgccgcttaccggatacctgtccgcc tttctcccttcgggaagcgtggcgctttctcat agctcacgctgtaggtatctcagttcggtgtag gtcgttcgctccaagctgggctgtgtgcacgaa ccccccgttcagcccgaccgctgcgccttatcc ggtaactatcgtcttgagtccaacccggtaag acacgacttatcgccactggcagcagccactg gtaacaggattagcagagcgaggtatgtaggc ggtgctacagagttcttgaagtggtggcctaact acggctacactagaagaacagtatttggtatc tgcgctctgctgaagccagttaccttcggaaa aagagttggtagctcttgatccggcaaacaaa ccaccgctggtagcggtggtttttttgtttgca agcagcagattacgcgcagaaaaaaaggat ctcaagaagatcctttgatcttttctacggggt ctgacgctcagtggaacgaaaactcacgttaa gggattttggtcatgagattatcaaaaaggatct tcacctagatccttttaaattaaaaatgaagtt ttaaatcaatctaaagtatatatgagtaaactt ggtctgacagttaccaatgcttaatcagtgagg cacctatctcagcgatctgtctatttcgttcatcca tagttgcctgactccccgtcgtgtagataactac gatacgggagggcttaccatctggccccagtg ctgcaatgataccgcgagacccacgctcacc ggctccagatttatcagcaataaaccagccag ccggaagggccgagcgcagaagtggtcctg caactttatccgcctccatccagtctattaattgtt gccgggaagctagagtaagtagttcgccagtt aatagtttgcgcaacgttgttgccattgctacag gcatcgtggtgtcacgctcgtcgtttggtatgg cttcattcagctccggttcccaacgatcaaggc gagttacatgatcccccatgttgtgcaaaaaag cggttagctccttcggtcctccgatcgttgtca gaagtaagttggccgcagtgttatcactcatggt tatggcagcactgcataattctcttactgtcatg ccatccgtaagatgcttttctgtgactggtgagta ctcaaccaagtcattctgagaatagtgtatgcg gcgaccgagttgctcttgcccggcgtcaatacg ggataataccgcgccacatagcagaactttaa aagtgctcatcattggaaaacgttcttcggggc gaaaactctcaaggatcttaccgctgttgagat ccagttcgatgtaacccactcgtgcacccaact gatcttcagcatcttttactttcaccagcgtttc tgggtgagcaaaaacaggaaggcaaaatgc cgcaaaaaagggaataagggcgacacgga aatgttgaatactcatactcttcctttttcaat attattgaagcatttatcagggttattgtc tcatgagcggatacatatttgaatgtattt agaaaaataaacaaataggggttccgcgca catttccccgaaaagtgccacctgacgtc</td></tr><tr><td>LgBiT</td><td>Promega</td><td>N3030</td><td></td></tr><tr><td>青霉素-链霉素</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>Pierce Protein G 磁珠</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>88848</td><td></td></tr><tr><td>PolyJet 体外 DNA 转染试剂</td><td>Signagen</td><td>SL100688.5</td><td></td></tr><tr><td>SARS-CoV-2（2019-nCoV）刺突蛋白中和抗体，小鼠单克隆抗体</td><td>SinoBiological</td><td>40592-MM57</td><td></td></tr><tr><td>Synergy Mx 微孔板读板仪</td><td>BioTek</td><td></td><td>96孔板读板仪，化学发光检测功能</td></tr><tr><td>胰蛋白酶-EDTA</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>2520056</td><td>0.25%</td></tr></tbody></table>

基于hibit生物报告系统的sars-cov-2受体结合域抗体检测

sars-cov-2, 受体结合域, 抗体检测, hibit, 生物报告系统, 免疫分析, 发光检测, 血清学检测, 病毒中和抗体, 体外检测

Detection of SARS-CoV-2 Receptor-Binding Domain Antibody using a HiBiT-Based Bioreporter

新型冠状病毒病（COVID-19）大流行的出现，增加了对更优血清学检测方法的需求，以评估严重急性呼吸综合征冠状病毒2（SARS-CoV-2）的流行病学影响。随着SARS-CoV-2感染病例数量不断上升，对更高效的抗体检测方法的需求也日益迫切。目前的抗体检测方法往往在灵敏度与检测速度之间做出权衡：或牺牲灵敏度以提高速度，或虽具高灵敏度但耗时较长。大量SARS-CoV-2中和抗体以受体结合域（RBD）为靶标，而RBD是SARS-CoV-2主要的免疫原性结构域之一。我们近期设计并开发了一种高灵敏度的生物发光标记RBD（NanoLuc HiBiT-RBD），用于检测SARS-CoV-2抗体。下文描述了制备HiBiT-RBD复合物的步骤，以及利用该工具快速检测靶向RBD抗体的实验方法。由于HiBiT-RBD蛋白产物在较宽温度范围内具有良好的稳定性，且实验流程较短，可在1小时内完成，因此该方案可被视为检测患者血清样本中SARS-CoV-2抗体的一种更高效的替代方法。

记录了转染细胞的含 HiBit-RBD 的细胞裂解液和上清液的信号（图 2），以评估合适的蛋白来源。分别使用 HiBiT-RBD 和 LgBit 作为对照，数据显示，与两部分结合时产生的强信号相比，背景信号较低。因此，HiBiT-RBD 与 LgBiT 的相互作用是产生活性酶以进行底物消化并产生生物发光活性所必需的（图 1）。
加入蛋白G有助于抗体沉淀（图3）。本实验用于比较一种商业化的SARS-CoV-2中和抗体与对照IgG的信号。特异性抗体信号强，而对照抗体信号接近发光本底水平（图4A）。使用表达外源RBD的、携带M蛋白第51位点突变（Δ51）的重组减毒溶瘤型水疱性口炎病毒（VSV）对小鼠进行免疫。与注射对照VSV的小鼠无信号相比，免疫小鼠血清产生了强烈的信号（图4B...

本文所述方案介绍了HiBiT-受体结合域蛋白复合物的制备方法及其在快速、灵敏检测SARS-CoV-2抗体中的应用。

基于HiBiT生物报告系统的SARS-CoV-2受体结合域抗体检测

SARS-CoV-2, 受体结合域, 抗体检测, HiBiT, 生物报告系统, 免疫分析, 发光检测, 血清学检测, 病毒中和抗体, 体外检测

新型冠状病毒肺炎（COVID-19）大流行的出现，增加了对更优血清学检测方法的需求，以确定严重...的流行病学影响

我的实验室一直致力于 COVID-19 的研究，近期开发出一种新型检测方法，可快速、准确地检测 SARS-CoV-2 抗体。本方案概述了一种高通量检测患者血清样本中抗 SARS-CoV-2 抗体的方法，在当前大流行的背景下，这一方法至关重要。目前大多数血清学检测方法在灵敏度和速度之间难以兼顾，往往牺牲其一。我们的数据表明，该检测方法既灵敏又具有快速的响应时间。为了生产足量的高HiBiT-RBD生物报告分子，请首先准备细胞培养。第一步，配制含有10%胎牛血清和1%青霉素-链霉素的完全杜尔贝科改良伊格尔培养基。然后将培养基置于37摄氏度水浴中预热。打开生物安全柜，并使用70%乙醇对柜内表面进行消毒。培养细胞系时，从-80摄氏度冰箱或液氮中取出细胞，于37摄氏度水浴中快速解冻。将解冻的细胞与至少10毫升完全培养基混合。用移液器将细胞悬液加入一个15厘米的培养皿中，并轻轻晃动培养皿使细胞均匀分布。将培养皿置于37摄氏度、5%二氧化碳、85%至95%湿度的细胞培养孵箱中。在显微镜下观察细胞，直至细胞融合度达到80%至90%。当细胞融合度较高时，移除培养基，用预温的PBS洗涤细胞，并加入3至5毫升0.25%胰蛋白酶-EDTA溶液，使细胞从培养表面脱落。约5分钟后，在显微镜下观察细胞。若所有细胞均已悬浮，加入至少4毫升培养基，将细胞悬液转移至新的无菌离心管中。使用血细胞计数板对细胞进行计数，并将一百万个细胞加入六孔板的每个孔中用于转染。转染HiBiT-RBD质粒时，使用一微克HiBiT-RBD表达质粒与适当的转染试剂。室温孵育10至15分钟，然后将总体积逐滴加入到六孔板的每个孔中。第二天，将含有转染混合物的培养基更换为完全培养基。转染后48小时观察转染对照孔。用1.5毫升微量离心管收集上清液。向细胞中加入 500 微升 1× 被动裂解缓冲液（PLB），然后在室温下孵育并振荡培养板 15 分钟，以实现细胞裂解。接下来，为了使用荧光素酶检测法评估生物报告系统的发光信号，首先准备反应组分，并以裂解后的上清液作为生物报告系统的来源。使用前将大片段 BiT 和底物稀释至 1×。从每个孔或试管中转移50微升上清液至96孔板中，每孔加入50微升1X大BiT。室温孵育5分钟。打开化学发光仪软件，每孔加入50微升1X底物，将板放入化学发光仪中并运行软件。为了进行 HiBiT-RBD 抗体检测实验，按先前所述方法制备 HiBiT-RBD 生物报告分子，并将含有 HiBiT-RBD 的上清液 50 微升与 1 微克市售 SARS-CoV-2 RBD 抗体在 1.5 毫升微量离心管中混合。向溶液中加入 20 微升免疫球蛋白结合蛋白或 Protein G。用 PBS 补足总体积至 300 微升。将离心管置于摇床或旋转仪上孵育30分钟。在12,000 G条件下离心30秒。弃去上清液，并用PBS洗涤。重复该步骤三次，以去除游离的 HiBiT-RBD。将细胞重悬于 50 微升 PBS 中，并转移至 96 孔板。加入 50 微升 1X 大型 BiT，静置五分钟。然后每孔加入 50 µL 1× NanoLuc 底物，立即使用发光仪读取发光信号。为进行高通量检测，可制备较大量 HiBiT-RBD 生物报告分子，并在 96 孔板的每个孔中，将 20 µL 磁性 Protein G 与 50 µL HiBiT-RBD 上清液混合，每份样品对应一孔。向每个孔中加入10微升血清样本，并加入PBS使总体积达到150微升。在室温下于摇床上孵育30分钟。然后将板置于磁力洗涤仪上，使Protein G抗体复合物沉淀。弃去每个孔中间部分的溶液，加入 PBS 进行洗涤。重复洗涤步骤至少三次，以去除过量的 HiBiT-RBD。每孔加入 50 微升 1× PBS 和 50 微升 1× 大型 BiT，室温孵育至少五分钟。准备化学发光仪软件。然后加入 50 µL 的 1X 底物。将酶标板放入仪器中，运行软件并记录信号。比较血清样本、对照样本以及空孔的背景信号。记录转染细胞中含有HiBiT-RBD的细胞裂解液和上清液的信号，以评估合适的蛋白来源。数据显示，当两部分合并时，背景信号较低，而特异性信号较强。加入Protein G有助于抗体沉淀。该实验用于比较商业化的SARS-CoV-2中和抗体与对照IgG的信号。特异性抗体信号较强，而对照抗体信号接近发光背景水平。使用在M蛋白第51位点发生突变并表达外源性RBD的重组减毒溶瘤型水泡性口炎病毒（VSV）对小鼠进行免疫。采集免疫后小鼠的血清，其检测信号显著强于注射对照VSV小鼠的血清（后者无信号）。该方案可用于检测患者血清样本中的SARS-CoV-2抗体。在使用Protein G孵育后的洗涤步骤对于降低背景信号至关重要。此外，应尽快加入底物，以避免信号损失。通过增加若干额外的优化步骤，该检测方法也可用于分析血液样本，可能成为检测患者血液中抗SARS-CoV-2抗体的有效方法。

detection-sars-cov-2-receptor-binding-domain-antibody-using-hibit

Research

科研

JoVE Journal

Immunology and Infection

免疫学与感染

使用基于HiBiT的生物报告器检测SARS-CoV-2受体结合域抗体

在SiO2表面，利用一种简单的干涉测量技术，可实现对生物分子（如DNA、蛋白质等）的定量、高通量、实时且无需标记的检测。该技术依赖LED照明、极少的光学元件和一台相机。干涉反射成像传感器（IRIS）成本低廉、操作简便，并适用于微阵列格式。...

采用干涉反射成像传感器（IRIS）进行生物分子检测

该视频展示了用于定量荧光素酶标记蛋白的荧光素酶检测方法。该检测利用一种经过基因工程改造的荧光素酶，该酶由一个大片段和一个小片段组成，其中小片段与目标蛋白偶联。当两个亚基结合后，形成具有活性的酶，在底物存在的情况下可释放出发光信号。该信号随后通过发光仪进行定量。...

荧光素酶检测：利用基于工程化Nano荧光素酶系统的生物报告系统测量发光信号的高通量检测方法

在本视频中，我们展示了基于 HiBit-RBD 生物报告系统检测 SARS-CoV-2 中和抗体的方法。该系统利用包含与 RBD 结构域融合的 HiBiT 的生物发光报告系统，靶向病毒的 RBD...

生物报告基因检测：一种利用生物发光报告系统检测SARS-CoV-2抗体的灵敏技术

本方案介绍了一种快速且有效的检测方法，通过评估恢复期血清样本抑制携带刺突糖蛋白的增强型绿色荧光蛋白标记的水疱性口炎病毒假病毒入侵的能力，来测定针对SARS-CoV-2刺突蛋白的中和抗体水平。...

利用高通量荧光成像检测SARS-CoV-2中和抗体的假病毒侵染

采用一种用于基于微球的多重检测的流式分析系统，该系统提供双报告信号读出，用于开发多重血清学和抗体中和检测方法，可同时检测SARS-CoV-2的中和性IgG和IgM抗体。...

一种用于多重微球流式分析系统的快速、多重双报告基因IgG和IgM SARS-CoV-2中和检测方法

在本方案中，与重组 SARS-CoV-2 刺突蛋白结合的量子点可用于基于细胞的检测，以监测刺突蛋白在质膜上与 hACE2...

高通量共聚焦成像技术观察量子点标记的SARS-CoV-2刺突蛋白三聚体在HEK293T细胞中的结合与内吞过程

本文介绍了一种便捷的方法，可同时监测针对SARS-CoV-2感染或疫苗接种所引发的免疫反应中两种免疫球蛋白亚型（IgA、IgM或IgG）抗体滴度的动态变化。该“多重分析物新冠免疫反应检测组”采用基于编码微球的三种间接免疫测定法，使用具备“双通道”功能的流式多重读数仪进行检测。...

使用多指标免疫磁珠检测法对新冠血清转化进行动态监测

本方案介绍了用于 SPR 结合分析的新工具，以研究 CV-N 与 HA、S 糖蛋白、相关杂合型聚糖以及高甘露糖寡糖的结合。SPR 用于测定二聚体或单体 CV-N 与这些聚糖结合的 KD...

设计抗病毒药物 通过 表面等离子体共振

本文介绍了一种新开发的多重荧光免疫测定法，该方法利用双报告系统流式细胞术，同时检测完整严重急性呼吸综合征冠状病毒2（SARS-CoV-2）病毒颗粒上的两个独特刺突蛋白表位，这些病毒颗粒已被血管紧张素转换酶2偶联的磁性微球捕获。...

通过多重双报告基因策略对病毒颗粒表面蛋白表位进行分析

我们介绍一种基于无细胞合成生物学原理和点印迹技术的新型免疫检测平台，可用于定制化检测人和动物血清中的抗体反应。...

无细胞点印迹法作为一种实用且可灵活调整的免疫检测平台，用于检测人和动物血清中的抗体反应

了解基于HiBiT的生物报告器检测SARS-CoV-2受体结合域抗体的高通量方法。该技术结合快速响应与高灵敏度，适用于患者血清样本的大规模检测，为COVID-19血清学研究提供可靠工具。

基于HiBiT生物报告系统的SARS-CoV-2受体结合域抗体检测 SARS-CoV-2, 受体结合域, 抗体检测, HiBiT, 生物报告系统, 免疫分析, 发光检测, 血清学检测, 病毒中和抗体, 体外检测

探索更多视频