分子弹簧常量分析由生物元原力探针光谱
2021年11月20日
生物元力探针 （BFP） 是一种 原位 动态力光谱 （DFS） 技术。BFP可用于测量活细胞分子相互作用的弹簧常数。此协议对 BFP 检测到的分子键进行弹簧常量分析。
本视频介绍了使用生物膜力探针或BFP测量分子弹簧常数的分步程序。在力探针中，BFP最近出现在天然细胞表面或SITU动态力光谱分析中。该技术的主要目的是测量单分子结合遗传学。
该数据分析程序是一个简单但强大的信息，并提供机械信息，特别是表达分子的细胞膜的动态力和炎症。在BFP实验周期中，探针微生物组与红细胞和遗嘱认证、靶细胞和配体受体之间的分子键合探针与靶标之间可以被认为是一系列连接的大脑系统。根据胡克定律，串联弹簧系统的总弹簧常数的倒数等于每个单个分量的逆弹簧常数之和，如方程所示。
红细胞的弹簧常数是根据事件运动计算的，这取决于孔口中探针微量移液器的径向。红细胞，红细胞与遗嘱认证之间的圆形接触区域以及微量移液器吸气压力。BFP道路数据由自制的左视图虚拟仪器获得，该仪器通过PA转换器控制目标微量移液器的运动。
完整的PFP触摸周期由五个阶段组成。接近.撞击.接触。收回并解离。在开始时，确实应力 罗布斯托 APICS 位置在黑色 deshine 中表示为 X 等于 0。
然后，目标由碎片或翻译器驱动，撞击并压缩鲁棒，导致负面的遗嘱认证运动。您注意到它在红色虚线中小于零的 X。在缩回阶段，红色 busto 顶点从小于零的 X 位置移回等于零的位置，称为压缩相位。
如果在配体受体分子复合物之间形成键，红细胞将进一步与其他正方向不同。这个大于零的X周期称为拉伸阶段的缩回阶段。缩回阶段是确定键合分子弹簧常数的最关键部分。
使用 BSP 数据采集平台收集力与时间的关系道路数据。每个实验通常记录50到200个触摸周期，打开PFP数据分析软件。单击黄色文件夹图标，然后双击它们以选择相应的行数据文件。
我们正在参加该计划。然后单击向上和向下箭头按钮以在事件之间切换。使用异常值排除条件筛选出无效事件。
选择强制为时间格式的导出数据类型，然后选择适当的时间状态范围。单击导出绘图数据按钮。默认情况下，导出的数据将另存为文本文件。
此文本文件包含两列数据。第一列代表时间爸爸，第二列代表每个时间点的相应力。使用电子表格软件绘制力与时间的关系曲线，以获得受力与位移曲线。
将每个数据点的时间值乘以柳钢PSO机芯。通过从每个数据点中减去最小位移值，将第一个数据点清零。这种水平变换不会影响随后的弹簧常数计算。
在力与位移曲线中，如果可以识别出新的力斜率，则两个不同的参与者组是不同的。每个代表压缩阶段和10样式阶段。使回归线适合每个数据组。
具有较陡坡度的线表示压缩机相位处的总弹簧常数，表示为 K1。而最小顶部的线代表这个10风格阶段的线，表示为 K2.As 我提到的，总弹簧常数是每个组件的系列弹簧常数的儿子的倒数。在节拍到细胞模式的压缩阶段，分子键不会拉伸，因此不考虑分子键弹簧常数。目标单元的弹簧常数被描述为显示的方程，其中 K1 表示压缩机阶段的总弹簧常数。
在10风格阶段的节拍卖出模式中，总弹簧常数是太阳的逆弹簧常数的红细胞分子键。而目标细胞，使用显示的方程来计算分子键合弹簧常数，其中K2表示总弹簧常数。您阅读了 10 个停止阶段。
在节拍到节拍模式中，由于B的变形可以忽略不计，描述目标细胞弹簧常数的反转项接近零，因此压缩机相位的总弹簧常数相当于显示如下等式的红细胞弹簧常数。在拉伸阶段，分子键的弹簧常数可以通过减去红细胞的作用来计算，如下所示如下式所示。收集侧风积分姿态B、Beta 3配合物、K562单元和二氟化物积分姿态B Beta三络合物的弹簧常数，计算牛顿或纳米尺度上衍生的弹簧常数的均值和标准差。
现在，您应该更好地了解对VFD数据的测量和弹簧常数的要求。应注意"节拍到单元格"模式和"节拍到节拍"模式之间的差异。不同的分子呈现服务对弹簧常数的测量将有不同的防御。
总之，这个分步过程描述了如何使用BFP进行分子弹簧常数分析。我们预计未来将努力实现BFP数据采集和DFS分析的自动化和集成，并将其集成到一个计算机休息程序中。使整个BFP操作数据分析更加人性化和高。
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概述
生物膜力探针（BFP）是一种动态力学光谱技术，用于测量活细胞上分子相互作用的弹簧常数。本协议概述了由BFP检测到的分子键的弹簧常数分析。
关键研究组成部分
科学领域
- 动态力学光谱
- 分子相互作用
- 细胞膜力学
背景
- BFP技术测量单分子结合。
- 它提供了关于细胞膜的机械信息。
- 分析基于胡克定律。
- 它涉及探针和目标细胞之间的相互作用。
研究目的
- 测量分子弹簧常数。
- 分析分子结合动力学。
- 增强对细胞膜相互作用的理解。
使用的方法
- 使用生物膜力探针（BFP）。
- 原位动态力学光谱分析。
- 分子相互作用的数据分析。
- 应用胡克定律计算弹簧常数。
主要结果
- 成功测量分子弹簧常数。
- 分子结合动力学的洞察。
- 展示BFP在活细胞分析中的有效性。
- 通过实验数据验证理论模型。
结论
- BFP是研究分子相互作用的强大工具。
- 该技术增强了我们对细胞力学的理解。
- 未来应用可能包括更广泛的生物学研究。
常见问题
Executive Industry Relevance
Measuring molecular spring constants via biomembrane force probe spectroscopy provides quantitative mechanical insights into ligand-receptor interactions, supporting target validation by characterizing bond stability and conformational dynamics. This approach enables mechanistic de-risking in early discovery by linking molecular mechanics to functional signaling, informing go/no-go decisions before compound screening. The method enhances predictive confidence in target selection by revealing force-dependent binding behaviors that correlate with physiological mechanosensing pathways.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Interrogates therapeutic hypotheses by quantifying bond stiffness and rupture forces under physiological loading rates.
- Operational Value: Enables direct comparison of molecular variants or mutants to identify stabilizing mutations that prolong bond lifetime.
- Scientific Value: Clarifies force-dependent conformational changes in receptors, supporting allosteric mechanism validation.
- Operational Value: Provides benchmark data for structure-guided design of therapeutics with optimized mechanical resilience.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates force-displacement curves that serve as orthogonal readouts for binding affinity in assay triage.
- Operational Value: Standardizes spring constant measurements across replicates using outlier exclusion criteria and regression fitting.
- Scientific Value: Distinguishes specific from nonspecific interactions based on tensile phase slope characteristics in bead-bead mode.
- Operational Value: Enables high-throughput collection of 50-200 touch cycles per experiment for robust statistical analysis.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Connects molecular spring constants to cellular mechanosensing outputs, informing pathophysiological relevance in disease models.
- Operational Value: Supports continuity from purified systems to native cell surfaces via bead-cell and bead-bead modes.
- Scientific Value: Measures cell contribution to total spring constant, deconvolving target-specific molecular mechanics from probe or cell artifacts.
- Operational Value: Facilitates cross-platform comparison of molecular mechanics using standardized Hooke's law-based analysis.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into early discovery workflows by providing mechanical phenotyping of targets after initial binding confirmation but before large-scale screening, helping prioritize targets with favorable force-stability profiles.
- Discovery Biology: Tests target hypothesis by measuring how molecular bonds respond to mechanical perturbation, revealing catch-bond or slip-bond behavior.
- Screening: Delivers quantitative, reproducible spring constant outputs that enable rank-ordering of ligand variants or therapeutic candidates.
- Analytics: Employs linear regression on force-displacement data to derive spring constants (K1, K2) from compressive and tensile phases, enabling condition comparison.
- Translational Research: Links molecular mechanics to cell-scale responses by measuring target cell contribution in bead-cell mode, supporting mechanistic continuity.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable nanotool for mechanical phenotyping across diverse receptor-ligand systems, reducing revalidation effort in follow-up campaigns.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Reduces mechanistic ambiguity by providing direct, quantitative measures of bond elasticity and force-dependent kinetics.
- Operational Value: Ensures reproducibility through standardized data acquisition, outlier filtering, and exportable force-time datasets for external validation.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by identifying mechanically fragile targets early, reducing investment in high-risk pathways.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of targets based on bond stability metrics, complementing traditional affinity and selectivity data.
Implementation Considerations
- Requires expertise in dynamic force spectroscopy, micropipette manipulation, and force calibration using red blood cell standards.
- Depends on custom-built BFP setup with piezoelectric translators and homemade virtual instrumentation for precise displacement control.
- Necessitates cross-team standardization of outlier criteria, time-range selection, and regression fitting protocols across sites.
- Involves adaptation considerations when transitioning from bead-cell to bead-bead mode to isolate molecular contributions from cellular mechanics.
- Limited by the need for stable molecular tethering and functional ligand-receptor expression on probe or target surfaces to avoid artifactual signals.
