通过红外激光辅助微模式控制细胞几何
2021年7月10日
这里提出的协议使微型模式能够自动制造，使细胞形状标准化，以研究哺乳动物细胞中的细胞骨结构。这种用户友好型技术可以与市售成像系统建立，不需要标准细胞生物学实验室无法使用的专用设备。
微模式是科学家用来了解细胞形状和细胞间机器活动之间的联系的有力技术。虽然几种技术允许研究人员调节细胞形状，但这些技术往往需要一些生物实验室无法利用的专用设备。此视频将引导您完成在市售多光成像系统上实现微模式自动化所需的步骤。
此协议的一个优点是避免使用专用设备。模式也可以很容易地改变，而无需重新灌接光面膜，这通常是微模式中最耗时的过程。我们的图像处理工具生成平均细胞图像，以公正和自动化的方式反映蛋白质的代表性分布。
虽然我们在实验中使用盖片，但自动化工作流还允许您在滑梯和玻璃底盘上进行图案。此方法的视觉演示非常重要，因为适当的显微镜设置对于系统以自动化的方式映像、识别正确的焦距平面和模式至关重要。按照指示准备 PVA 解决方案。
将一部分 HCL 添加到八个部分 PVA 中。小心地倒置管子几次混合。将两毫升溶液倒入小培养皿中，将干净的预处理盖滑入液体中。
在室温下在摇床上孵化五分钟。小心地从溶液中删除盖子。使用盖片微调器旋转外套40秒。
同时，清洁钳子。将盖片转移到一个盒子上，并在四度下通宵干燥。打开显微镜软件。
首先，将激光线设置为 750 纳米。然后设置一个新的光学配置称为"图像"。这是基线光学配置，使我们能够通过反射器对盖子进行成像。
将其他选项保留为默认选项，并选择适当的目标。在此光学配置下配置硬件设置。将红外激光器设置为我们的刺激激光。
将光束分离器放入光路径中，使用 IR 激光进行成像。选择加尔瓦诺扫描仪单元和适当的 D 扫描探测器。选择扫描大小和停留时间，足以捕获盖单上的小功能。
确保检查使用 IR 激光框。调整采集激光功率和探测器灵敏度，以获得覆盖滑面的明亮但不饱和的图像。在扫描区域窗口中，将变焦设置为一个以捕获整个视场。
保存光学配置。现在，我们将设置一系列光学配置，使显微镜聚焦、加载 ROI 面膜并以自动化方式生成模式。第一个光学配置允许我们打印用于自动聚焦当前视场的受托标记。
复制图像光学配置并重命名它，打印受托标记。由于我们在此步骤中进行打印，因此将光束分离器移出光路，并将其替换为适当的二色镜。选择最小的扫描尺寸以节省时间。
由于此步骤不需要成像，将探测器灵敏度设置为零。增加激光功率，实现打印。在扫描区域窗口中，设置变焦最大值并将扫描区域放置在视图的中间。
现在，我们将建立一个 Z 堆栈实验，以解释 PVA 表面的任何不均匀性。将移动设置为相对的 Z 位置。选择合适的 Z 设备。
接下来，复制图像光学配置并重命名它，自动对焦。选择最小的扫描大小并减少扫描区域窗口中的变焦因子，以便视场略大于受托标记。这可确保盖上的其他小功能不会干扰自动对焦。
在设备菜单中，选择自动对焦设置。将扫描厚度设置为 Z 堆栈实验中的扫描厚度。显微镜将扫描这个范围，并找到最好的焦点平面使用信托标记。
接下来，复制图像光学配置并重命名它，加载投资回报率。设置与投资回报率面膜相同的扫描大小，因为面膜将加载到使用此光学配置拍摄的图像上。我们使用 2048 像素实现了分辨率和速度之间的最佳平衡。
现在，我们将设置用于对盖滑进行图案的光学配置。复制打印信托标记光学配置并重命名它，微型模式。将变焦因子设置为一个。
增加刺激激光功率以消融 PVA。选择适当的扫描速度。在ND刺激窗口中，设置ND刺激实验。
在时间安排中添加几个阶段，并设置每个阶段进行刺激。确保刺激区域和持续时间正确。在同一窗口中，使阶段在每个阶段之前移动主 Z 功能。
这再次解释了 Z 方向的任何偏差。最后，设置光学配置，在盖上做一个可见的标签，可以帮助我们找到模式。复制打印受托标记并重命名它，标签表面。
显著增加激光功率，并将变焦设置为一个。将 PVA 涂层盖盖滑移到支架上。对于直立显微镜，请确保 PVA 表面朝下。
将水添加到角落以稳定盖滑。将支架安装到显微镜舞台上。降低目标，并在两者之间加水。
在显微镜软件中，打开 IR 激光快门，在图案调整之前执行自动对齐。切换到图像光学配置。扫描视场，同时缓慢地将目标移近盖滑移。
起初，图像将显得极其暗淡。将目标移近盖滑，直到图像亮度略有增加。这是面向目标的盖滑表面。
继续移动目标，直到亮度降低并再次增加。这是我们将模式化的PVA表面。专注于任何小功能，如盖滑不完美或灰尘，并在 Z 驱动器上设置为零。
切换到标签表面光学配置。单击"捕获"。返回成像和扫描。
玻璃损坏表明标签已成功打印。将舞台移到一到两个视野，以避免玻璃颗粒。扫描以确认。
在设备菜单中，打开舞台运动宏。将变量 M 和 N 设置为将要建模的视图字段的所需数。保存并运行宏。
图案完成后，切换到图像光学配置并扫描图案。每个视野中的图案岛屿应具有清晰的边界，并均匀地反射光线。看起来较暗和不均匀的模式表示不完整的 PVA 去除。
这通常是由于激光功率不足或焦距平面不正确。如果激光功率设置过高，也可能导致 PVA 冒泡。在盖片上电镀细胞后，细胞应扩散并形成图案的形状。
这是一个在十字弓图案上镀的人类成纤维细胞的免疫荧光图像。细胞显示一个行为丰富的跛脚皮迪亚边缘。两侧有厚的腹应力纤维，两侧有由横弧连接的后部应力纤维。
Myosin 灯链位于密集的跛脚皮皮亚边缘后面，沿 actin 捆绑显示条纹图案。使用我们的自定义图像处理工具，我们生成了我们感兴趣的蛋白质的平均图像。此图显示上述行为结构在大量模式中是一致的。
虽然我们在平均后丢失了肌素的单个结构，但它沿 actin 捆绑包的本地化是保守的。观看此视频后，您应该能够使用市售的多光子系统设置微模式工作流，而手动工作最少。重要的是要优化自己的系统的激光功率，以避免生成不完整的模式或PVA通过调整自动对焦和微模式步骤中的参数可以达到最大的效率。
除了研究涉及细胞形态的细胞通路外，该技术还可用于药物筛选和其他对细胞形状变化敏感的应用。
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概述
该协议实现了微型图案的自动化制造，用于标准化细胞形状，以研究哺乳动物细胞中的细胞骨架结构。它用户友好，并且与市场上可用的成像系统兼容，消除了对专用设备的需求。
关键研究组成部分
科学领域
- 细胞生物学
- 细胞骨架研究
- 微型图案技术
背景
- 微型图案有助于理解细胞形状与细胞机械之间的关系。
- 许多现有技术需要专用设备，限制了可访问性。
- 该协议允许轻松修改图案，无需重新制造光掩模。
- 自动化图像处理工具提供无偏的平均细胞图像。
研究目的
- 开发一种标准化方法来研究细胞骨架结构。
- 促进无需专用设备进行细胞形状调控的研究。
- 提高标准生物学实验室中微型图案技术的可访问性。
使用的方法
- 在多光子成像系统上的自动化微型图案。
- 利用市场上可用的成像系统。
- 无需重新制造光掩模即可修改图案。
- 图像处理以生成代表性的蛋白质分布。
主要结果
- 成功实现微型图案技术的自动化。
- 标准化细胞形状以便于一致的细胞骨架研究。
- 减少了图案制造所需的时间和资源。
- 提供细胞中蛋白质分布的无偏表示。
结论
- 该协议增强了对哺乳动物细胞中细胞骨架结构的研究。
- 它为缺乏专用设备的实验室提供了一个实用的解决方案。
- 未来的研究可以从该方法的灵活性和效率中受益。
常见问题
Executive Industry Relevance
Automated infrared laser-assisted micropatterning enables precise control of cell geometry, directly addressing variability in cell-based assays and supporting robust quantitative analysis. By standardizing cell shape using accessible imaging platforms, this method enhances predictive confidence in early discovery and screening workflows. The approach facilitates high-throughput studies of morphology-function relationships, supporting portfolio-wide target validation and mechanistic de-risking.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables interrogation of cellular pathways by controlling cell morphology and reducing biological variability.
- Supports functional target validation by standardizing experimental conditions across large cell populations.
- Improves predictive confidence for pathway analysis and mechanistic de-risking in early-stage research.
Screening & Assay Development
- Prepares reproducible, geometry-defined cell systems for downstream compound screening and phenotypic assays.
- Facilitates assay standardization and scalability by automating pattern generation and cell seeding.
- Enables quantitative, high-throughput imaging and analysis of protein localization and cytoskeletal organization.
Translational & Preclinical Research
- Aligns in vitro cell morphology with disease-relevant phenotypes for translational continuity.
- Supports risk-adjusted advancement by providing reproducible, quantitative data across experimental replicates.
- Enhances mechanistic insight into form-function relationships relevant to preclinical model selection.
Pipeline & Workflow Integration
This micropatterning protocol integrates from early discovery through screening and translational research, leveraging standard imaging systems for broad applicability.
- Discovery Biology: Standardizes cell shape to enable hypothesis testing and pathway clarification with reduced confounding variability.
- Screening: Provides assay-ready, reproducible cell systems for reliable compound evaluation and phenotypic screening.
- Analytics: Delivers quantitative, averaged measurements of protein localization and morphology for robust statistical comparison.
- Translational Research: Bridges in vitro findings to disease-relevant systems by controlling cellular architecture.
- Enterprise Reuse: Offers a flexible, reusable workflow adaptable to various substrates and experimental designs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in cell-based assays.
- Operational Value: Streamlines standardization, reproducibility, and scalability of cell patterning workflows.
- Strategic Value: Enables better go/no-go decisions and capital efficiency by minimizing biological variability.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement across discovery and screening programs.
Implementation Considerations
- Requires expertise in imaging system configuration and laser parameter optimization.
- Depends on access to multiphoton or IR laser-equipped imaging platforms.
- Necessitates cross-team standardization of pattern design and imaging protocols.
- Adaptable to coverslips, slides, and glass-bottom dishes for diverse assay formats.
- Pattern quality is sensitive to laser power, focal plane accuracy, and substrate preparation.
