Name: 通过红外激光辅助微模式控制细胞几何 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-07-10T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 4 s
Description: 学习利用红外激光辅助微图案化技术精确控制细胞几何形状，使用标准多光子成像系统即可实现，无需洁净室设备。该方法支持高通量定量分析细胞形态与蛋白定位，适用于药物筛选及细胞形状功能关系研究。

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本工作获得了以下资助：S.P. 获得康诺特基金新研究者奖、加拿大创新基金会、加拿大自然科学与工程研究委员会发现基金项目（项目编号 RGPIN-2015-05114 和 RGPIN-2020-05881）、曼彻斯特大学与多伦多大学联合研究基金以及多伦多大学 XSeed 计划。C.T. 获得了加拿大自然科学与工程研究委员会本科生科研奖学金的支持。

1. 盖玻片预处理
<ol>
	<li>按照 Waterman-Storer（1998）所述方法准备洁净的盖玻片25。</li>
	<li>配制 1% (3-氨基丙基)三甲氧基硅烷（APTMS）溶液，将盖玻片放入该溶液中，在轻微振荡条件下孵育 10 分钟。确保盖玻片在溶液中可自由移动。</li>
	<li>用 dH2O 洗涤盖玻片两次，每次 5 分钟。</li>
	<li>配制 0.5% 戊二醛（GA）溶液，将盖玻片放入该溶液中，在摇床中孵育 30 分钟。对于 25 片盖玻片，使用 50 mL 戊二醛溶液。确保盖玻片在溶液中可自由移动。</li>
	<li>用 dH2O 洗涤盖玻片三次，每次 10 分钟。</li>
	<li>使用自制的盖玻片离心干燥器以 30 秒离心干燥盖玻片。该盖玻片离心干燥器的详细描述已有发表26，并可在网络获取（https://mullinslab.ucsf.edu/home-built-coverslip-drierspinner/）。活化后的盖玻片可在含分隔装置的盒子中彼此分离存放，于 +4 °C 保存最长一个月。</li>
</ol>
2. PVA 涂层
<ol>
	<li>将PVA（98%水解PVA，分子量98000）与dH2O混合，配制成5.6%的溶液。</li>
	<li>在90 °C水浴中溶解该混合物，并立即在生物安全柜中趁热通过0.2 µm滤膜过滤。若储存液出现沉淀，需再次过滤。PVA溶液可在室温下保存3个月。</li>
	<li>在15 mL离心管中，加入一份HCl与八份PVA。轻轻倒置管子数次以混匀。</li>
	<li>取2 mL混合溶液倒入35 mm培养皿中，将洁净且预处理过的盖玻片浸入液体中，注意避免盖玻片粘附于底部。在摇床上室温孵育5分钟。</li>
	<li>小心将盖玻片从溶液中取出。使用盖玻片旋转涂布仪旋涂40秒。在此期间，清洁镊子。将盖玻片转移至盒子中，并在+4 °C干燥过夜。PVA包被的盖玻片可在+4 °C保存长达两周。</li>
</ol>
3. 配置多光子显微镜
注意：本方案经过优化，可在直立或倒置的多光子成像系统上创建特定形状和尺寸的细胞黏附微图案，尤其适用于未配备硬件自动对焦功能的系统。因此，对于每个视野（FOV），图案化脚本会先消融盖玻片上的一个小区域以形成定位标记，然后利用软件自动对焦将显微镜聚焦于盖玻片表面，再消融出所需的微图案。将该脚本在相邻视野中循环运行，可稳定地生成大面积的微图案阵列（5 × 5 mm 或更大），用于限制细胞形态并调控细胞内生物学过程的活性。本方案针对由 NIS-Elements 软件控制的 Nikon A1R MP+ 成像系统开发。若使用其他厂商的成像系统进行图案化，应根据制造商的说明调整光学配置和图案化脚本。
<ol>
	<li>打开显微镜软件。确保 &#34;Apo LWD 25X/1.10W DIC N2&#34; 物镜安装在显微镜上。 
	注意：此处描述的实验方案已针对25倍/1.1数值孔径（NA）水浸物镜进行优化，但也可使用其他物镜进行图案化。读者应注意，使用高倍物镜进行图案化时例如，40倍和60倍）会显著延长加工时间，因为它大幅减少了每个视野中可消融的图案数量。只要低倍物镜能在整个视野范围内提供均匀的照明，并具备足以消融PVA层的激光功率，即可用于图案加工。</li>
	<li>在 A1plus MP 图形用户界面&#160;窗口中，将激光线设置为 750 nm。</li>
	<li>设置 &#34;图像&#34; 光学配置 
	注意：NIS-Elements 为用户提供多种工具（图形界面、采集工作流构建器 JOBS、光学配置和宏），用于控制显微镜硬件。在本方案中，大部分硬件控制通过各种光学配置以及 ND Acquisition 和 ND Stimulation 模块实现。
	<ol>
		<li>在 校准 标签，点击 新型光学构型命名光学配置 &#34;图像&#34;这是通过反射成像盖玻片的基准光学配置。其余选项保持默认设置，并选择合适的物镜。</li>
		<li>在 A1plus MP 图形用户界面 窗口，单击 设置 按钮，以在此光学配置下配置硬件设置。设置 刺激激光器 到 红外刺激，放置 分束器 （BS 20/80）置于光路中，设置 扫描仪单元 到 Galvano 并选择合适的去扫描探测器。</li>
		<li>在 A1plus Compact GUI 窗口中，选择足以捕捉盖玻片上微小特征的扫描尺寸和停留时间（在我们的系统中分别为 1.1 ms 和 1024 像素）。单击 正常 按钮，因此不进行线平均或线积分。确保 使用红外激光 勾选该选项。为简化操作，设置为单向扫描。 
		注意：如果扫描速度是需要考虑的因素，可使用双向扫描。</li>
		<li>在同一窗口中，调节激光功率和探测器灵敏度，以获得明亮但未饱和的盖玻片表面图像。将激光功率设置为最大功率的3%–5%，探测器灵敏度（&#34;HV&#34; 将滑动变阻器调至15 V是一个良好的起点。</li>
		<li>在 A1plus 扫描区域 窗口，设置 缩放 至1以捕获整个视野。</li>
		<li>保存光学配置。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>设置 &#34;打印_财务标记&#34; 光学配置
	<ol>
		<li>复制 &#34;图像&#34; 光学配置并重命名它 &#34;打印_法定标记&#34;.</li>
		<li>在 A1plus Compact GUI 窗口中，选择最小的扫描尺寸和停留时间（在我们的系统上分别为 64 像素和 80.2 ms）。</li>
		<li>由于此步骤无需成像，将检测器灵敏度设为0，并将激光功率提高至30%。较高的激光功率将在预期区域通过热效应去除盖玻片上的PVA层。</li>
		<li>在 A1plus 扫描区域 窗口，设置 缩放 调至最大值（本系统为15.87），并将扫描区域置于视场中央。</li>
		<li>在 ND采集 窗口，设置Z轴层扫实验。将Z轴位置的移动设置为 相对的 并选择合适的Z轴设备。将步长设置为2 µm，Z轴扫描深度设置为上下各10 µm，以校正显微镜载物台或相邻视野间PVA表面可能存在的不平整。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>设置 &#34;自动对焦&#34; 光学配置
	<ol>
		<li>复制 &#34;图像&#34; 光学配置并重命名它 &#34;自动对焦&#34;.</li>
		<li>在 A1plus 扫描区域 窗口，减小 缩放 因此，视野略大于基准标记，以确保盖玻片上的其他微小特征不会干扰自动对焦。</li>
		<li>在 设备 菜单，选择 自动对焦设置将扫描厚度设置为Z-stack实验中Z-stack的厚度（参见步骤3.5.5）。显微镜将扫描该范围，并利用定位标记找到最佳焦平面。步长保持默认设置。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>设置 &#34;加载感兴趣区域&#34; 光学构型
	<ol>
		<li>复制 &#34;图像&#34; 光学配置并重命名它 &#34;加载感兴趣区域&#34;.</li>
		<li>在 A1plus Compact GUI 窗口，将扫描尺寸设置为与ROI掩膜相同。此光学配置将用于捕获图像，以便加载ROI掩膜。我们使用2048像素，以在分辨率和速度之间实现最佳平衡。 
		注意：此捕获的图像在尺寸上必须与 ROI 掩膜完全相同。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>设置 &#34;微图案&#34; 光学构型
	<ol>
		<li>复制 &#34;打印_信任标记&#34; 光学配置并重命名它 &#34;微图案&#34;.</li>
		<li>设置 缩放 因子设为一。</li>
		<li>在 A1plus MP 图形用户界面 窗口中，增加刺激激光功率以消融PVA，并选择合适的扫描速度（在我们的实验中分别为40%和32秒/帧）。</li>
		<li>在 ND刺激 窗口，设置 ND 刺激实验。添加若干相位到 时间安排 并分别设置为 刺激确保 刺激区域 和 持续时间 是正确的。 
		注意：相位数量可根据PVA层的厚度和平整度，以及此光学配置中使用的激光功率进行调整。</li>
		<li>在同一窗口中，启用 StgMoveMainZ(-1.000,1每次相位前执行）函数，以再次校正Z方向上的任何偏差。 
		注意：物镜移动的距离和方向可根据PVA层的厚度和平整度进行调整。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>设置 &#34;标记表面&#34; 光学配置
	<ol>
		<li>复制 &#34;打印_财务标记&#34; 光学配置并重命名它 &#34;标记表面&#34;.</li>
		<li>在 A1plus Compact GUI 窗口，显著增加激光功率并设定 缩放 1。此处使用的高激光功率会物理损伤玻璃盖玻片，并产生肉眼可见的标记，有助于在后续实验中定位图案。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. 生成感兴趣区域掩膜并设置宏
<ol>
	<li>生成 ROI 掩膜
	<ol>
		<li>使用 Adobe Photoshop 或其他可用软件生成一幅 2048 × 2048 的 RGB 图像。该图像对应显微镜下的视场（i.e., 532.48 × 532.48 µm，每像素 0.26 µm）。图像应具有黑色（0, 0, 0）背景。 
		&#8203;注：可使用多种商业或免费图像编辑软件为激光辅助微图案化生成 ROI 掩膜。尽管我们使用 Adobe Photoshop 生成掩膜，GIMP 和 ImageJ/Fiji 也可作为替代的免费选项。</li>
		<li>在黑色背景上绘制 8–12 个白色（255,255,255）图案。图案大小根据细胞类型而定（直径约 200 像素）。在图像中心留出 500 × 500 的空白区域用于自动对焦。在相邻图案之间（&#62;200 像素）以及视场边缘留出足够空间，以实现最佳消融和细胞附着。本方案中提供的图案可在 Github 上获取（https://github.com/PlotnikovLab/Micropatterning）。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>设置宏
	<ol>
		<li>点击 Macro 菜单并选择 New Macro。</li>
		<li>将 Github（https://github.com/PlotnikovLab/Micropatterning）上提供的 &#34;Pattern_Stimulation&#34; 代码导入到&#160;New Macro 窗口中。将此代码保存至合适的文件夹。</li>
		<li>打开另一个 New Macro 窗口，并将 Github（http://github.com/PlotnikovLab/Micropatterning）上提供的 &#34;Stage_Movement&#34; 代码导入其中。确保该代码中的 “Stage_Movement” 工作目录与步骤 4.2.2 中的一致。将 “Stage_Movement” 代码保存至与步骤 4.2.2 相同的文件夹。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
5. 使用光消融技术生成微图案
<ol>
	<li>打开显微镜及其附件。确保在打开前红外激光器已充分预热。</li>
	<li>将经PVA包被的盖玻片转移至载片 holder 上。对于直立显微镜，应确保待消融的PVA面朝下。</li>
	<li>将水滴加至盖玻片边缘以固定盖玻片，并将载片夹持器安装到显微镜载物台上。</li>
	<li>降低物镜，并在盖玻片上加水。 
	注意：此处描述的方案已针对25倍/1.1数值孔径（NA）水浸物镜进行优化。若使用干镜或油浸物镜，应将水替换为相应的浸没介质。当使用水浸物镜生成大面积微图案阵列时，可能会出现蒸发问题。若发生此情况，可将水替换为GenTeal（一种可在药店购买的非处方人工泪液润滑剂）。</li>
	<li>在显微镜软件中，打开红外激光快门 A1plus MP 图形用户界面&#160;窗口。单击 自动对准 在图案化之前，使用按钮对激光进行校准。 
	注意：每次图案化实验开始前，必须执行激光自动对准，因为激光路径的微小偏差会显著影响图案的质量。</li>
	<li>切换到 &#34;图像&#34; 光学配置。在 A1plus Compact GUI 窗口，单击 扫描 在缓慢将物镜移近盖玻片的同时扫描视野。</li>
	<li>仔细观察图像。起初，图像会显得非常暗淡。将物镜逐渐靠近盖玻片，直至图像亮度增加，此时对应的是朝向物镜的盖玻片表面。继续移动物镜，直到亮度下降后再次上升，此时即为待图案化的PVA表面。聚焦于任意微小特征（如盖玻片缺陷、灰尘颗粒）以进行对焦。 等等。在此表面上设置Z轴驱动归零。每次聚焦后务必进行归零操作。 
	注意：尽管盖玻片的两面均涂有PVA，但PVA涂层并未显著改变玻璃的光学特性。我们常规使用干镜、水浸和油浸物镜对这类盖玻片进行成像，未发现未图案化的PVA表面干扰成像。</li>
	<li>切换到 &#34;标记表面&#34; 光学配置。单击 捕获. 返回到 &#34;成像&#34; 光学配置与扫描。玻璃表面应受损并呈现非晶态，受损区域肉眼可见，用于指示后续实验中图案的位置。 
	注意：为了增大可见标签的尺寸，可在多个相邻的视野中重复步骤 5.8。</li>
	<li>再次检查物镜是否大致位于盖玻片中心。确保物镜与盖玻片之间有充足的水。移动载物台1至2个视场，避开玻璃颗粒，并进行扫描确认。</li>
	<li>在 设备 菜单，打开 阶段移动 宏观。检查 模式刺激 工作目录必须正确；否则，刺激将无法进行。设置变量 &#34;模式长度&#34; 和 &#34;图案高度&#34; 到所需的视野（FOVs）数量，以进行图案化。保存并运行该宏。</li>
	<li>图案化完成后，切换到 &#34;成像&#34; 光学配置。再次检查红外激光快门是否已打开 A1plus MP 图形用户界面 窗口。</li>
	<li>移动载物台以观察图案。扫描各图案以检查其质量。</li>
	<li>将盖玻片转移至网格盒中，有图案的一面朝上。</li>
	<li>将图案化盖玻片在4°C下保存，最多可存放一周后再使用。</li>
</ol>
6. 纤连蛋白吸附
<ol>
	<li>在 1 M NaOH 溶液中现配 1 M NaBH4 溶液。按 1:100 的比例加入含 0.2 M 乙醇胺的 pH 8.0 磷酸盐缓冲液中。</li>
	<li>将带有图案的盖玻片转移至 35 mm 组织培养皿中。每张盖玻片加入 1 mL 上述溶液，孵育 8 分钟以淬灭自发荧光，然后用 PBS 洗涤 3 次。</li>
	<li>用 PBS 将纤连蛋白（FN）稀释至终浓度为 10 μg/mL。将盖玻片置于 FN 溶液中，在 +37 °C 下孵育 1 小时。 
	注意：若观察到细胞外基质蛋白在基底上存在显著的非特异性结合，可将 FN 稀释于含 0.1% Pluronic F-12724 的 PBS 中。</li>
	<li>用 PBS 洗涤盖玻片 2 次。若不立即使用，可在 +4 °C 下将其保存于 PBS 中过夜。</li>
</ol>
7. 细胞贴附
注意：以下方案已针对原代人牙龈成纤维细胞进行优化。
<ol>
	<li>将细胞培养至10 cm培养皿中，细胞融合度达到70%。</li>
	<li>将细胞培养基、PBS和0.05%胰蛋白酶置于37 °C水浴中预热。 
	注意：对于与基底黏附较弱的细胞，可考虑使用versene（0.48 mM EDTA）或商品化的无酶解离缓冲液进行非蛋白水解性解离，以增强细胞在图案上的黏附。</li>
	<li>在接种细胞前，将带有图案的盖玻片转移至含有1 mL预热PBS的洁净35 mm组织培养皿中。</li>
	<li>吸除10 cm组织培养皿中的细胞培养基，并用PBS洗涤一次。</li>
	<li>向培养皿中加入700 µL 0.05%胰蛋白酶/EDTA，于37 °C、5% CO2培养箱中孵育1分钟。</li>
	<li>与此同时，吸除覆盖在图案化盖玻片上的PBS，并加入1 mL细胞培养基。</li>
	<li>确认细胞已脱离培养皿表面后，用10 mL细胞培养基重悬胰蛋白酶消化后的细胞，并将1 mL细胞悬液加入图案化盖玻片中。</li>
	<li>将细胞在培养箱中继续培养2–3小时，检查是否有足够数量的细胞黏附于图案上。若已达到要求，更换一次培养基以去除未黏附的细胞。此举可最大限度减少多个细胞落在同一图案上的可能性。 
	注意：细胞黏附时间可能因细胞类型而异。</li>
	<li>再经过3–4小时，或当有足够数量的细胞在图案上充分铺展后，细胞即可用于后续实验。注意不要等待过久，以避免细胞发生分裂。</li>
</ol>
8. 数据采集
<ol>
	<li>在室温下用细胞骨架缓冲液中的 4% PFA 固定细胞 10 分钟27。</li>
	<li>按照针对目标蛋白建立的免疫荧光实验方案进行操作。PVA 涂层盖玻片适用于任何免疫荧光实验方案。</li>
	<li>使用合适的显微镜采集细胞图像。根据实验目的，每个视野可采集一个或多个细胞的图像。</li>
</ol>
9. 图像分析
注意：以下方案允许用户通过显微镜图像的Z轴层扫数据（Z-stacks），获取大量细胞中目标蛋白的平均荧光信号。
<ol>
	<li>在 NIS Elements 中打开获取的图像并进行裁剪，确保每张图像仅包含一个铺展良好的细胞。详细的图像处理步骤见下方脚本。</li>
	<li>安装 Anaconda 并通过 Anaconda Navigator 启动 Spyder。 
	注意：.py 脚本可在任何安装了 requirements.txt 中指定的适当软件包的环境中运行。我们推荐使用 Anaconda，因为它已包含以下代码所需的大多数软件包。</li>
	<li>从 Github 下载脚本（https://github.com/PlotnikovLab/Micropatterning）并在 Spyder 中打开“Pattern_Averaging_3Channels.py” 或 “Pattern_Averaging_4Channels.py” 对于分别具有 3 个通道或 4 个通道的图像。</li>
	<li>根据所获取的图像设置参数。详细说明请参见脚本。</li>
	<li>按压 F5 运行脚本。进度可在控制台面板中跟踪。</li>
	<li>在相同文件夹中获取保存的输出文件。输出图像为所有样本各通道的平均值。Excel 表格显示了每个样本细胞内各通道的平均荧光强度，可用于进一步的定量分析。</li>
</ol>

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</ol>

作者声明不存在利益冲突。

上述结果表明，所描述的红外激光辅助微图案化（微光图案化）方案能够 reproducibly 生成各种形状的黏附图案，从而实现对细胞形态和细胞骨架结构的操控。尽管在微光图案化技术出现前后已开发出多种微图案化方法，该方法仍具有若干优势。首先，它无需通常仅在工程学部门才具备的专用设备和洁净室。事实上，随着多光子显微镜在生物学部门日益普及，微光图案化技术拓展了多光子显微镜的应用范围，并扩大了潜在使用者群体。图案亦可根据需要随时更改&#160;并立即打印，而无需制造需要 lengthy 光刻过程的新母版晶圆。
与现有的微光刻图案化方案相比，本方案的一项改进在于省去了盖玻片制备过程中多个耗时的固化步骤。我们证明，PVA-盖玻片的粘附质量未受影响，图案在制备后两周仍保持完整，并能有效结合细胞。更重要的是，我们通过取消预先设定每个视野（FOV）位置的步骤，提高了图案化过程的自动化程度24。取而代之的是，我们采用了一个易于理解的宏程序，可在精确识别每个视野最佳焦平面的同时，实现大范围区域的图案化。
<p class="jove_content"...

细胞形态是组织形态发生1、细胞迁移2、细胞增殖3和基因表达4等基本生物学过程的关键决定因素。细胞形态的变化由细胞骨架动态重排所导致的质膜形变与外在因素之间复杂的平衡驱动，这些外在因素包括作用于细胞的外部力以及细胞-细胞和细胞-基质黏附的几何特征5。例如，迁移中的间充质细胞在前缘聚合致密的肌动蛋白网络，推动质膜向前延伸，形成宽阔的片状伪足6，同时肌动蛋白-肌球蛋白收缩性促使细胞狭窄的尾部回缩，使细胞脱离当前位置7,8。干扰产生此类特化细胞骨架结构的信号事件会破坏细胞形态和极性，并减缓细胞迁移9。此外，原肠胚形成过程中上皮细胞层的弯曲需要基于肌动蛋白-肌球蛋白的顶端收缩，使细胞及其邻近细胞呈楔形10。尽管这些研究强调了细胞形态的重要性，但细胞形态固有的异质性阻碍了揭示形态与功能之间关联机制的研究进展。
为此，过去三十年中已开发出多种调控细胞形态的方法。这些方法通过以下两种途径实现目标：利用三维模具限制细胞形态，或通过在抗污表面图案化沉积细胞外基质（ECM）蛋白来控制细胞黏附几何形状，后者称为微图形化技术11。本文将综述多年来广受关注的若干技术。
最初作为微电子应用的一种方法而发展起来的基于软光刻的微接触印刷技术，已毫无争议地成为备受青睐的技术12。首先通过选择性地将涂有光刻胶的硅基底暴露于光辐照下，制备出母版晶圆，从而形成具有特定图案的表面13。随后将一种弹性体（如PDMS）浇注到母版晶圆上，形成柔软的&#34;印章&#34;，用于将细胞外基质（ECM）蛋白转移至目标基底11,14。一旦制备完成，同一母版晶圆可用来复制大量PDMS印章，从而获得高度可重复的微米级图案12。然而，由于光刻过程耗时较长，图案难以快速调整。此外，该过程需要高度专业化的&#160;设备和洁净室环境，而这些条件在生物学系中通常不具备。
最近，使用深紫外光进行直接打印&#160;已报道可克服传统基于光刻技术方法局限性的方法。深紫外光透过光掩模照射至涂有聚-L-赖氨酸的玻璃盖玻片的特定区域嫁接的-聚乙二醇。暴露于深紫外光的化学基团可在无需光敏连接剂的情况下发生光转化，从而实现细胞外基质蛋白的结合15缺乏光敏连接剂使得图案化盖玻片在室温下可稳定保存七个多月15该方法无需使用洁净室和光刻设备，且对专业培训的要求较低。然而，由于仍需使用光掩模，对于需要频繁更换图案的实验而言，这仍构成较大障碍。
除了通过在二维表面精确沉积细胞外基质（ECM）蛋白来操控细胞几何形态的方法外，其他方法则通过将细胞限制在三维微结构中来控制细胞形状。许多研究已将上述基于软光刻的技术进行改进，以构建三维而非二维的聚二甲基硅氧烷（PDMS）腔室，用于研究胚胎、细菌、酵母和植物中依赖于形态的生物学过程16,17,18,19。双光子聚合（2PP）也已成为一种领先的微加工技术，能够以纳米级分辨率构建复杂的三维水凝胶支架20。2PP基于双光子吸收原理，即两个在飞秒&#160;脉冲中同时到达的光子被一个分子——此处为光引发剂——同时吸收，从而引发光聚合物的局部聚合21。该技术已被广泛用于打印模拟人体组织天然ECM结构的三维支架，并被证明可对细胞造成较低的光化学损伤22。
十年前，微光刻图案技术的问世使研究人员能够在无需使用难以获取且专业化的设备的情况下制备微米级图案。微光刻图案技术利用红外&#160;激光选择性地热去除涂覆在活化玻璃表面的聚乙烯醇（PVA）特定区域，从而在微米尺度上形成图案23,24。细胞外基质（ECM）蛋白仅能附着于暴露的玻璃表面而无法结合PVA，因此可作为生化信号，实现对细胞铺展动态行为和细胞形态的精确控制。该方法还具有优异的灵活性，因为图案可实现实时快速调整。本文提供了一种利用商用多光子成像系统进行微光刻图案制备的逐步操作方案。该方案专为快速、自动化地构建大面积图案而设计。我们已证实，这些图案可通过限制细胞-ECM黏附的几何构型，高效调控细胞形态。最后，我们展示了该图案化技术能够调节肌动蛋白细胞骨架的组织结构与动态行为。

<table><tbody><tr><td>(3-氨基丙基)三甲氧基硅烷</td><td>Aldrich</td><td>281778</td><td></td></tr><tr><td>10 cm 细胞培养皿</td><td>VWR</td><td>10062-880</td><td>聚苯乙烯，TC 处理，带透气盖</td></tr><tr><td>25倍长工作距离水浸物镜</td><td>Nikon</td><td>MRD77225</td><td></td></tr><tr><td>3.5 cm 细胞培养皿</td><td>VWR</td><td>10861-586</td><td>聚苯乙烯，TC 处理，带透气盖</td></tr><tr><td>4',6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）</td><td>Thermo</td><td>62248</td><td>1 mg/mL 盐酸盐溶液</td></tr><tr><td>牛血清白蛋白</td><td>BioShop</td><td>ALB005</td><td></td></tr><tr><td>杜氏磷酸盐缓冲液</td><td>Wisent</td><td>311-425-CL</td><td></td></tr><tr><td>乙醇胺</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E9508</td><td></td></tr><tr><td>纤连蛋白</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>FC010</td><td>1 mg/mL，pH 7.5 缓冲液</td></tr><tr><td>纤连蛋白抗体</td><td>BD</td><td>610077</td><td>小鼠来源</td></tr><tr><td>Fiji</td><td>ImageJ</td><td></td><td>版本 1.53c</td></tr><tr><td>荧光鬼笔环肽</td><td>Invitrogen</td><td>A12380</td><td>568 nm</td></tr><tr><td>玻璃盖玻片</td><td>VWR</td><td>16004-302</td><td>22 &amp;times; 22 mm</td></tr><tr><td>戊二醛</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>16220</td><td>25% 水溶液</td></tr><tr><td>盐酸</td><td>Caledon</td><td>6025-1-29</td><td>37% 水溶液</td></tr><tr><td>红外激光器</td><td>Coherent</td><td>Chameleon Vision</td><td></td></tr><tr><td>最低必需培养基 &amp;alpha;</td><td>Gibco</td><td>12561-056</td><td></td></tr><tr><td>封片剂</td><td>Sigma</td><td>F4680</td><td></td></tr><tr><td>小鼠二抗</td><td>Cell Signaling Technology</td><td>4408S</td><td>山羊来源，488 nm</td></tr><tr><td>多光子显微镜</td><td>Nikon</td><td>A1R MP+</td><td></td></tr><tr><td>肌球蛋白轻链抗体</td><td>Cell Signaling Technology</td><td>3672S</td><td>兔来源</td></tr><tr><td>NIS Elements</td><td>Nikon</td><td></td><td>版本 5.21.03</td></tr><tr><td>硝酸</td><td>Caledon</td><td>7525-1-29</td><td>70% 水溶液</td></tr><tr><td>Photoshop</td><td>Adobe</td><td></td><td>版本 21.2.1</td></tr><tr><td>Pluronic F-127</td><td>Sigma</td><td>P2443</td><td>粉末</td></tr><tr><td>聚乙烯醇</td><td>Aldrich</td><td>341584</td><td>分子量 89000-98000，98% 水解</td></tr><tr><td>兔二抗</td><td>Cell Signaling Technology</td><td>4412S</td><td>山羊来源，488 nm</td></tr><tr><td>摇床</td><td>VWR</td><td>10127-876</td><td>又称模拟摇床</td></tr><tr><td>硼氢化钠</td><td>Aldrich</td><td>452882</td><td>粉末</td></tr><tr><td>氢氧化钠</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S8045</td><td></td></tr><tr><td>磷酸氢二钠</td><td>Sigma</td><td>S5136</td><td>粉末</td></tr><tr><td>磷酸二氢钠</td><td>Sigma</td><td>S5011</td><td>粉末</td></tr><tr><td>Spyder</td><td>Anaconda</td><td>4.1.4</td><td></td></tr><tr><td>胰蛋白酶</td><td>Wisent</td><td>325-042-CL</td><td>0.05% 水溶液，含 0.53 mM EDTA</td></tr></tbody></table>

通过红外激光辅助微图形化技术控制细胞几何形态

Control of Cell Geometry through Infrared Laser Assisted Micropatterning

微图形化技术是细胞生物学领域中一种成熟的方法，用于研究细胞区室形态与功能之间的关联，同时避免因天然细胞间差异所带来的复杂性。为了标准化细胞形态，可通过三维模具限制细胞，或利用黏附岛控制其黏附几何形状。然而，基于光刻和深紫外蚀刻的传统微图形化技术严重依赖洁净室或专用设备。本文介绍一种经 Doyle 等人改良的红外激光辅助微图形化技术（microphotopatterning），该技术可方便地使用市售成像系统搭建。在本实验方案中，我们采用尼康 A1R MP+ 成像系统，利用红外（IR）激光在聚乙烯醇包被的盖玻片上消融预设区域，从而生成微米级精度的微图形。我们使用自定义脚本，在未配备硬件自动对焦功能的系统中实现高效、准确的自动化图形制备。结果表明，该红外激光辅助微图形化（microphotopatterning）方案可产生明确的图形，细胞仅附着于这些图形区域并呈现预期形状。此外，由于细胞形态实现了标准化，可对大量细胞的数据进行平均分析。结合高分辨率成像与定量分析，本方案生成的图形可用于相对高通量筛选，以鉴定介导形态与功能之间关联的分子因子。

通过微图形化技术获得的实验数据质量在很大程度上取决于图形的质量。为了评估上述方法生成图形的质量，我们首先使用反射显微镜检查盖玻片上光刻蚀区域的形状和尺寸。我们发现，每个单独的图形与刻蚀掩模非常相似，边界清晰，表面能够均匀反射光线（图2B）。可根据所需的细胞骨架结构打印多种不同形状和尺寸的图形，但我们采用了最适合本研究目的的十字弓形。原子力显微镜（AFM）显示，这些图形高度约为140 nm，表面光滑，整体拓扑变化极小（图2F）。次优的图形化参数设置（如激光功率过低或焦平面不正确）会导致聚乙烯醇（PVA）表面未能完全去除，表现为较暗、不完整的图形，并伴有不均匀的表面形貌（图2C）。若激光功率设置过高，则会导致PVA“起泡”，在极端情况下还会造成盖玻片表面损伤，这也是不可取的（图2D）。
在初步实验中，我们尝试通过在同一盖玻片上消减多个视野（FOV）来...

本文介绍的实验方案可实现微图案的自动化制备，从而标准化哺乳动物细胞的细胞形态，用于研究细胞内的细胞骨架结构。该技术操作简便，可使用市售的成像系统进行搭建，无需标准细胞生物学实验室难以获得的专用设备。

微图案化是细胞生物学领域中一种成熟的技术，用于研究细胞形态与功能之间的关联……

微图案化是一种强大的技术，科学家利用它来理解细胞形态与细胞内分子机器活性之间的关联。尽管已有多种技术可让研究人员调控细胞形态，但这些技术通常需要某些生物学实验室难以获得的专业设备。本视频将指导您完成在商用多光子成像系统上实现微图案化自动化的必要步骤。本方案的一个优势在于无需使用专用设备。此外，图案可轻松更改，而无需重新制作光刻掩模，后者通常是微图案化过程中最耗时的步骤。我们的图像处理工具能够以无偏且自动化的方式生成平均细胞图像，反映蛋白质的代表性分布情况。尽管我们在实验中使用盖玻片，但自动化工作流程也允许您在载玻片和玻璃底培养皿上进行图案化。该方法的可视化演示非常重要，因为正确的显微镜设置对于系统实现成像、识别正确的焦平面以及自动图案化至关重要。请按照说明制备PVA溶液。将一份 HCl 加入八份 PVA 中。轻轻倒置离心管数次以混匀。取两毫升该溶液加入小型培养皿中，并将一块洁净的预处理盖玻片浸入液体中。在摇床上室温孵育5分钟。小心地将盖玻片从溶液中取出。使用盖玻片旋转涂布仪旋转涂布40秒。在此期间，清洁镊子。将盖玻片转移至盒子中，并在4°C下过夜干燥。打开显微镜软件。首先，将激光线设置为 750 纳米。然后建立一种名为“图像”的新光学配置。这是基础光学配置，可使我们通过反射物对盖玻片进行成像。保留其他选项为默认设置，并选择合适的物镜。在此光学配置下设置硬件参数。将红外激光器设为我们的刺激激光器。将分光镜放入光路中，以使用红外激光进行成像。选择振镜扫描单元和相应的D扫描探测器。选择足以捕捉盖玻片上微小特征的扫描尺寸和停留时间。确保选中“使用红外激光”选项。调节激发激光功率和探测器灵敏度，以获得明亮但未饱和的盖玻片表面图像。在扫描区域窗口中，将缩放倍数设置为1，以捕获整个视野。保存光学配置。现在我们将设置一系列光学配置，以实现显微镜的自动聚焦、加载感兴趣区域（ROI）掩模并自动生成图案。第一种光学配置允许我们打印用于在当前视野中自动聚焦的基准标记。复制图像光学配置并将其重命名，打印定位标记。由于此步骤中需要进行打印，将分光镜移出光路，并替换为合适的二向色镜。选择最小的扫描尺寸以节省时间。由于此步骤无需成像，将检测器灵敏度设为零。提高激光功率以启用打印。在扫描区域窗口中，将缩放调至最大，并将扫描区域置于视野中央。现在我们将设置一个Z轴层扫实验，以校正PVA表面可能存在的不平整。将Z轴位置的移动模式设为相对移动，并选择合适的Z轴设备。接下来，复制图像光学配置并将其重命名为“自动聚焦”。在扫描区域窗口中选择最小的扫描尺寸，并降低放大倍数，使视野略大于基准标记。这可以确保盖玻片上的其他微小特征不会干扰自动聚焦。在“设备”菜单中，选择“自动聚焦设置”。将扫描厚度设置为Z轴堆叠实验中的厚度。显微镜将扫描此范围，并利用定位标记找到最佳焦平面。接下来，复制图像光学配置并将其重命名为“加载 ROI”。将扫描尺寸设置为与 ROI 掩膜相同，因为该掩膜将被加载到使用此光学配置拍摄的图像上。我们使用了 2048 像素，以在分辨率和速度之间达到最佳平衡。现在我们将设置用于在盖玻片上形成图案的光学配置。复制打印定位标记的光学配置，并将其重命名为“Micropattern”。将缩放系数设置为1。增加刺激激光功率以消融PVA。选择合适的扫描速度。在ND刺激窗口中，设置一个ND刺激实验。在时间计划中添加若干相位，并将每个相位设置为刺激模式。确保刺激区域和持续时间正确。在同一窗口中，启用每个相位前的载物台移动主 Z 轴功能。这再次补偿了Z方向上的任何偏差。最后，设置一个光学配置，在盖玻片上生成一个可见标记，以帮助我们定位图案。复制打印基准标记并将其重命名为“Label surface”。显著增加激光功率，并将缩放倍数设置为1。将涂有PVA的盖玻片转移至样品 holder 上。对于直立显微镜，确保PVA表面朝下。向盖玻片边缘加水以固定盖玻片。将载物台支架安装到显微镜载物台上。降低物镜，并在物镜与盖玻片之间加水。在显微镜软件中，打开红外激光快门，并在进行图案化之前执行自动对准。切换至成像光学配置。在缓慢移动物镜靠近盖玻片的同时，扫描视野。最初，图像会显得非常暗淡。将物镜向盖玻片靠近，直至图像亮度略有增加。此时对准物镜的是盖玻片的表面。继续移动物镜，直到亮度下降后再次上升。此即为我们将要进行图案化的PVA表面。对准任意微小特征（如盖玻片缺陷或灰尘）进行聚焦，并将Z轴驱动器归零。切换至标签表面光学配置。点击“Capture”（捕获）。返回成像并进行扫描。玻璃损伤表明标签已成功打印。将载物台移动一到两个视野，以避免玻璃颗粒。扫描确认。在设备菜单中，打开载物台移动宏。将变量 M 和 N 设置为需要进行图案化的视野数量。保存并运行该宏。图案化完成后，切换至成像光学配置并扫描各个图案。每个视野中的图案岛应具有清晰的边界，并均匀反射光线。若图案显得较暗且不均匀，则表明聚乙烯醇（PVA）未完全去除。这通常是由于激光功率不足或焦平面不正确所致。如果激光功率设置过高，也可能导致PVA产生气泡。在盖玻片上接种细胞后，细胞应充分铺展并呈现图案的形状。这是一张人成纤维细胞在十字弓图案上培养的免疫荧光图像。该细胞显示出富含肌动蛋白的片状伪足边缘，两侧有较粗的腹侧应力纤维，以及由横向弓状纤维连接的背侧应力纤维。肌球蛋白轻链位于致密的片状伪足边缘后方，并沿肌动蛋白束呈现条纹状分布。利用我们定制的图像处理工具，生成了目标蛋白的平均图像。该图像显示，上述肌动蛋白结构在大量样本中具有一致性。尽管在平均化处理后我们失去了肌球蛋白的单个结构，但其沿肌动蛋白束的定位得以保留。观看本视频后，您应能够使用市售的多光子系统，以极少的手动操作建立微图案化工作流程。优化您自身系统的激光功率非常重要，以避免产生不完整的图案或PVA。通过调整自动对焦和微图案化步骤中的参数，可实现最高效率。除了研究涉及细胞形态的细胞通路外，该技术还可应用于药物筛选及其他对细胞形状变化敏感的领域。

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科研

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