通过流式细胞术分析人髓系U937细胞中SAMHD1的限制作用

随着人们对细胞因子在巨噬细胞感染HIV过程中作用的兴趣日益增加，我们开发了一种灵活的分析系统，尤其适用于在U937细胞中不表达的SAM HD1。该系统的主要优势在于其灵活性。一旦建立，该系统即可用于分析多种蛋白质、细胞或靶向病毒。

保持细胞的健康状态，并熟练掌握多色流式细胞术非常重要。在开始分析前10分钟打开流式细胞仪和计算机。确保废液桶已清空，鞘液箱已充满。

然后登录并打开分析软件。移动机械臂后，取下水管。将流速调至最高，然后按引液键。

等待指示灯熄灭后，重复此过程三次。将水管重新接回，以高流速运行三分钟。随后将流速调至低速，按下待机键直至开始采集。

选择实验，新建实验，然后点击确定以选择空白实验；右键单击实验并添加新样本。点击确定进入空白面板。右键单击以重命名为合适的名称，并通过点击加号展开以显示新试管。

双击试管以在检查器中查看流式细胞仪的设置。在参数菜单中，删除除蓝色激光53030和黄色激光61020以外不需要的荧光染料。在工作表中，通过单击相应图标并点击坐标轴标签来更改坐标轴，创建前向散射面积对侧向散射面积的散点图、YFP直方图、RFP直方图以及RFP对YFP的散点图。

加载未感染且未转导的对照样本，然后在仪器上点击运行。接着在采集仪表板中点击采集。在仪表板中调节前向散射和侧向散射电压，使细胞位于左下象限。

圈选该细胞群，并将其标记为 P1。右键单击其他图谱并选择显示 P1，以从后续分析中去除碎片。调低 RFP 和 YFP 的电压，使峰位于直方图的左侧。

加载YFP的单色对照并点击采集。在控制面板中调节YFP电压，使荧光最强的细胞处于检测器的检测范围内。然后对RFP对照重复相同操作。

选择实验。进入补偿设置，选择创建补偿对照，点击“确定”以切换至正常工作表，然后选择未染色的正常工作表。点击“运行”并采集未染色对照样本。

在完整细胞周围圈选门P1并记录。移除试管，将仪器置于待机状态。右键点击P1。

单击“应用于所有补偿对照”，然后切换到RFP正常工作表。按下“运行”，记录单色RFP对照，软件将自动圈定阳性细胞。将仪器置于待机状态，并对YFP对照重复相同操作。

选择实验，进入补偿设置，选择计算补偿，然后点击链接并保存。切换到全局工作表，返回样本管。采集用野生型 SAMHD1 转导并感染 HIV-RFP 的细胞，检查在 YFP 和 RFP 对应的象限四个角是否可见四个不同的细胞群，且这些象限在垂直和水平方向上对齐。

取出试管并按下待机键。重新加载未转导、未感染的样本，然后按下运行键。在采集仪表板中，将停止门设为P1，并设置记录事件数为30,000个事件。

按下录制按钮。每检测一个样本后，按下“下一个样本管”按钮，依次对其他样本和对照进行相同操作。在运行过程中或结束后重新命名样本，并将数据导出为 .FCS 文件。

打开软件，将所有 FCS 文件拖入仪表板。选择补偿对照，将其拖入补偿子文件夹中。双击未转导且未感染的样本管以打开文件，生成前向散射 a 与侧向散射 a 的图谱。

选择多边形工具，并在左下角排除碎片，圈选完整细胞群体，命名为“cells”。移动标签位置，避免遮挡细胞。将此门控拖动至“所有样本”栏中的全部样本管。

使用水平箭头按钮滚动查看整个细胞群，以确保每管的设门恰当。双击细胞群，调整坐标轴为高度（height）对面积（area）。使用矩形门选中单一的大细胞群，以排除双联体，并允许软件自动建议将其命名为单细胞。

然后，将此门应用于所有细胞群体，并检查各样本的设门是否合适。选择未感染、未转导样本的单细胞群体。将Y轴更改为YFP的补偿蓝色激光，X轴更改为RFP的补偿黄色激光。

选择象限门控工具，点击阴性细胞群的右上极端区域。通过将该初步门控拖动到“所有样本”栏中的父门，将其应用于所有单细胞群。如果象限门控未能满意地分离细胞群，可使用多边形工具对各个象限进行单独门控。

滚动至野生型 SAM HD 单一样本，检查未转导的 YFP 阴性细胞与 YFP 阳性细胞之间的正确设门。使用等高线图区分阴性细胞与微弱 YFP 信号的细胞。选择适用于所有样本的 YFP 阴性和阳性细胞之间的最佳分界，并逐个滚动查看各样本，以确认相对于 YFP 阳性率的设门准确性。

滚动至未转导的 HIV RFP 感染样本，检查未感染的 RFP 阴性细胞与感染的 RFP 阳性细胞之间的设门是否正确。如有需要，可使用等高线图视图，并滚动查看其余样本，以确认所有样本的设门均有效。每个样本需要四个象限。

Q1 YFP 阳性，Q2 双阳性，Q3 RFP 阳性，Q4 双阴性。打开表格编辑器，将四个象限门拖入仪表板。从下拉菜单中选择文件和 Excel。

选择文件保存位置，然后点击创建表格。根据本地文件命名规范保存生成的电子表格。点击布局编辑器图标，以导出图示和设门策略的示意图。

选择每个群体，并将其拖动到编辑器中，设置所需的坐标轴、标签和间距。若要在批次部分为所有样本创建包含相同图表的布局，请在列中输入“1”，然后点击“创建批次报告”。在文件菜单中，选择“缩放至宽度”并避免分页。

然后以所需的文件格式保存。在导出的电子表格中，按照文稿中的描述生成各列。使用适当的数据分析软件对每个 SAM HD 单个构建体的重复数据进行平均，并计算限制性比率值。

针对最佳和次佳数据生成了代表性的YFP与RFP图。次佳数据图显示HIV感染水平过低，导致补偿和设门困难。限制性比值为0.5，高于预期的0.3比值。

针对SAM HD1突变体相对于野生型和阴性对照的限制效率比值，在最优数据和次优数据条件下均生成了相应的图示。在最优数据中，野生型表现出预期的约0.2的限制效率，而阴性对照HD 206至7个氨基酸突变体的限制效率比值为1.0。R372D突变体与野生型相比具有显著差异，但与阴性对照相比无显著差异，且失去了限制能力。

在次优数据中，阴性对照组表现符合预期，但野生型由于感染率较低，其限制比为0.5。R143D突变体表现出介于两者之间的表型，与野生型和阴性对照组相比均有统计学差异。G209S变异体与野生型相比具有显著差异，但与阴性对照组相比无显著差异，因此已丧失限制能力。

拥有足够数量的对照细胞非常重要，尤其是对于初次进行流式细胞术的实验者而言。在此之后或同时，可对相同的突变体进行生化分析，以形成一个全面的图景。