一种高通量酶偶联活性检测法用于研究小分子与dNTP酶SAMHD1的相互作用

该方法可帮助我们鉴定哪些化疗药物能够被SAMHD1水解，并可用于筛选该酶的小分子抑制剂。该技术的主要优势在于操作简单、成本低廉，且能够获得大量关于不同小分子与该酶相互作用的信息。实验操作将由本课题组的博士后研究员Miriam进行演示。

首先，通过向SAMHD1完全反应缓冲液中加入Tween-20和TCEP，使其终浓度分别为0.005%和0.3毫摩尔，配制完全SAMHD1反应缓冲液。在完全SAMHD1反应缓冲液中加入EDTA，使其终浓度为7.9毫摩尔，配制EDTA终止溶液。通过将10份MG储备液与2.5份7%钼酸铵和0.2份11%Tween-20混合，配制孔雀绿（MG）工作溶液。

使用多通道移液器，在透明圆底聚丙烯96孔板中，用适当的溶剂将待测化合物进行连续稀释，使其浓度为最终浓度的100倍。随后用完整的SAMHD1反应缓冲液进一步稀释这些化合物至最终浓度的25倍，以保持最终溶剂浓度低于1%。将5微升稀释后的组分转移至透明384孔平底检测板的相应孔中，并对仅含溶剂的对照样品重复该操作。在酶预混液的配制过程中，将重组人SAMHD1蛋白和重组焦磷酸酶用完整的SAMHD1反应缓冲液稀释至所需最终浓度的4倍。

通过将溶液用完全SAMHD1反应缓冲液稀释，配制50微摩尔浓度的激活剂或底物dGTP。向含有化合物稀释液和仅溶剂对照的孔中加入5微升SAMHD1焦磷酸酶主混合液，向无酶对照孔中加入5微升完全SAMHD1反应缓冲液。然后向所有孔中加入10微升dGDP溶液以启动反应，并在室温下孵育20分钟。

为终止反应，加入 20 微升 EDTA 终止液。向所有孔中加入 10 微升 MG 工作液后，使用轨道微孔板振荡器混匀内容物，并以 1000 × g 离心 1 分钟。在室温下孵育 20 分钟，然后在微孔板读板仪中于 630 纳米处读取吸光度。

计算阳性对照孔的标准差，然后计算其平均值。同样地，对于阴性对照孔，计算其标准差，然后计算平均值。Z因子是反映实验检测质量的一个指标。

将每个吸光度值归一化为阳性和阴性对照的平均值，设定阳性对照为100% SAMHD1活性，阴性对照为0% SAMHD1活性。以SAMHD1活性为化合物浓度的函数作图，并拟合四参数可变斜率剂量-反应曲线，从而确定化合物的半数最大抑制浓度（IC50）。

将核苷酸类似物储备液和完整的SAMHD1反应缓冲液稀释至最终浓度的四倍，并取五微升转移至384孔检测板的相应孔中。为制备酶SAMHD1或焦磷酸酶主混合液，将重组人SAMHD1蛋白和大肠杆菌（Escherichia coli）焦磷酸酶用完整的SAMHD1反应缓冲液稀释至所需最终浓度的两倍。仅制备焦磷酸酶溶液时，将重组大肠杆菌（Escherichia coli）焦磷酸酶用完整的SAMHD1反应缓冲液稀释至所需最终浓度的两倍。

同样，通过将储备液用完全SAMHD1反应缓冲液稀释至最终浓度的四倍，制备激活剂GTP和dGTPαS。将5微升激活剂（GDP、dGTPαS或完全SAMHD1反应缓冲液）分别加入含有核苷酸类似物的384孔检测板的相应孔中。通过向相应孔中加入10微升SAMHD1焦磷酸酶预混液、单独的焦磷酸酶或完全SAMHD1反应缓冲液启动反应，并在室温下孵育20分钟。

使用EDTA终止液终止反应后，向所有孔中加入10微升MG工作溶液。混匀孔内溶液后，以1000 × g离心1分钟，并在室温下孵育20分钟。随后在630纳米处测定吸光度。

计算仅含焦磷酸酶的反应孔的平均吸光度值，该值即为背景值。然后从SAMHD1或焦磷酸酶反应的相应孔中减去该背景值。最后，绘制每种核苷酸类似物在缓冲液、GTP以及dGTPαS条件下的校正后吸光度值。

本研究中，随着磷酸钠浓度的增加，在与孔雀绿试剂孵育后吸光度随之升高，并在0.25毫摩尔浓度时达到饱和。磷酸盐的线性检测范围为0.004至0.03毫摩尔。图中展示了实现可测SAMHD1活性所需的分析组分要求。

单独的 SAMHD1 或焦磷酸酶在存在 dGTP 的情况下均无法生成有机磷酸盐。然而，当所有检测组分均存在时，观察到信号增加。SAMHD1 抑制剂化合物的剂量反应曲线显示，随着浓度增加，可有效抑制 SAMHD1 活性。

体外实验表明，随着羟基脲剂量的增加，SAMHD1活性未受影响，提示羟基脲并不抑制SAMHD1的活性。dGTP可结合两个别构位点，从而激活SAMHD1，使其随后在催化位点水解该核苷酸；而其余三种 canonical dNTPs 必须首先由GTP激活第一个别构位点，才能结合第二个别构位点，并在催化位点被水解。对于核苷类似物，氯法拉滨三磷酸可在GTP存在时激活第二个别构位点并作为底物被水解，因此兼具别构激活剂和底物的双重功能。

然而，只有阿糖胞苷三磷酸能够占据催化位点，而dGTP alpha S是观察活性所必需的。吉西他滨三磷酸未观察到活性。在此测定中通过物理方法（如热 shift 测定）鉴定出抑制 SAMHD1 的小分子后，可进一步用于探究靶点结合情况。

本文所示方法帮助我们明确了哪些抗癌药物可被SAMHD1水解，并确立该酶作为克服药物耐药性的潜在治疗靶点。