Name: 将原发性癌症相关纤维细胞与乳腺癌的合成素 Murine 模型分离，用于靶向纳米粒子的研究 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-05-14T14:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 2 s
Description: 学习从三阴性乳腺癌小鼠模型中分离和培养原代癌症相关成纤维细胞的方法，用于靶向肿瘤微环境的新型纳米粒子临床前研究。该方案可实现高效分离并保持细胞特性。

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本研究由意大利癌症研究协会（Associazione Italiana per la Ricerca sul Cancro，AIRC）资助，项目编号IG 2017-ID. 20172，项目负责人科西·法比奥（Corsi Fabio）。SM感谢支持其职位的儿科临床研究中心“Romeo and Enrica Invernizzi”。AB感谢AIRC（项目编号ID. 20172）和米兰大学提供的研究奖学金。LS和MS的博士后及博士奖学金由米兰大学资助。

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作者无任何利益冲突需要披露。

CAFs 逐渐被认为是重塑细胞外基质、促进转移进展以及限制药物进入肿瘤部位的关键参与者34。然而，由于其异质性，CAFs 的作用仍存在争议——某些 CAFs 具有促肿瘤作用，而其他一些亚型似乎具有抑制肿瘤的功能。在此背景下，分离 CAFs 可能具有重要意义，有助于进一步阐明其在癌症进展中备受争议的作用，从而带来重要的临床意义12,31。此外，成功从人源和临床前小鼠肿瘤模型中提取 CAFs 将有助于开发新的靶向 CAFs 的药物。本文报道了一种从同源性临床前乳腺癌模型中高效分离和培养原代 CAFs 的方法。根据经验，三个实验步骤在很大程度上影响该方案的成功率。
第一个要点是快速操作，以避免细胞悬液发生聚集，从而降低在柱中形成凝块以及细胞流出减缓的风险：事实上，当通过柱子的细胞发生聚集时，分离过程次优的概率增加，最终培养物中会出现“污染”性细胞克隆。第二个要点是在去除步骤后将来自不同肿瘤的细胞合并，以确保在最终富集步骤中有足够的细胞通过。最后一个关键问题是将提取的细胞以高密度接种，通常从24孔板的一个孔开始，以促进细胞生长和克隆扩增，持续进行4–5次传代。如果细胞接种密度过低，它们会在自由表面扩展并迅速停止增殖。
已有若干研究描述了人源和鼠源癌症相关成纤维细胞（CAF）的提取方法，以研究其在促进肿瘤发生和发展侵袭性中的作用。这些研究已涵盖多种肿瘤类型，包括乳腺癌、黑色素瘤、胆管癌和胰腺导管腺癌35,36,37,38。然而，由于缺乏特异性的CAF标志物以及CAF自身的异质性，这些提取方法的结果仍不理想。
在此，利用分离的细胞验证了经抗FAP靶向基团功能化的HFn纳米笼对CAFs的靶向能力。采用CAFs的原代培养细胞具有显著优势，可实现对纳米策略的有效验证 离体 比直接进行更为简单且成本效益更高的结合实验 体内 在纳米药物优化的这一初步阶段。
在这方面， 离体 对CAFs的检测可先于 体内 通过筛选和选择最有望靶向CAF的纳米颗粒，动物实验得以减少，从而实现对CAF的最佳靶向。本文介绍的CAF模型还可用于纳米颗粒载药后的初步疗效研究。动物实验仅在后续阶段用于评估生物分布、药代动力学及疗效研究。
目前，多种靶向癌症相关成纤维细胞（CAF）的纳米药物正在研发中，例如用于乳腺癌光动力治疗的铁蛋白纳米笼，以及用于前列腺癌模型中递送多柔比星的基于多肽的纳米颗粒39,40。然而，鲜有研究聚焦于将CAF分离作为细胞平台用于纳米药物的优化。&#160;
该方案存在一些局限性。首先，该方案耗时较长，需要准备和购买多种试剂和材料。其次，由于4T1乳腺肿瘤中CAFs数量稀少，其得率较低。在达到所需细胞数量后，应尽快规划并开展纳米颗粒实验，因为原代CAFs会经历衰老，无法在体外长期培养。总之，这种CAFs的分离、培养和表征方法可成为加速开发新型靶向纳米药物以对抗癌症的有力工具。

在过去的几十年中，人们逐渐认识到，仅仅杀死肿瘤细胞通常不足以根除恶性肿瘤，因为肿瘤微环境可能促使肿瘤复发并诱导治疗耐药性1,2。因此，一种新的治疗范式应运而生：靶向肿瘤间质，剥夺肿瘤的支撑因素，从而增强化疗药物的疗效3,4,5。特别是癌症相关成纤维细胞（CAFs），在许多实体瘤中被视为一个重要的间质靶点6,7。CAFs 是一类高度异质性的细胞，通过分泌生长因子、细胞因子和趋化因子与肿瘤细胞及免疫系统细胞相互作用；构建并重塑细胞外基质；并促进转移灶的形成8,9,10,11,12。根据肿瘤类型的不同，CAFs 可表现出促肿瘤功能，而其他 CAF 亚型则似乎具有抑制肿瘤的作用13,14。为了更清楚地阐明这种二元性，对原发性和转移性肿瘤来源的 CAFs 进行全面表征至关重要。
在此背景下，一个新兴的研究领域聚焦于开发纳米级制剂，旨在通过递送能够重塑肿瘤微环境的活性分子和药物，以靶向和/或清除癌症相关成纤维细胞（CAFs）15,16,17,18。已有多种类型的纳米颗粒被设计用于通过细胞毒性药物实现CAF消融，诱导针对CAF的光动力治疗，或通过将CAF逆转为静息状态或诱导其表达肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体（TRAIL），从而触发邻近癌细胞的凋亡16,19。此外，许多纳米颗粒具备主动靶向特定生物标志物的潜力，这为选择性靶向CAF亚群带来了希望。尽管成纤维细胞活化蛋白（FAP）对CAF的绝对特异性仍存争议，但它被认为是促肿瘤间质中最具有前景的靶点之一，并已被用于引导纳米药物的递送，从而为开发靶向CAF的纳米治疗策略开辟了道路20,21,22。
本文描述了从小鼠同源性乳腺癌模型中分离原代癌相关成纤维细胞（CAFs）的方法，并报道了这些细胞在研究靶向识别CAF标志物FAP的工程化纳米颗粒的靶向能力中的应用。铁蛋白纳米笼被用作候选纳米系统以建立该方法，因其表面暴露的靶向基团可调节其递送特异性。23,24此外，铁蛋白已被成功证实为用于抗肿瘤应用的优异生物相容性载体，可促进载荷在肿瘤组织中的快速富集25,26,27迄今为止，针对癌症相关成纤维细胞的纳米系统临床前研究已涉及 体外 在培养中用转化生长因子-β刺激成纤维细胞系，以诱导细胞活化及CAFs部分免疫表型特征的表达进行检测28,29该方法通常应用于永生化细胞系（如NIH3T3、LX-2），操作快速简便，可在数小时至数天内获得活化细胞。其局限性在于，尽管 体外 刺激可诱导部分与活化的肌成纤维细胞相关的基因表达，但无法完全重现真实CAFs的所有生物学特性，尤其是其异质性 体内.
另一种策略涉及从人或小鼠肿瘤样本中分离原代CAFs30,31这确保了CAFs的活化发生在生理学背景下，并维持了CAFs亚群的异质性。根据研究目的，CAFs可来源于不同组织来源，从而提供了研究最接近真实生理条件的可能性。本文所述方案对于希望在小鼠乳腺癌模型中对靶向CAFs的新型纳米颗粒功能进行初步评估的科研人员具有重要价值。分离获得的CAFs可用于筛选出具有足够前景、可进入后续研究阶段的纳米颗粒。 体内 在癌症动物模型中的评价。这将在纳米颗粒制备的初始阶段具有重要意义，推动纳米技术研究人员主要通过优化配体固定化策略来改进纳米颗粒的设计，以实现最佳的靶向性能。&#160;

<table><tbody><tr><td>ACK裂解缓冲液</td><td>Lonza</td><td>10-548E</td><td>储存于 +15&amp;deg; 至 +30 &amp;deg;C.</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 山羊抗人抗体</td><td>免疫学科学</td><td>IS-20022</td><td>避光保存。</td></tr><tr><td>抗FAP Fab片段（3F2）</td><td>Creative Biolabs</td><td>TAB-024WM-F(E)</td><td></td></tr><tr><td>BALB/c 小鼠</td><td>查尔斯河实验室</td><td>028BALB/C</td><td>7周龄雌性小鼠</td></tr><tr><td>牛血清白蛋白</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A7906</td><td>2-8℃保存 &amp;deg;C.</td></tr><tr><td>CD45 抗体</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-110-796</td><td>FITC标记的荧光抗体；克隆号 REA 737；2℃下避光保存&amp;ndash;8 &amp;deg;C.</td></tr><tr><td>CD90.2 抗体</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-102-960</td><td>PE偶联荧光抗体；克隆号30-H12；避光保存于2℃&amp;ndash;8 &amp;deg;C.</td></tr><tr><td>70 微米细胞滤筛 &amp;micro;m</td><td>VWR</td><td>732-2758</td><td></td></tr><tr><td>CytoFLEX</td><td>贝克曼库尔特</td><td></td><td>激光配置 B4-R2-V0</td></tr><tr><td>死细胞去除试剂盒</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-090-101</td><td>包含10 mL死细胞去除微珠；25 mL 20&amp;times; 结合缓冲液储存液。避光保存于2&amp;minus;8 &amp;deg;C.</td></tr><tr><td>D-荧光素</td><td>Caliper</td><td>760504</td><td>试剂用于 &lt;em&gt;体内&lt;/em&gt; 成像</td></tr><tr><td>DMEM高糖培养基（不含L-谷氨酰胺）&amp;nbsp; 含丙酮酸钠</td><td>Euroclone</td><td>ECB7501L</td><td>37℃预热 &amp;deg;使用前在水浴中置于 C。</td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D2650</td><td></td></tr><tr><td>不含钙、不含镁的DPBS</td><td>Euroclone</td><td>ECB4004L</td><td>室温保存。</td></tr><tr><td>乙二胺四乙酸（EDTA）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E9884</td><td></td></tr><tr><td>胎牛血清</td><td>Euroclone</td><td>ECS0180L</td><td>使用前于56℃加热 &amp;deg;37°C 下孵育 30 分钟以灭活所有补体蛋白。</td></tr><tr><td>异硫氰酸荧光素异构体I（FITC）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F7250</td><td>避光保存于 2&amp;ndash;8 &amp;deg;C.</td></tr><tr><td>GentleMACS C 管</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-096-334</td><td>它们与 gentleMACS 解离仪联合使用。</td></tr><tr><td>GentleMACS 组织解离仪</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-093-235</td><td>可同时平行处理两个样本。针对不同组织已开发出特殊实验方案。&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>山羊血清</td><td>Euroclone</td><td>ECS0200D</td><td></td></tr><tr><td>Ham's F12&amp;nbsp; 不含L-谷氨酰胺</td><td>Euroclone</td><td>ECB7502L</td><td>37℃预热 &amp;deg;使用前在水浴中置于 C。</td></tr><tr><td>IVIS Lumina II 成像系统</td><td>Caliper Life Sciences</td><td></td><td>该成像系统易于操作，适用于活体荧光和生物发光成像。配备Living Image软件用于数据分析</td></tr><tr><td>LD 柱</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-901</td><td>由铁磁性微球组成，用于严格去除不需要的细胞。使用前，将所需数量的分选柱置于磁性分离装置上，并用缓冲液平衡。</td></tr><tr><td>L-谷氨酰胺</td><td>Euroclone</td><td>ECB3000D</td><td>200 mM 储存液</td></tr><tr><td>配备相机的光学/荧光显微镜</td><td>徕卡显微系统</td><td>DM IL LED 荧光/ICC50 W 相机模块</td><td>用于活细胞观察的倒置显微镜，配备相机</td></tr><tr><td>MACS MultiStand</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-303</td><td></td></tr><tr><td>MACS 分离装置</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-090-976</td><td>使用前将磁铁置于合适的支架上。</td></tr><tr><td>MACS 组织保存液</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-100-008</td><td></td></tr><tr><td>MS色谱柱</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-201</td><td>由铁磁性微球组成，用于细胞的阳性筛选。使用前，将所需数量的柱子置于磁性分离装置上，并用缓冲液平衡。</td></tr><tr><td>支原体清除剂</td><td>Euroclone</td><td>ECMC210A</td><td>在培养基中按1:100比例稀释。</td></tr><tr><td>NaHCO₃&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;</td><td>Invitrogen</td><td>A10235</td><td></td></tr><tr><td>Nanodrop 分光光度计</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>ND-2000C</td><td></td></tr><tr><td>非必需氨基酸</td><td>Euroclone</td><td>ECB3054D</td><td></td></tr><tr><td>青霉素-链霉素</td><td>Euroclone</td><td>ECB3001D</td><td></td></tr><tr><td>重组人H型同多聚体脱铁铁蛋白（HFn）&amp;nbsp;</td><td>Molirom</td><td>MLR-P018</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640 不含 L-谷氨酰胺</td><td>Euroclone</td><td>ECB9006L</td><td>37℃预热 &amp;deg;使用前在水浴中置于 C。</td></tr><tr><td>肿瘤相关成纤维细胞分离试剂盒</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-116-474</td><td>包含1 mL 小鼠非肿瘤相关成纤维细胞耗竭混合液；1 mL 小鼠CD90.2（肿瘤相关成纤维细胞）MicroBeads。避光保存于2-8℃ &amp;deg;C.</td></tr><tr><td>肿瘤解离试剂盒</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-096-730</td><td>包含冻干酶（D、R、A）和缓冲液A；按照生产商说明书重新溶解酶，分装后于-20℃保存 &amp;deg;C.</td></tr><tr><td>0.4% 台盼蓝</td><td>Lonza</td><td>17-942E</td><td>用细胞悬液样本按1:1比例稀释后计数细胞</td></tr><tr><td>TrypLE select</td><td>Gibco</td><td>12563-029</td><td>室温下使用</td></tr><tr><td>胰蛋白酶-EDTA</td><td>Lonza</td><td>BE17-161E</td><td>37℃预热 &amp;deg;使用前在水浴中置于 C</td></tr><tr><td>T75 Primo TC 培养瓶</td><td>Euroclone</td><td>ET7076</td><td></td></tr><tr><td>Zeba 脱盐离心柱</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>89890</td><td>7K 截留分子量，2 mL</td></tr><tr><td>1.5 mL 离心管</td><td>Biosigma</td><td>CL15.002.0500</td><td></td></tr><tr><td>15 mL 离心管</td><td>Euroclone</td><td>ET5015B</td><td></td></tr><tr><td>4T1-luc2</td><td>Caliper</td><td></td><td>稳定转染萤火虫荧光素酶基因的小鼠乳腺癌细胞系</td></tr><tr><td>50 mL 离心管</td><td>Euroclone</td><td>ET5050B</td><td></td></tr></tbody></table>

从小鼠同源性乳腺癌模型中分离原代癌症相关成纤维细胞用于靶向纳米颗粒研究

Isolation of Primary Cancer-Associated Fibroblasts from a Syngeneic Murine Model of Breast Cancer for the Study of Targeted Nanoparticles

癌症相关成纤维细胞（CAFs）在肿瘤微环境背景下发挥着关键作用。尽管其数量较肿瘤细胞少，但CAFs可调控肿瘤进展并为肿瘤提供抵抗抗肿瘤免疫的保护作用。新兴的抗癌策略旨在通过清除促肿瘤发生的CAFs或重编程CAFs的功能及其活化状态，来重塑肿瘤微环境。一种有前景的方法是开发能够靶向CAFs的纳米级递送载体，从而实现药物和活性分子的特异性递送。在此背景下，CAFs的细胞模型可提供一种有用的工具 体外 此类纳米制剂的筛选与初步研究
本研究描述了从三阴性乳腺癌同基因型小鼠4T1模型中分离和培养原代癌相关成纤维细胞（CAFs）的方法。采用磁珠两步分离法从解离的肿瘤组织中提取CAFs。每次传代后均通过流式细胞术进行免疫表型分析以验证分离效率。所获得的原代CAFs可用于研究不同纳米制剂靶向肿瘤微环境的能力。本实验选用荧光标记的H-铁蛋白纳米笼作为候选纳米颗粒以建立该方法。对裸露或偶联靶向配体的纳米颗粒分别分析其与CAFs的结合能力。结果表明 离体 乳腺CAFs的提取可能是用于测试和验证靶向肿瘤相关成纤维细胞（CAFs）的纳米颗粒的有效系统。

体内 最佳 CAFs 分离的模型建立  
10的注射5 将4T1-luc细胞植入雌性BALB/c小鼠乳腺脂肪垫后，5天即可形成可检测的肿瘤组织。通过卡尺测量肿瘤体积及生物发光成像（BLI）评估肿瘤细胞活力，对植入后一个月内的肿瘤生长情况进行监测。为确定适合分离CAFs的处死时间窗口，需在肿瘤体积和BLI信号强度较大与肿瘤开始出现溃疡化和坏死之间寻求最佳平衡点。图1）。在植入后20天出现坏死核心，并在25天和30天时逐渐扩大（如BLI图像所示）。 图1C），设定第20天为优化细胞回收的时间点，以评估分离过程后的细胞恢复情况。即使在肿瘤处理的初始步骤中已仔细去除所有可见的坏死区域 离体在解离为单细胞的末期，发现大量细胞死亡表1）。由于该比例可能具有重要意义，尤其是随着肿瘤体积的增大，使用4T1模型时始终需要清除死细胞。
CAFs 分离、培养与表征流程的优化 
为了从收集到的活细胞群体中分离出 CAFs（CD90.2+ CD45-），还需进行两次分选步骤：去除非肿瘤相关成纤维细胞以及富集肿瘤相关成纤维细胞（图2）。去除非靶细胞的磁珠混合物可有效清除 CD45+ 细胞（去除非靶细胞前、后分别占总细胞数的 67.35% 和 0.69%，表2），且每次操作每个分选柱均仅处理单个肿瘤样本。如 表1 所示，经过去除非靶细胞步骤后，洗脱细胞数量从平均 3 × 106 下降至 1 × 105。由于总细胞数大幅减少，在进行富集步骤前，建议将至少 2 个、最多 4 个肿瘤样本所收集的细胞合并至同一管中。通过此方法，可获得足够数量的细胞用于与肿瘤相关成纤维细胞磁珠孵育，并经由单个分离柱纯化，最终获得平均 93% 的 CD90.2+ CD45- 细胞（表2）。
一旦接种到组织培养板上，这些回收的细胞便贴附于塑料表面，并呈现出成纤维细胞典型的较大纺锤形形态（图3A，B）且不同于4T1肿瘤细胞（图3D）。在去除微珠后不合并肿瘤样本，会导致与肿瘤相关成纤维细胞微珠结合的细胞得率过低，无法建立培养。在其他情况下，若与微珠孵育的时长和温度未得到严格控制，则可能发生非特异性结合。此类情况下，富集步骤效率降低，CD90.2阳性细胞的比例也更高- CD45+ 和 CD90.2- CD45- 细胞与CD90.2一并被回收+ CAFs（分别为 5.97 ± 1.5 和 16.75 ± 1.1）（图 4 和 表3）。这些污染细胞很可能导致了培养物中出现形态不同的小型克隆。图 4B，黑色箭头所示）生长速度超过CAFs，并在原代CAFs培养物中占据主导地位（图 4C这些不理想的结果证实了在富集过程结束以及细胞在培养中生长期间，始终需要对CD90.2和CD45的表达以及细胞形态进行双重确认的重要性。
利用分离细胞评估工程化纳米药物靶向癌相关成纤维细胞的潜力 
新分离的癌相关成纤维细胞（CAF）可用于多种应用，范围涵盖基础研究到药理学研究。本研究团队的目标是开发能够特异性靶向 CAF 的 HFn 纳米笼。HFn 在两种不同的蛋白：抗体比例（较低的 1:1 和较高的 1:5）下，被修饰上特异性的抗 FAP 抗体片段（HFn-FAP），并检测其与 CAF 的结合能力。由于 FAP 被用作促肿瘤性 CAF 的表面生物标志物，因此检测分离所得 CAF 上 FAP 的表达至关重要（图 3C）。通过连续培养 5 代，追踪 FAP 的表达情况，以确认原代 CAF 培养物维持了其原有的特性。
FAP 功能化修饰的 HFn 与未修饰的 HFn 相比，显著增强了向 CAF 靶向的偏移，且仅需较低的抗体比例（1:1）即可观察到此效应图 5A）。然而，在用于建立模型的4T1肿瘤细胞中未观察到这一现象 体内 肿瘤模型，其中裸露的HFn比功能化的HFn表现出更高的结合能力（图5B这最有可能是由于4T1细胞中不存在FAP过表达，以及HFn与TfR1的优先相互作用所致，后者可调控细胞对HFn的摄取，这一点已被该研究团队广泛报道。27,33这些结果证实了利用乳腺癌相关成纤维细胞（CAF）的原代培养物，可作为初步筛选靶向肿瘤微环境纳米颗粒能力的有效方法。
<img alt="肿瘤生长分析；体积、BLI 图表；小鼠发光成像持续 30 天。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62504/62504fig01.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图 1"> 
图 1： 4T1 肿瘤模型的建立。 将细胞（105 个细胞/只小鼠）注射至乳腺脂肪垫中。通过卡尺测量（A）和生物发光成像（B）分别在接种后第 5、10、15、20、25 和 30 天监测肿瘤生长情况。肿瘤体积和 BLI 分别以 mm3 和计数表示。结果以平均值 ± 标准误（n=6）表示。（C）细胞接种后第 5、10、15、20、25 和 30 天获得的代表性 BLI 图像证实肿瘤持续生长至第 25 天，此后趋于平台期。在最后的分析时间点（第 30 天），BLI 信号相较于第 25 天未见增加。从第 20 天开始，肿瘤中央区域开始出现坏死和溃疡现象。颜色标尺：最小值 = 1,194，最大值 = 20,462。缩写：BLI = 生物发光成像；SEM = 标准误。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62504/62504fig01large.jpg" target="_blank">请点击此处查看本图的高清版本。</a>
<img alt="细胞分选实验；包括细胞样本制备、离心管和流式细胞术结果。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62504/62504fig02.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图 2"> 
图 2： 肿瘤样本制备及分离的癌相关成纤维细胞（CAFs）的流式细胞术表征。 肿瘤被切除后，用手术刀将其切割成（A）约 1–2 mm 的小块；（B）切除肿瘤经组织消化和机械解离后获得的单细胞悬液；（C）红细胞裂解后获得的细胞沉淀；（D）去除红细胞和死细胞后所得细胞中 CD45 和 CD90.2 表达的流式细胞术分析；（E）非癌相关成纤维细胞耗尽后；以及（F）癌相关成纤维细胞富集后，其中大多数细胞为 CD90.2+ CD45-（蓝色矩形区域）。缩写：CAFs = 癌相关成纤维细胞；CD = 分化簇；PE-A = 藻红蛋白信号区域；FITC-A = 异硫氰酸荧光素信号区域。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62504/62504fig02large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="细胞显微镜和流式细胞术分析；显微镜图像和荧光强度直方图。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62504/62504fig03.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图 3"> 
图 3：癌相关成纤维细胞（CAFs）的形态学分析及FAP表达。 （A, B）通过光学显微镜在所有培养代次中观察CAFs的形态（第2代和第5代的不同汇合度），并与（D）4T1肿瘤细胞进行比较；比例尺 = 10 µm。（C）在分离过程结束时，对收集的CD90.2+ CD45-细胞进行流式细胞术检测成纤维细胞活化蛋白（FAP）的表达，以确认其分子特征。以未染色对照细胞（红色图谱）设定荧光阈值，用于量化抗体染色细胞（蓝色图谱）的平均荧光强度及FAP+细胞所占百分比。缩写：CAFs = 癌相关成纤维细胞；FAP = 成纤维细胞活化蛋白；CD = 分化簇；MFI = 平均荧光强度；Ab = 抗体；FITC-A = 异硫氰酸荧光素面积；FAP+ = FAP阳性细胞。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62504/62504fig03large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="流式细胞术图解、显微镜图像；细胞分析、CD90/CD45标记物、FITC-A 对 PE-A 散点图。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62504/62504fig04.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Figure 4"> 
图4： 成纤维细胞活化蛋白（CAF）分离过程不理想示例。 （A）最终分离步骤后的流式细胞术分析显示存在污染性 CD90.2- CD45+ 和 CD90.2- CD45- 细胞。（B）接种后可见这些细胞呈克隆样生长，形态较小且呈圆形（黑色箭头及图中左下角插图所示），（C）在体外培养至第三代时逐渐占据主导地位。比例尺 = 10 µm。缩略语：CAF = 癌相关成纤维细胞；CD = 分化簇；PE-A = 藻红蛋白面积；FITC-A = 异硫氰酸荧光素面积。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62504/62504fig04large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的高清版本。</a>
<img alt="CAF 和 4T1 细胞中 HFn-FAP 与 HFn 结合的柱状图，显示倍数差异结果。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62504/62504fig05.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图 5"> 
图 5： HFn 纳米笼在 CAF 和 4T1 细胞上的结合情况。 HFn 纳米笼用 FITC 荧光标记，并以两种不同蛋白-抗体比例（1:1 和 1:5）与抗 FAP 抗体片段（HFn-FAP）进行功能化修饰，随后在 4 °C 下与（A）靶向 CAF 和（B）4T1 细胞孵育 2 小时。通过流式细胞术评估结合效果。（A）在两种抗体片段浓度下，HFn-FAP 与 CAF 的结合相比裸 HFn 显著增加三倍。（B）相比之下，在 4T1 细胞中观察到裸 HFn 的结合显著更高，且 FAP 识别并未增强其结合。结果表示为三次独立实验的平均值 ± 标准差。*** p = 0.0003；°° p = 0.0021；°°° p = 0.0008。缩写：CAFs = 肿瘤相关成纤维细胞；FAP = 成纤维细胞激活蛋白；HFn = 人铁蛋白重链的重组变体，用作裸纳米颗粒或偶联形式；HFn-FAP = HFn 纳米颗粒与抗 FAP 抗体的可变区片段偶联，制备时采用两种 HFn:Fab@FAP 摩尔比（1:1 和 1:5）。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62504/62504fig05large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td></td>
			<td>细胞数量（平均值 ± 标准差）</td>
			<td>提取总得率（每代次）</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>切除的肿瘤组织（去除红细胞后）</td>
			<td>1.27 x 108 ± 9.81 x 107</td>
			<td>100%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>切除的肿瘤组织（去除死细胞后）</td>
			<td>3.01 x 106 ± 9.61 x 105</td>
			<td>2.38%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>去除非目标细胞混合孵育后</td>
			<td>1.15 x 105 ± 4.95 x 104</td>
			<td>0.11% (3.82%)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>富集后</td>
			<td>3.00 x 104 ± 1.2 x 104</td>
			<td>0.027% (26.09%)</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表1：癌相关成纤维细胞分离各步骤后的总细胞计数。
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>细胞分布 (%)</td>
			<td>CD90.2+ CD45-</td>
			<td>CD90.2+ CD45+</td>
			<td>CD90.2- CD45+</td>
			<td>CD90.2- CD45-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>切除肿瘤组织（去除死细胞后）</td>
			<td>1.81 ± 0.98</td>
			<td>10.78 ± 4.51</td>
			<td>56.57 ± 14.05</td>
			<td>28.20 ± 17.57</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>去除非目标细胞后</td>
			<td>69.33 ± 16.75</td>
			<td>0.14 ± 0.13</td>
			<td>0.55 ± 0.63</td>
			<td>39.89 ± 30.31</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>富集后</td>
			<td>93.14 ± 3.3</td>
			<td>0.09  ± 0.1</td>
			<td> 0.09 ± 0.08</td>
			<td>6.69 ± 3.4</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表2：根据CD90.2和CD45表达情况分析癌相关成纤维细胞分离各代次后的细胞分布。
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>细胞分布 (%)</td>
			<td>CD90.2+ CD45-</td>
			<td>CD90.2+ CD45+</td>
			<td>CD90.2- CD45+</td>
			<td>CD90.2- CD45-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>富集后（未混合样本）</td>
			<td>75.80 ± 2.9</td>
			<td>1.49 ± 0.4 </td>
			<td>5.97 ± 1.5</td>
			<td>16.75 ± 1.1</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表3：亚优条件下癌相关成纤维细胞分离实验后收集的细胞的CD90.2和CD45表达情况。

本文旨在提供一种从三阴性乳腺癌同源小鼠模型中分离和培养原代癌症相关成纤维细胞的实验方案，并介绍其在针对肿瘤微环境的新型纳米颗粒临床前研究中的应用。&#160;

肿瘤相关成纤维细胞（CAFs）在肿瘤微环境背景下发挥着关键作用。尽管其数量较肿瘤细胞有所减少……

本方案可成功分离和培养小鼠乳腺癌来源的原代肿瘤相关成纤维细胞，用于筛选靶向肿瘤微环境的新型纳米颗粒。原代CAF是体外研究肿瘤间质最可靠且具有生理相关性的模型。在本方案中，我们描述了如何获得最佳得率的方法。首先，制备用于肿瘤解离的消化液，并在紧密封闭管盖后，将3至5毫米的肿瘤组织碎片浸入该溶液中。将管子倒置，检查所有肿瘤组织块是否均位于管底靠近管盖的一端。然后将管子正确安装到机械解离仪的适配孔中，运行专为坚韧肿瘤设计的解离程序。运行结束后，取下管子，倒置并置于37摄氏度下轻柔振荡孵育40分钟。然后将管子重新正确安装至组织解离仪的腔体中，对难解离的肿瘤组织运行两次解离程序，确保操作结束时无大块组织残留。将样品通过40微米细胞滤网过滤至50毫升离心管中。然后用10毫升RPMI 1640培养基洗涤滤膜，并进行离心。离心后，将沉淀重悬于PBE缓冲液中（由PBS、0.5% BSA和2毫摩尔EDTA组成），并用台盼蓝计数细胞。通过将20倍浓度的结合缓冲液储存液用无菌双蒸水稀释，配制死细胞去除结合缓冲液。用5毫升1×结合缓冲液洗涤细胞，离心。离心后，用最多适用于10的7次方个细胞的0.1毫升死细胞去除微珠重悬细胞沉淀，在室温下孵育15分钟。孵育期间，在生物安全柜内准备好磁力架，并将铁磁性分离柱悬挂于其上，柱尖朝下。用 0.5 毫升冷结合缓冲液平衡层析柱，并等待溶液流尽。孵育后，向珠子和细胞悬液中加入 400 微升冷结合缓冲液。将全部体积上样至层析柱中，并用 15 毫升离心管收集流出液。用 0.5 毫升冷结合缓冲液洗涤层析柱四次，并将全部流出液收集至同一管中。为去除非癌症相关成纤维细胞，使用经 PBS 润湿的 70 微米细胞筛网过滤细胞悬液，然后离心细胞。弃去上清液，将沉淀重悬于 80 微升冷 PBE 缓冲液中。加入20 µL非肿瘤相关成纤维细胞耗竭混合液。充分混匀后，将样品置于4 °C避光孵育15分钟。在与磁珠孵育期间，于磁力架上准备好铁磁性耗竭柱。用两毫升预冷的PBE缓冲液平衡层析柱，等待溶液流尽。孵育后，向磁珠和细胞悬液中加入400微升缓冲液。将全部体积上样至层析柱中，并用15毫升离心管收集流出液。用两毫升 PBE 缓冲液洗涤柱子两次。将全部流出液收集到同一管中，并对流出液进行离心。为正向筛选癌症相关成纤维细胞，将沉淀重悬于 80 微升预冷的 PBE 缓冲液中。然后加入20微升肿瘤相关成纤维细胞微珠，在4摄氏度避光条件下孵育15分钟。孵育期间，在磁力架上准备好铁磁分离柱，并用0.5毫升预冷的PBE缓冲液进行平衡。孵育结束后，向微珠和细胞悬液中加入400微升PBE缓冲液。将全部体积上样至柱中，让未标记的细胞流穿进入一个15毫升离心管中。用0.5毫升PBE缓冲液洗涤柱子三次，并将全部流出液收集至同一管中。将柱子从磁铁上取下，放入一个1.5毫升离心管中。向柱中加入一毫升 PBE，立即推动柱子的活塞以洗脱细胞。离心后，用适当体积的 DMEM 重悬细胞沉淀，并将细胞接种至组织培养板中。在显微镜下检查细胞密度，将培养板置于 37 摄氏度、5% 二氧化碳环境中，使细胞贴壁并生长。将4T1荧光素酶细胞注射到雌性小鼠的乳腺脂肪垫后，移植5天后即可检测到肿瘤组织的生长。为了确定适合癌相关成纤维细胞（CAF）分离的处死时间窗口，需在较大的肿瘤体积和生物发光成像信号较强与肿瘤开始出现溃疡和坏死之间寻求最佳平衡。最终将第20天设定为优化细胞回收率的时间点，即在完成分离过程后进行。 为了从收集到的活细胞群体中分离出CAF群体、耗尽非肿瘤相关成纤维细胞并富集肿瘤相关成纤维细胞，还需进行两次传代。CAF细胞呈现典型的成纤维细胞特征，即较大的纺锤形形态，并且与4T1肿瘤细胞不同。连续观察五次传代后的FAP表达情况，证实原代CAF培养物保持了其原有的特性。当与微珠孵育的孵育时间及温度未得到严格控制时，在分离培养物中可观察到形态各异的克隆。这些污染细胞生长速度更快，逐渐占据主导地位，抑制了原代CAF培养物的生长。与裸露的HFN相比，在抗体片段浓度为一比一和一比五的条件下，CAF与人铁蛋白Hfn-FAP功能化的纳米药物结合量增加了三倍。相反，对于肿瘤4T1细胞，未修饰的HFN表现出比功能化HFN更高的结合能力。为提高分离CAF的产率并减少杂质，需保持缓冲液处于低温，严格遵守与磁珠孵育的时间，并在最终富集步骤前每根色谱柱最多处理四个肿瘤样本。分离得到的CAF可用于在开展临床前体内实验之前，针对多种候选纳米药物的结合能力、摄取效率及药理学功效进行筛选。CAF 的分离使我们能够验证纳米颗粒是否可用于靶向肿瘤微环境，从而为与化疗协同作用的新型靶向治疗策略奠定基础。

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Research

科研

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Cancer Research

癌症研究

将原发性癌症相关纤维细胞与乳腺癌的合成素 Murine 模型分离，用于靶向纳米粒子的研究

富含肌成纤维细胞的癌相关成纤维细胞（CAFs）存在于肿瘤间质中，在驱动肿瘤进展中发挥重要作用。我们建立了一种共移植肿瘤异种移植模型，用于从人乳腺成纤维细胞实验性地生成CAFs。本方案描述了如何建立获得促肿瘤发生能力的CAF肌成纤维细胞。...

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癌症相关成纤维细胞（CAFs）通过促进细胞增殖、血管生成和炎症的信号通路，促进肿瘤的发生、生长和进展。本文介绍一种利用细胞分选技术，以PDGFRα作为表面标志物，从新鲜的小鼠和人类组织中分离出纯化的正常成纤维细胞和CAFs群体的方法。...

通过荧光激活细胞分选（FACS）从新鲜组织中分离正常成纤维细胞和癌相关成纤维细胞

本实验方案的目的是研究乳腺肿瘤的发生。通过该技术，可切除小鼠乳腺肿瘤并从肿瘤组织中分离制备原代细胞。本方案还包括肺组织提取步骤，用于研究肺转移。此外，还提供了从小鼠胚胎中分离分析小鼠胚胎成纤维细胞的另一套实验方案。...

原发性肿瘤和MEF细胞分离用于肺转移研究

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具有抗肿瘤特性的中性粒细胞的分离与表征

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通过FACS分离小鼠皮肤成纤维细胞

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一种用于研究肿瘤相关成纤维细胞在肿瘤生长中作用的小鼠模型

采用肺腺癌细胞、成纤维细胞和单核细胞制备多细胞三维肿瘤球体，随后从这些球体中分离出肿瘤相关成纤维细胞（CAFs）。将分离得到的CAFs与正常成纤维细胞进行比较，通过检测线粒体膜电位、活性氧水平及酶活性来评估线粒体功能状态。...

评估从三维多细胞肺癌球体中分离出的肿瘤相关成纤维细胞的线粒体健康状况

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小鼠乳腺肿瘤来源的癌症相关成纤维细胞作为分子与计算研究的工具

本方案提供了从根治性前列腺切除术标本中分离、扩增和永生化成纤维细胞的完整操作流程。此外，还介绍了利用条件培养基处理和共培养技术评估成纤维细胞与肿瘤细胞之间相互作用功能效应的实验方法。...

前列腺癌相关成纤维细胞的分离、培养与表征

学习从三阴性乳腺癌小鼠模型中分离和培养原代癌症相关成纤维细胞的方法，用于靶向肿瘤微环境的新型纳米粒子临床前研究。该方案可实现高效分离并保持细胞特性。

从小鼠同源性乳腺癌模型中分离原代癌症相关成纤维细胞用于靶向纳米颗粒研究

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