使用巴库洛病毒表达载体系统生产重组PRMT蛋白
July 17th, 2021
巴库洛病毒表达载体系统 （BEVS） 是用于生化、生物物理和结构研究的蛋白质精氨酸甲基转移酶 （PRMT） 表达筛查和生产的强大平台。可用于大多数PRMT和其他需要真核表达平台的兴趣蛋白质，可生产毫克量的材料。
本协议的总体目标是在大规模生产中对蛋白质精氨酸甲基转移酶的多构造进行表达筛选，以获得生物化学、生物物理和结构研究的蛋白质毫克量，在表达平台S、baculovirus表达载体系统的覆盖范围内，采用中支持、经济高效的模式进行结构研究。阿尔玛·塞托娃博士将介绍以下步骤。将成倍增长的SF9细胞稀释到无血清昆虫介质中每毫升40万的最终细胞密度，并倒入无菌试剂储液库。
使用可编程多通道移液器将稀释的 SF9 细胞的 0.5 密耳播种到 24 井板的每口井中。这个体积足以确保井面的均匀覆盖。同时，它不会过多地稀释转染混合，从而提高转染效率。
仅将一口板井标记为细胞，并将其用作对转染和未转染细胞进行比较的控制，以评估潜在的感染迹象。在27度处孵化板，直到需要，大约一个小时，让细胞附着在细胞培养板上。在未加成的昆虫介质和无菌试剂储液中稀释混合良好的转染试剂，轻轻混合 10 秒。
使用 12 通道移液器，将稀释交易试剂的 102 微升转移到无菌 96 MicroWell 板中。将每微升重组的巴密德DNA中的10微升0.2微升转移到96井微井板的相应井中，通过轻轻摇动混合，从两侧敲击板。为复杂地层孵化 15 到 20 分钟的转染混合物。
使用可调节的六通道移液器，用于在 96 和 24 井板之间传输，将转染混合物叠加到转染板相应井中的细胞上，并在 27 度处孵育四小时。为了确保细胞单层上均匀分布的转染混合物，在孵化期间轻轻摇动板来回几次。转染后四到五个小时，加入1.5密斯的无血清昆虫介质。
补充10%的热灭活胎儿牛血清和1%抗生素和抗菌剂。在 27 度孵化器中孵化细胞 72 至 96 小时。尽可能每天轻轻摇动一次变形板。
在转产后 72 至 96 小时内，寻找在转染细胞中明显出现的感染迹象。与倒置显微镜下的控制细胞相比，在转染细胞中应有明显的感染迹象，分泌到细胞培养介质中的初始重组杆菌病毒应准备好收集。使用可编程的电子多通道，允许同时收集P1病毒，在24个井块中感染新播种的SF9细胞，其中150微升的P1病毒。
将其余的 P1 病毒库存旋转 15 分钟，用 AirPore 表覆盖 24 个带受感染 SF9 细胞的悬浮培养的井块。在 27 度处孵化 24 口井块，在 245 个 RRPM 处摇晃 72 至 96 小时。在预定生产时间前四天，将生长成指数级的SF9细胞，最终细胞密度为每毫升200万，放入Erlenmeyer玻璃摇动牙线，在血清自由昆虫介质中含有1%最终抗生素和抗菌剂的挡板。
这一步骤将产生受感染的昆虫细胞和P2病毒在超自然体中的悬浮培养，用于生产批次中新细胞的感染。加入相应的P2病毒，在25度的较低温度下孵育受感染细胞，以减缓细胞生长，在轨道摇床上以1英寸的笔触在165个RPM上摇晃。在预定生产时间前四天，种子两升成倍生长的SF9细胞在昆虫血清自由介质中以每毫升100万的细胞密度，在2.8升Fernbach摇瓶中生长。
在 27 度处摇动烧瓶， 在 150 个 Rdm 上摇动。研究科学家阿什利 · 哈钦森将演示以下协议。将四升成倍增长的SF9细胞和无昆虫血清介质分割成每毫升400万的最终细胞密度，放入五升试剂瓶中。
加入10至12密耳的巴库洛病毒感染昆虫细胞的悬浮培养。在25摄氏度的较低温度下，在摇床中孵育SF9细胞的受感染培养，在72至96小时内摇出145 RPM。在SF9细胞的巴库洛病毒中，来自PRMT家族的几种重组蛋白的毫克数量用于生化生物物理教学研究，如图5所示。
在SGC，晶体结构被用各种化学探针和抑制剂沉积到蛋白质数据库中，以全长度或截断的蛋白质PRMT4、6、7和9的形式解决。这些PRMT的表达质粒被存放起来，由SGC添加基因收集，并提供给研究界。在这段视频中，我们强调了成功考察筛选出在巴库洛病毒表达系统大规模生产中的蛋白质精氨酸甲基转移酶的多重构造的关键要素。
使用定期可调和可编程的多通道移液器，使其整个过程比高效更快。使用高性能和低细胞毒性为细胞，转染试剂为再生病毒的生成导致更经济高效，这种细胞处理转染协议。在六个细胞中感染具有悬浮培养物的大规模蛋白质生产批次，大大减少了在重要启动器放大中耗时的劳动。
例如，离心与受感染细胞的特殊培养。这当然排除了对受感染细胞的额外处理，以避免它们在病毒退化时更加紧密。悬浮养殖细胞维护在这种规模化生产中对养殖船的现场量是很大的，有助于我们克服生产量的限制，采用大型平台。
这对实验室非常有用，因为实验室无法访问生物反应器，也无法在生产管道中限制空间。虽然我们的协议已经描述了蛋白质精氨酸甲基转移酶家族的蛋白质，但同样的方法可以应用于任何其他蛋白质家族，这些蛋白质家族需要表达平台来获得足够数量的蛋白质用于生化生物物理教学研究。
概述
杆状病毒表达载体系统（BEVS）是一种有效的平台，用于蛋白质精氨酸甲基转移酶（PRMTs）的表达筛选和生产。该方法可以生成毫克量的PRMTs，用于各种生化、生物物理和结构研究。
关键研究组成部分
科学领域
- 神经科学
- 生物化学
- 结构生物学
背景
- PRMTs在细胞过程中扮演着关键角色。
- BEVS是一种广泛使用的真核表达系统。
- 蛋白质的高效生产对于研究至关重要。
- 详细研究通常需要毫克量的蛋白质。
研究目的
- 筛选多个PRMTs构建体以进行大规模生产。
- 获得足够量的蛋白质用于各种分析。
- 使用BEVS优化表达过程。
使用的方法
- 用重组杆状病毒DNA转染SF9细胞。
- 在受控条件下孵育细胞。
- 从细胞培养基中收集重组杆状病毒。
- 使用可编程多通道移液器提高效率。
主要结果
- 成功表达多个PRMT构建体。
- 生产毫克量的蛋白质用于分析。
- 展示了优化的转染和感染协议。
- 关于BEVS平台效率的关键见解。
结论
- BEVS是一个用于蛋白质生产的稳健系统。
- 高效的协议可以显著减少劳动和时间。
- 该研究为未来关于PRMTs的研究提供了框架。
常见问题
Executive Industry Relevance
Efficient production of milligram quantities of recombinant PRMT proteins is critical for biochemical, biophysical, and structural studies that underpin early drug discovery and target validation. The baculovirus expression vector system (BEVS) enables scalable, high-quality protein generation, supporting mechanistic de-risking and predictive confidence in preclinical research. This workflow addresses bottlenecks in protein supply for portfolio-wide target interrogation and assay development.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables production of diverse PRMT constructs for functional and mechanistic studies.
- Supports biological de-risking by providing sufficient protein for pathway interrogation.
- Facilitates predictive confidence in target selection through robust protein supply.
Screening & Assay Development
- Delivers validated recombinant proteins for downstream biochemical and biophysical assays.
- Standardizes protein expression workflows for reproducibility and scalability.
- Prepares assay-ready protein batches for high-throughput screening platforms.
Translational & Preclinical Research
- Enables structural studies that inform inhibitor design and translational biomarker alignment.
- Provides continuity from discovery to preclinical validation by supporting structure-function analyses.
- Reduces risk in advancing targets by ensuring protein quality and quantity for translational studies.
Pipeline & Workflow Integration
This BEVS-based protein production method integrates from early discovery through lead identification and preclinical research, supporting iterative hypothesis testing and assay development.
- Discovery Biology: Supplies high-quality PRMTs for mechanistic and pathway studies.
- Screening: Enables reproducible, quantitative protein batches for assay development.
- Analytics: Provides consistent protein inputs for comparative biochemical and structural analyses.
- Translational Research: Supports structure-guided inhibitor development and biomarker studies.
- Enterprise Reuse: Offers a scalable, adaptable platform for diverse protein targets beyond PRMTs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in target validation.
- Operational Value: Streamlines protein production with standardized, scalable workflows.
- Strategic Value: Accelerates go/no-go decisions and improves capital efficiency by reducing protein supply bottlenecks.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization and advancement of multiple targets in parallel.
Implementation Considerations
- Requires expertise in insect cell culture and baculovirus handling.
- Needs programmable multichannel pipettes and controlled incubator infrastructure.
- Demands cross-team standardization for reproducibility across protein constructs.
- Adaptable to various protein families with similar expression requirements.
- Space-efficient for labs without access to large-scale bioreactors.
