Name: 使用巴库洛病毒表达载体系统生产重组PRMT蛋白 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-07-17T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 57 s
Description: 学习使用杆状病毒表达载体系统在SF9昆虫细胞中高效生产重组蛋白精氨酸甲基转移酶。该方法可快速获得毫克级PRMT蛋白，适用于生化、生物物理及结构生物学研究。

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作者感谢Dalia Barsyte-Lovejoy在百忙之中为本文手稿提供了宝贵的反馈意见和建设性评论，同时感谢我们所有在杆状病毒表达系统中表达PRMT蛋白家族方面与我们合作的SGC同事。
SGC 是一家注册慈善机构（编号 1097737），其资金来自 AbbVie、Bayer AG、Boehringer Ingelheim、Genentech、通过安大略基因组研究所 [OGI-196] 获得的加拿大基因组中心资助、欧盟和欧洲制药工业协会联合会通过创新药物计划 2 联营项目 [EUbOPEN 拨款 875510]、Janssen、Merck KGaA（在加拿大和美国称为 EMD）、Pfizer、Takeda 以及惠康信托基金会 [106169/ZZ14/Z]。

注意：BEVS 方案步骤的概述见图1。
1. 重组杆状病毒DNA的制备
<ol>
	<li>DH10Bac 转化用 LB 琼脂选择性平板的制备
	<ol>
		<li>制备含有以下成分的 LB 琼脂平板：50 µg/mL 卡那霉素、7 µg/mL 庆大霉素、10 µg/mL 四环素、200 µg/mL Bluo-gal 和 40 µg/mL IPTG，用于筛选 DH10Bac 转化子。</li>
		<li>称取 25 g 预混 LB 肉汤和 13 g Bacto 琼脂，放入 2 L 锥形瓶中，加入蒸馏水定容至 1 L，在 121 °C 下高压灭菌 15–30 分钟。</li>
		<li>将水浴锅设定为 50 °C，将灭菌后的琼脂溶液置于水浴中冷却 40–60 分钟，直至温度降至 50–55 °C。</li>
		<li>向冷却后的琼脂溶液中加入庆大霉素至终浓度为 7 µg/mL，卡那霉素至终浓度为 50 µg/mL，四环素至终浓度为 10 µg/mL，Bluo-gal 至终浓度为 200 µg/mL，IPTG 至终浓度为 40 µg/mL。</li>
		<li>混匀琼脂溶液，使用 50 mL 移液器将 7–10 mL 培养基分装至每个 60 mm 培养皿中。室温静置 2 小时使其凝固。倒置平板，包裹后于 4 °C 保存。含抗生素的平板可稳定保存长达 4 周。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将质粒转化至 DH10Bac E. coli 感受态细胞
	<ol>
		<li>计算所需感受态细胞的体积。</li>
		<li>将感受态细胞置于冰上解冻，轻轻离心&#160;后通过轻弹管壁重新悬浮。</li>
		<li>使用 12 通道移液器将 4 µL 细胞加入 96 孔 PCR 板的每一孔中。</li>
		<li>向感受态细胞中加入约 0.3–0.5 µg 重组质粒 DNA，轻弹混匀。冰上孵育 10–15 分钟。</li>
		<li>在 PCR 仪中 42 °C 热激 45 秒，随后冰上冷却 2 分钟。</li>
		<li>向 96 孔深孔板（96 孔深孔，2.4 mL）的每孔中加入 0.5 mL SOC 培养基。</li>
		<li>使用 12 通道移液器将转化后的菌液转移至深孔板对应孔中，并用透气膜覆盖。</li>
		<li>将深孔板置于摇床培养箱中，37 °C、中等振荡（205 rpm）培养 4–5 小时。</li>
		<li>使用无菌玻璃珠将 30–50 µL 培养物均匀涂布于 LB 琼脂平板表面。剩余培养物于 4 °C 保存。</li>
		<li>将平板在 37 °C 培养至蓝白斑颜色可辨（40–48 小时）。当平板上出现足够数量的大白色菌落时，弃去原培养物。</li>
		<li>为确认白色菌落仅含有重组杆状病毒基因组 DNA，挑取单个孤立的白色菌落，在含有抗生素、Bluo-gal 和 IPTG 的新鲜 LB 琼脂平板上重新划线，以验证表型。</li>
		<li>37 °C 培养 48 小时。</li>
		<li>从重新划线的平板上挑取一个经验证的白色菌落，用于提取重组杆状病毒基因组 DNA。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>分离重组杆状病毒基因组 DNA
	<ol>
		<li>将单个孤立的白色菌落接种至 24 孔板（24 孔圆底板）中含 3 mL LB 培养基的孔内，培养基中添加 50 µg/mL 卡那霉素、7 µg/mL 庆大霉素和 10 µg/mL 四环素，并用透气膜覆盖。</li>
		<li>37 °C 振荡培养过夜（250 rpm）。</li>
		<li>将 24 孔板在 2,100 x g 下离心 10 分钟。弃去上清液，将孔板倒置，轻拍于吸水纸上。向每孔中加入 250 µL 溶液 1（细胞重悬液）。</li>
		<li>用封口膜或其它密封膜密封孔板，置于摇床上&#160;，75 rpm 振荡 5–10 分钟。检查每孔以确保细胞充分裂解，必要时使用 1 mL 吸头重新混悬。</li>
		<li>向每孔中加入 250 µL 溶液 2（细胞裂解液），密封孔板，75 rpm 振荡 30 秒（为避免样品交叉污染，切勿倒置 24 孔板），室温孵育 4 分钟。</li>
		<li>向每孔中加入 250 µL 溶液 3（中和液），密封孔板，75 rpm 振荡 30 秒。此时会形成大量白色絮状沉淀（蛋白质和 E. coli 基因组 DNA）。将样品置于冰上 10–15 分钟。</li>
		<li>在 4 °C 下以 2,100 x g 离心 60 分钟，使白色沉淀充分紧实。离心期间，标记新的微量离心管并加入 0.8 mL 无水异丙醇。</li>
		<li>小心将上清液转移至含异丙醇的离心管中，避免带入白色沉淀。轻轻颠倒混匀数次，然后置于冰上 5–10 分钟。此阶段样品可在 -20 °C 保存过夜。</li>
		<li>在 4 °C 下以 14,000 x g 离心 15 分钟。弃去上清液，向每管中加入 0.5 mL 70% 乙醇。颠倒数次以洗涤沉淀。室温下以 14,000 x g 离心 5 分钟。（可选：重复洗涤一次）</li>
		<li>将样品移入超净工作台以确保质粒制备的无菌性，并尽可能彻底去除上清液。 
		注意：沉淀可能从管底脱落，弃上清时需小心观察沉淀位置。</li>
		<li>在超净工作台中将沉淀风干 15–20 分钟，用 50 µL 过滤后的洗脱缓冲液（10 mM Tris-Cl，pH 8.5）溶解 DNA（注意避免沉淀过度干燥）。</li>
		<li>由于重组杆状病毒基因组 DNA 大小超过 135 kb，为避免 DNA 剪切，应通过轻弹管壁的方式溶解沉淀。</li>
		<li>为验证目的基因是否存在于杆状病毒基因组 DNA 中，在 96 孔 PCR 板中配制 PCR 反应体系。</li>
		<li>PCR 体系配制如下：1 µL 缓冲液，0.2 µL（各 10 mM）dNTPs，0.1 µL Taq DNA 聚合酶，0.1 µL（25 µM）正向与反向引物（BACV2FWD: tattccggattattcataccg；BACV2REV: ctctacaaatgtggtatggc），1 µL 杆状病毒基因组 DNA，8 µL 水。</li>
		<li>进行目标基因扩增：95 °C 预变性 2 分钟，随后进行 25 个循环（94 °C 变性 30 秒，55 °C 退火 30 秒，72 °C 延伸 1 分钟/kb）。</li>
		<li>72 °C 最终延伸 7 分钟后终止反应。</li>
		<li>取 10 µL 扩增产物，通过电泳在含核酸染色液的 1%（w/v）琼脂糖凝胶上进行分析。</li>
		<li>将经验证的杆状病毒基因组 DNA 于 4 °C 保存。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 重组杆状病毒毒株的制备
注意：在杆状病毒表达实验流程的任何步骤中，包括用于产生杆状病毒的细胞转染、杆状病毒扩增、蛋白表达筛选以及蛋白生产，均应使用处于指数生长期且存活率大于等于95%的Sf9细胞。
<ol>
	<li>使用 JetPrime 或 X-tremeGENE 9 等转染试剂（T.R.）将杆状病毒杆粒 DNA 转染入 Sf9 细胞。 
	注意：可使用台盼蓝染色法结合血细胞计数板进行活细胞计数及细胞活力百分比测定。死细胞可摄取染料，在显微镜下呈蓝色，而活细胞不着色。计算细胞活力百分比时，先获得总细胞数（包括着色与未着色细胞），将活细胞数除以总细胞数再乘以100，即得细胞活力百分比。
	<ol>
		<li>将指数生长期的 Sf9 细胞稀释至终细胞密度为 4 x 105 细胞/毫升在&#160;无血清昆虫细胞培养基，倒入无菌试剂储液槽中。</li>
		<li>使用可编程多通道移液器将0.5 mL稀释后的Sf9细胞接种到24孔板的每孔中。</li>
		<li>将板上的一个孔标记为对照孔（未转染），用于比较转染与非转染细胞，以评估是否存在潜在的感染迹象。</li>
		<li>将细胞接种到培养板后，轻轻前后摇晃培养板数次，以确保细胞形成均匀的单层。切勿旋转摇晃培养板，否则细胞会聚集至孔中央。</li>
		<li>将培养板置于27 °C孵育至少1小时，以使细胞贴附于培养板。</li>
		<li>充分混匀转染试剂小瓶。每次转染时，将2 µL转染试剂加入100 µL转染缓冲液中。也可使用其他未添加补充物的昆虫细胞培养基。将稀释后的转染试剂置于无菌试剂储液器中，轻轻混匀10秒。</li>
		<li>使用12通道移液器，将102 µL稀释后的转染试剂转移至无菌96孔微孔板中。</li>
		<li>将10 µL浓度为0.2 µg/µL的重组杆状病毒DNA溶液转移至96孔微孔板中对应的孔内，通过轻轻从侧面敲击振荡混匀。</li>
		<li>孵育转染混合物15-20分钟，以促进复合物形成。</li>
		<li>使用专为在96孔板和24孔板之间转移液体而设计的可调式六通道移液器，将转染混合物逐滴加入转染板中对应的孔内，于27 °C孵育4–5小时。</li>
		<li>孵育期间，轻轻前后摇动培养板数次，以确保转染混合物在细胞单层上均匀分布。</li>
		<li>转染后4-5小时，向每孔加入1.5 mL昆虫无血清培养基，其中添加终浓度为10%（v/v）的热灭活胎牛血清，以及终体积浓度为1%（v/v）的抗生素-抗真菌素混合液（含100单位/mL青霉素、100 µg/mL链霉素和0.25 µg/mL两性霉素B）。</li>
		<li>将细胞置于27 °C培养箱中孵育72–96小时。在可能的情况下，每天轻轻摇动转染板一次。</li>
		<li>观察转染后72-96小时转染细胞中感染迹象（SOI）的表现图2）。请注意，转染的细胞将开始产生病毒并进一步感染培养物，因此需观察感染的迹象。 
		&#8203;注意：感染的迹象表现为昆虫细胞的结构变化，例如细胞直径增大25-50%、细胞核扩大、形态呈均匀圆形、失去增殖能力及对培养皿表面的贴附性，以及细胞活力下降（图2杆状病毒感染的和未感染的Sf9细胞</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. 小规模蛋白质表达筛选与病毒扩增
<ol>
	<li>使用P1杆状病毒原液感染Sf9细胞。 
	注意：转染后4-5天，在倒置显微镜下观察，与对照组（未转染）细胞相比，转染细胞应出现明显的感染迹象。此时，分泌至细胞培养基中的初始重组杆状病毒已可收集。
	<ol>
		<li>将2 × 105个处于对数生长期的Sf9细胞接种于24孔板的每孔中，每孔总体积为2 mL，使用无血清昆虫培养基，用于感染P1病毒以扩增病毒量（从而获得P2代病毒）。</li>
		<li>将细胞加入孔板后，轻轻前后摇动孔板，确保形成均匀的单层细胞。切勿旋转摇动，以免细胞聚集于孔中央。</li>
		<li>将孔板在27 °C下孵育至少1小时，使细胞充分贴壁。</li>
		<li>将4 mL密度为3.5–4 × 106的Sf9细胞用无血清昆虫培养基加入24孔块的每孔中，用于P1病毒感染，以进行蛋白表达筛选。 
		注意：标记24孔板和24孔块中的一个孔作为对照孔，作为未感染对照，用于在观察目的蛋白表达（SOI）时与感染细胞进行比较。</li>
		<li>使用可编程电子多通道移液器，同时完成P1病毒的收集（步骤2.1.13）、新鲜接种的Sf9细胞感染（步骤3.1.1）以及24孔块中悬浮细胞的感染（步骤3.1.4），每孔加入150 µL P1病毒液。</li>
		<li>将剩余收集的P1病毒原液在17,970 × g下离心15分钟，转移至微量离心管中，避光保存于4 °C。</li>
		<li>将24孔板（步骤3.1.1）置于往复摇床上轻轻摇动，确保加入的P1病毒在细胞单层上均匀分布；在孵育期间重复此操作数次。</li>
		<li>用透气膜覆盖含有感染Sf9细胞悬浮培养物的24孔块（步骤3.1.4）。</li>
		<li>将24孔块在27 °C下孵育，以245 rpm振荡72–96小时。</li>
		<li>在感染后72–96小时内，于含有P2病毒的24孔板（步骤3.1.1）和含有感染细胞的24孔块（步骤3.1.4）中观察目的蛋白表达（SOI）。 
		注意：Sf9细胞经P1病毒感染后4–5天，在倒置显微镜下观察，感染细胞应明显表现出目的蛋白表达，与未感染对照细胞形成对比。</li>
		<li>从24孔板中收集P2病毒，于17,970 × g离心15分钟，转移至微量离心管中，避光保存于4 °C。</li>
		<li>感染后72–96小时，用70%乙醇喷洒24孔块，移入超净工作台，通过台盼蓝染色法检测若干孔中的细胞密度和活力。</li>
		<li>若细胞显示感染迹象，且台盼蓝染色评估的细胞活力接近70–75%，则继续进行蛋白纯化。</li>
		<li>将24孔块在4 °C、525 × g下离心15分钟，沉淀细胞。弃去上清液，并将沉淀物充分重悬于1 mL裂解缓冲液中，裂解缓冲液组成为：25 mM Tris（pH 8.0）、300 mM NaCl、0.6% NP-40、2 mM 咪唑、5%（v/v）甘油，以及1×蛋白酶抑制剂混合物（100×蛋白酶抑制剂混合物包含抑蛋白酶肽0.25 mg/mL、亮抑蛋白酶肽0.25 mg/mL、胃蛋白酶抑制剂A 0.25 mg/mL、E-64 0.25 mg/mL）。</li>
		<li>将细胞悬液于-80 °C保存，用于后续测试性纯化（见步骤3.2.2）。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>从24孔测试表达块中的冷冻细胞悬液中进行蛋白纯化。
	<ol>
		<li>结合模块的组装（图3）。
		<ol>
			<li>在96深孔块（96深孔，2.4 mL）顶部叠加三层Parafilm封口膜。</li>
			<li>将96孔滤板（滤膜微孔板，96孔，聚丙烯材质，含25 µm超低分子量聚乙烯膜）置于96深孔块顶部。</li>
			<li>下压滤板，使滤板尖端嵌入Parafilm中，从而将滤板与96深孔块密封。</li>
			<li>将50 µL预平衡的50% Ni-NTA树脂悬液转移至滤板的每一孔中。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>测试表达流程
		<ol>
			<li>将保存于24孔块中的冷冻细胞悬液（步骤3.1.15）置于室温水浴中解冻5–10分钟，随后在450 rpm下振荡20分钟。</li>
			<li>将24孔块在3,275 × g下离心15分钟。</li>
			<li>使用多通道移液器，将澄清的裂解液转移至含有50 µL预平衡50% Ni-NTA树脂悬液（步骤3.2.1.4）的滤板中，并用96孔封板膜（96孔封板膜，适用于方形孔，2 mL）密封滤板。 
			注意：在孵育和离心过程中，可使用数个橡胶圈固定结合模块，防止松动。</li>
			<li>将密封好的结合模块置于冷室中的旋转仪上，孵育45–60分钟，使澄清裂解液与Ni-NTA树脂充分结合。</li>
			<li>孵育结束后，小心提起滤板，从96深孔块表面移除Parafilm层（步骤3.2.1.1）。</li>
			<li>将滤板重新放回96深孔块顶部，将密封的结合模块在235 × g下离心2分钟。</li>
			<li>用洗涤缓冲液（25 mM Tris pH 8.0、300 mM NaCl、5%甘油、15 mM咪唑）对结合的Ni-NTA树脂进行两次洗涤，每次2 mL。</li>
			<li>每次加入洗涤缓冲液后，在235 × g下离心5分钟，确保残留液体完全去除。</li>
			<li>将滤板转移至含有10 µL 4×上样染料的96孔PCR板上方。</li>
			<li>向滤板每孔加入40 µL洗脱缓冲液（25 mM Tris pH 8.0、300 mM NaCl、5%甘油、500 mM咪唑），孵育5分钟。</li>
			<li>将模块在235 × g下离心10分钟，使蛋白洗脱至96孔PCR板中。</li>
			<li>用耐高温封板膜密封96孔PCR板，并在98 °C加热3分钟。</li>
			<li>将15 µL洗脱的蛋白样品与标准Laemmli缓冲液混合，上样于4–20% SDS-PAGE凝胶，与蛋白分子量标记物并列，使用含SDS的标准电泳缓冲液进行电泳。</li>
			<li>用考马斯亮蓝染色凝胶，随后用水脱色。分析测试表达结果，筛选出表达效果最佳的构建体用于大规模生产。</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. 用于蛋白质生产的杆状病毒感染昆虫细胞（SCBIIC）的制备
<ol>
	<li>在预定生产时间前4天，将处于指数生长期的Sf9细胞以终浓度为2 × 106 个细胞/mL接种于含1%（v/v）终浓度抗生素-抗真菌剂的昆虫无血清培养基中，分别加入50 mL / 100 mL / 200 mL培养基于125 mL / 250 mL / 500 mL带挡板的锥形玻璃摇瓶中进行传代。</li>
	<li>加入0.150 mL / 0.300 mL / 0.6 mL相应P2病毒，将感染后的细胞置于轨道摇床上，以每分钟165转、1英寸冲程、25 °C较低温度培养，以减缓细胞分裂速度。</li>
	<li>感染后第4天，在显微镜下检查细胞的感染迹象（SOI），若台盼蓝染色检测显示细胞活力接近70–75%，则继续进行生产。</li>
</ol>
5. 用于大规模蛋白质生产的Sf9细胞制备
<ol>
	<li>在预定生产时间前4天，计算大规模蛋白生产所需的Sf9细胞体积。</li>
	<li>将处于对数生长期的Sf9细胞以1 × 106 个细胞/mL的密度接种于2.8 L的Fernbach摇瓶中，总体积为2 L，培养基为无血清昆虫培养基。</li>
	<li>将摇瓶置于27 °C、150 rpm振荡条件下培养。 
	&#8203;注意：为防止Sf9细胞培养过程中发生细菌污染，可加入庆大霉素至终浓度10 µg/mL，或分别加入青霉素/链霉素至50 U/mL和50 µg/mL。</li>
</ol>
6. Sf9 细胞的感染&#160;使用SCBIIS进行大规模蛋白质生产
<ol>
	<li>将指数生长期的 Sf9 细胞在无血清昆虫培养基中按 2 L 或 4 L 体积分装，调整终浓度为 4 × 106 个细胞/mL，置于 2.5 L 摇瓶或 5 L 试剂瓶中。</li>
	<li>每升培养物中加入 10–12 mL 杆状病毒转染的昆虫细胞（SCBIIC）悬浮培养液。</li>
	<li>将感染后的 Sf9 细胞培养物置于摇床中，在 25 °C（较低温度以减缓细胞分裂）下以 145 rpm 振荡培养 72–96 小时。</li>
	<li>感染后 72 小时，于显微镜下观察细胞状态以确认目标蛋白表达（SOI），并评估细胞活力。</li>
	<li>通常在感染后约 72 小时，Sf9 细胞活力下降至 70%–75%（通过台盼蓝染色法测定）。将感染的 Sf9 细胞收集至 1 L 聚丙烯瓶中，在 4 °C 条件下以 900 × g 离心 15 分钟进行收获。</li>
	<li>用 20–25 mL 1× PBS 轻柔振荡重悬来自 1 L 生产培养物的细胞沉淀，并转移至 50 mL 圆锥形离心管中。</li>
	<li>将细胞悬液在 900 × g 条件下离心 15 分钟，弃去上清 PBS 溶液。</li>
	<li>用 20–25 mL 悬浮缓冲液（20 mM Tris-HCl pH 8.0，500 mM NaCl，5% 甘油，1× 蛋白酶抑制剂混合物）重悬洗涤后的细胞沉淀，随后在液氮中快速冷冻，并于 −80 °C 保存直至纯化。 
	注意：PRMT 蛋白的纯化步骤已在 SGC 发表的论文6 中详细描述。</li>
</ol>

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</ol>

作者声明无利益冲突。

昆虫细胞中杆状病毒表达系统（BEVS）的优势之一在于其翻译后修饰机制能够实现更复杂的修饰，如磷酸化、豆蔻酰化和糖基化。结合哺乳动物蛋白的高效折叠能力，这些修饰有助于产生大量经过修饰且正确折叠的蛋白质，适用于具有生理相关性的下游实验16。
本文详细描述了杆状病毒表达系统（BEVS）的实验方案，重点强调了在杆状病毒表达平台中成功进行多种PRMT蛋白构建体表达筛选及大规模PRMT蛋白生产的关键要素：1）在杆状病毒DNA和病毒生成阶段，以及重组病毒收集、重组病毒扩增和蛋白表达筛选体系制备过程中，使用常规、可调式及可编程多通道移液器在24孔和96孔细胞培养板与样品块之间转移生物材料；2）采用高效且经济的转染试剂生成重组病毒；3）利用杆状病毒感染昆虫细胞的悬浮培养（SCBIIC）进行大规模蛋白生产；4）使用高装液量的2.8 L Fernbach摇瓶维持Sf9细胞悬浮培养，以及2.5 L Tunair摇瓶和5 L试剂瓶进行大规模蛋白生产。
转化与转染步骤的特殊注意事项及原理 
尽管商业试剂盒说明书建议每次转化使用 100 µL 感受态细胞14商业DH10Bac的转化效率 E. coli 感受态细胞的转化效率高达 1 x 108 cfu/µg DNA，因此我们仅使用4 µL。此用量足以使每个转化子获得分离的白色重组菌落，用于分离bacmid DNA。24孔转染板中贴壁生长的Sf9细胞接种密度为2 x 105 /mL 加入 0.5 mL 无血清昆虫细胞培养基中。该体积足以确保孔板工作表面被均匀覆盖，同时不会过度稀释转染混合物，从而提高转染效率。转染试剂对 Sf9 细胞无毒性，因此无需更换培养基。转染后 4–5 小时，向转染孔中直接添加 1.5 mL 含 10%（v/v）FBS 的培养基，以促进细胞生长。两种转染试剂的转染效率均较高。然而，使用 X-tremeGene 9 时，转染细胞中感染迹象（图2比使用JetPrime试剂提前10–12小时出现，因此我们根据后续实验步骤的工作时间安排在这两种试剂之间进行选择，从而为整个流程提供一定的灵活性。
如果初始重组病毒（从转染板收集并标记为P1）的数量有限，不足以用于蛋白表达筛选，则可使用P2病毒进行蛋白检测表达筛选。
从小规模培养转向大规模培养时的注意事项。 
传统上认为，Sf9 细胞在悬浮培养及扩增过程中，最佳细胞生长需要较大的气相空间。然而，2014 年有研究报道指出，培养容器中的大气相空间并不像此前认为的那样关键17。通过将摇床转速适当调整至与其轨道振幅相匹配，即使在高装液量的悬浮培养中，也能产生并长时间维持微小气泡，从而实现充分的氧气传递。采用这种方法，可在细胞正常倍增时间范围内，以较高的摇床转速培养市售昆虫细胞，同时保持高细胞活力。
因此，6年前，我们开始在细胞维持过程中增加摇瓶中的悬浮培养体积，并在调整和监控摇动条件的同时，为蛋白质生产引入了一种不同类型的培养容器（图6）。为了在这些培养容器中建立最佳培养条件，我们监测了Sf9细胞的培养参数，包括&#160;细胞倍增时间以及细胞活力、大小和形态、聚集状态和细胞感染能力。
例如，在Sf9细胞的维持培养中，我们使用2.8 L的Fernbach摇瓶，培养体积为2 L，而非0.8 L，于27 °C、150 rpm条件下振荡培养，细胞活力通常接近99%，且细胞形态均一，呈健康分裂状态。在放大生产时，我们使用5 L试剂瓶，装液量为4 L，在25 °C的较低温度下以145 rpm的较高速度振荡培养进行感染。最常用的内置振荡平台的培养箱可容纳6个2.8 L摇瓶，或6个5 L试剂瓶，或10个2.5 L Tunair摇瓶。因此，若使用2.8 L Fernbach摇瓶，将摇瓶和试剂瓶分别填充至1/3体积与高填充体积时，单个振荡平台的培养容量分别为4.8 L和12 L；而使用5 L试剂瓶时，则分别为10 L和24 L（图6）。在培养容器中采用高填充体积进行悬浮细胞培养的维持与放大生产，有助于我们克服生产体积的限制，并建立大规模培养平台。因此，该方法对于无法获得生物反应器和/或生产流程空间有限的实验室尤为实用。
通过使用适当的树脂并参照SGC已发表论文6中所述方法调整纯化缓冲液，本方案可轻松适用于带有不同亲和标签的蛋白构建体的表达与纯化，例如带有Flag标签的PRMT4、7、9全长蛋白，以及带有His标签的PRMT5-MEP50复合物和PRMT6蛋白。尽管本文以PRMT蛋白家族为例描述了杆状病毒表达系统（BEVS）的实验方案，但该方法同样适用于其他任何蛋白家族。

蛋白质精氨酸甲基转移酶（PRMTs）以单甲基化或对称/不对称二甲基化的方式对精氨酸残基进行甲基化修饰。大多数PRMTs高度偏好含有重复RG/RGG/GRG序列的底物，这类序列广泛存在于多种蛋白质中1,2。被精氨酸甲基化的蛋白质，如组蛋白、转录因子和剪接因子，参与调控转录、RNA剪接以及染色质结构3,4。随着对PRMTs底物和辅因子利用、转换速率及动力学特征的多样化调控机制的深入了解，以及选择性抑制剂的不断开发，人们对这些酶及其复合物的作用机制有了更深入的认识5,6。然而，并非所有PRMT家族成员的研究程度相同；例如，PRMT9直到最近才被确认为PRMT家族的一员1。对这些蛋白质的结构与酶功能研究通常需要获得足够量（常为毫克级）的重组蛋白。
大肠杆菌（Escherichia coli，E. coli）原核表达系统通常是利用多个构建体对特定蛋白质进行表达筛选时的首选方法7,8,9。然而，基于E. coli的表达并不总能产生足量以活性形式存在的PRMT蛋白，这一点我们在PRMT5和PRMT7的表达中尤为明显（见下文）。因此，对于在E. coli中未能成功表达或必须依赖真核表达机制的PRMT蛋白，我们将其亚克隆至适用于替代性杆状病毒表达载体系统（BEVS）中进行表达筛选的载体中。尽管PRMT1、PRMT3和PRMT8的E. coli表达样品已被广泛用于体外（in vitro）检测和晶体学研究，但其他PRMT蛋白（如需要与其双甲基转移酶结构域结合伴侣MEP50共同作用的PRMT5）以及PRMT7和PRMT9等，则必须通过昆虫细胞表达才能获得足量的活性蛋白。总体而言，针对PRMT4、5、6、7和9的标准化中通量甲基转移酶检测均采用了昆虫细胞中的BEVS系统6。杆状病毒表达载体系统（BEVS）是一种多功能平台，适用于需要真核表达机制的重组蛋白生产，可实现生化、生物物理及结构研究中所必需的翻译后修饰10,11,12。自1983年首次报道利用杆状病毒进行蛋白表达以来，多种BEVS系统已实现商业化13。这些系统的大多数采用不同的策略将表达质粒导入昆虫细胞，包括Bac-to-Bac、flashBAC、BaculoGOLD Bright、BacVector-3000、BacMagic、BacPAK等。本实验方案基于BEVS中最常用的Bac-to-Bac系统14，该系统通过位点特异性转座，将编码目标蛋白（POI，此处为PRMTs）的基因/cDNA插入至维持在特定E. coli菌株中的杆状病毒基因组内15。
简而言之，将含有目的基因的质粒转移载体转化至 DH10Bac E. coli 感受态细胞中，以生成重组病毒 bacmid DNA。随后将 bacmid DNA 转染贴壁生长的 Sf9 细胞。转染后 4 至 5 天，收集分泌到细胞培养基中的初始重组杆状病毒，标记为 P1 病毒。利用 P1 杆状病毒储备液进行病毒扩增（即生成 P2 杆状病毒储备液）并开展蛋白表达筛选。根据表达筛选结果，选取表达效果最佳的蛋白构建体对应的 P2 病毒，用于建立杆状病毒感染昆虫细胞的悬浮培养体系（SCBIIS），以实现目标重组蛋白的大规模生产。本文中，我们详细描述了实验方案，并阐述了试剂与培养容器选择背后的科学依据，旨在支持我们发展一种更高效、更具成本效益且可放大的方法，以获得足量的目标重组蛋白。

<table><tbody><tr><td>2.8 L Nalgene&amp;nbsp; Fernbach 培养瓶，聚碳酸酯材质</td><td>Nalgene</td><td>29171-854</td><td>用于Sf9悬浮细胞的大规模培养维护</td></tr><tr><td>24孔板 RB</td><td>Qiagen</td><td>19583</td><td>用于孵育的&amp;nbsp; 4 ml 悬液&amp;nbsp; Sf9细胞&amp;nbsp; 用于蛋白质&amp;nbsp; 表达筛选</td></tr><tr><td>4-20% Criterion TGX 凝胶 26W 15 μl</td><td>伯乐（Bio-Rad）</td><td>5671095</td><td>用于纯化蛋白质的SDS-PAGE分析</td></tr><tr><td>50 ml 试剂储液槽</td><td>Celltreat 科学产品</td><td>229290</td><td>&amp;nbsp;用于稀释转染试剂的储液槽&amp;nbsp; 以及Sf9细胞悬液</td></tr><tr><td>96孔板盖膜，适用于方形孔，2 mL</td><td>Greiner Bio-One</td><td>381080</td><td>用于覆盖96孔板</td></tr><tr><td>96孔PCR板</td><td>Eppendorf</td><td>30129300</td><td></td></tr><tr><td>Bacto 琼脂</td><td>BD</td><td>214010</td><td>用于LB-琼脂选择平板</td></tr><tr><td>Airpore 胶带片</td><td>Qiagen</td><td>19571</td><td>用于覆盖24孔板以进行蛋白质表达筛选</td></tr><tr><td>Allega X-15R 离心机</td><td>贝克曼库尔特</td><td>392932</td><td></td></tr><tr><td>抗生素-抗真菌素（100倍浓缩液）</td><td>Gibco</td><td>15240112</td><td></td></tr><tr><td>Bacmid DNA</td><td>内部</td><td>非目录商品</td><td>用于杆状病毒生产的Bacmid DNA</td></tr><tr><td>Bluo-Gal，1 g</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>15519028</td><td></td></tr><tr><td>Beckman JLA 8.1000</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>细胞培养板，24孔，带盖，平底，无菌</td><td>Eppendorf</td><td>30722116</td><td>组织&amp;nbsp; 培养处理板</td></tr><tr><td>细胞重悬溶液 0.5&amp;nbsp;L</td><td>Millipore Sigma</td><td>LSKCRS500</td><td>用于Bacmid DNA提取</td></tr><tr><td>细胞&amp;nbsp;裂解液 0.5&amp;nbsp;L</td><td>Millipore Sigma</td><td>LSKCLS500</td><td>用于Bacmid DNA提取</td></tr><tr><td>CELLSTAR&amp;nbsp; 96孔组织培养板</td><td>Greiner Bio-One</td><td>655180</td><td>用于转染混合物</td></tr><tr><td>ClipTip 1250，滤芯更换，无菌</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>94420818</td><td>提示&amp;nbsp; 可编程且可调式多通道移液器</td></tr><tr><td>dNTP混合液（每种25 mM）</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>R1121</td><td></td></tr><tr><td>E1-ClipTip&amp;nbsp; 电子可调间距多通道等量移液器，15 至 1250 &amp;mu;L</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>4672090BT</td><td>可编程且可调节的多通道移液器</td></tr><tr><td>E4&amp;nbsp; XLS 可调间距 6 通道移液器，20-300 &amp;mu;L</td><td>Ranin</td><td>LTS EA6-300XLS</td><td>可调式多通道移液器</td></tr><tr><td>滤膜微孔板，96孔，聚丙烯，带25 &amp;micro;超高清分子量聚乙烯膜</td><td>安捷伦</td><td>201005-100</td><td>用于表达筛选中的蛋白质纯化</td></tr><tr><td>Full-Baffle Flask Kit Tunair，2.5 L</td><td>IBI Scientific</td><td>SS-6003C</td><td>用于SF9细胞悬浮培养中的大规模蛋白质生产</td></tr><tr><td>庆大霉素 10x10ml</td><td>BioShop</td><td>15750078</td><td></td></tr><tr><td>热灭活胎牛血清</td><td>Wisent Biocenter</td><td>080-450</td><td></td></tr><tr><td>I-Max 昆虫培养基（含 L-谷氨酰胺），1 L</td><td>Wisent Biocenter</td><td>301-045-LL</td><td>无血清昆虫细胞培养基</td></tr><tr><td>InstantBlue，超快速蛋白质染色剂</td><td>Expedeon 蛋白质解决方案</td><td>ISB1L-1L</td><td>用于蛋白质凝胶（SDS-PAGE）染色</td></tr><tr><td>IPTG，超纯，无二噁烷，纯度≥99.5%</td><td>BioShop</td><td>IPT001.100</td><td></td></tr><tr><td>JetPRIME 转染试剂&amp;nbsp; 提供有&amp;nbsp; jetPRIME 缓冲液</td><td>POLYPLUS TRANSFECTION 公司</td><td>114-01</td><td>用于Sf9细胞转染以生成杆状病毒</td></tr><tr><td>卡那霉素单硫酸盐</td><td>BioShop</td><td>KAN201.100</td><td></td></tr><tr><td>Lb Broth (Lennox)，粉末状微生物培养基&amp;&</td><td>Sigma</td><td>L3022-1KG</td><td></td></tr><tr><td>Masterblock 96深孔板 2.4 mL</td><td>Greiner Bio-One</td><td>780285-FD</td><td>用于转化和表达筛选实验步骤</td></tr><tr><td>Max Efficiency DH10Bac 感受态细胞，0.5 ml</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>10361012</td><td>用于杆状病毒DNA生成的感受态细胞</td></tr><tr><td>mLINE 12通道移液器，可调范围 30 - 300 μL</td><td>赛多利斯</td><td>Sartorius 725240</td><td>12通道移液器</td></tr><tr><td>中和溶液，0.5&amp;nbsp;L</td><td>默克生命科学</td><td>LSKNS0500</td><td>用于杆状病毒DNA提取</td></tr><tr><td>新不伦瑞克&amp;nbsp; Innova 44R，120 V，振荡半径 2.5 cm（1 英寸）</td><td>Eppendorf</td><td>M1282-0004</td><td>用于Sf9细胞悬浮液培养的摇床培养箱</td></tr><tr><td>Ni-NTA 琼脂糖</td><td>Qiagen</td><td>30250</td><td>用于蛋白质纯化</td></tr><tr><td>青霉素-链霉素（10,000 U/mL）</td><td>Gibco</td><td>LS15140122</td><td></td></tr><tr><td>PYREX&amp;nbsp; 带挡板的德隆振荡锥形瓶，Corning&amp;nbsp; 500ml</td><td>Pyrex</td><td>4444-500</td><td>对于&amp;nbsp; Sf9细胞悬浮培养</td></tr><tr><td>PYREX Delong 摇床锥形瓶（带挡板），Corning&amp;nbsp; 125毫升</td><td>Pyrex</td><td>4444-125</td><td>用于Sf9细胞的悬浮培养</td></tr><tr><td>PYREX 带挡板康宁德隆振荡锥形瓶&amp;nbsp; 250 ml</td><td>Pyrex</td><td>4444-250</td><td>用于Sf9细胞的悬浮培养</td></tr><tr><td>RedSafe&amp;nbsp;核酸&amp;nbsp;酸&amp;nbsp;染色&amp;nbsp;溶液</td><td>Froggabio</td><td>21141</td><td></td></tr><tr><td>RNase A，0.9&amp;nbsp;mL</td><td>默克生命科学</td><td>LSKPMRN30</td><td>用于提取杆状病毒DNA的悬浮缓冲液</td></tr><tr><td>滚动 &amp;以及生长球形玻璃镀膜微珠</td><td>MP Biomedicals</td><td>115000550</td><td>对于&amp;nbsp; 铺展&amp;nbsp; 细菌的&amp;nbsp; 琼脂平板表面的菌落分布。</td></tr><tr><td>RT-LTS-A-300&amp;mu;L-768/8（吸头）</td><td>Ranin</td><td>30389253</td><td>多通道移液器使用技巧</td></tr><tr><td>S.O.C. 培养基</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>15544034</td><td></td></tr><tr><td>血清、细胞培养、胎牛血清（Fbs）、Hyclone、经鉴定加拿大来源</td><td>Cytiva Life Sciences</td><td>SH3039602</td><td>添加至无血清培养基&amp;nbsp; 转染的细胞</td></tr><tr><td>Sf9细胞</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>12659017</td><td>昆虫细胞</td></tr><tr><td>Sfx-昆虫细胞培养基</td><td>Cytiva（原GE Healthcare Life Sciences）</td><td>SH3027802</td><td>无血清昆虫细胞培养基</td></tr><tr><td>胶带垫</td><td>Qiagen</td><td>19570</td><td>胶带垫</td></tr><tr><td>Taq DNA 聚合酶（含 ThermoPol 缓冲液）— 2,000 单位</td><td>New England Biolabs</td><td>M0267L</td><td></td></tr><tr><td>盐酸四环素</td><td>BioShop</td><td>TET701.10</td><td></td></tr><tr><td>0.4% 台盼蓝溶液</td><td>Gibco</td><td>15250061</td><td>对于&amp;nbsp; 细胞活力评估</td></tr><tr><td>VITLAB&amp;nbsp; 试剂瓶，聚丙烯材质带螺口盖，聚丙烯，BrandTech，5 L</td><td>VITLAB</td><td>V100889</td><td>用于在Sf9细胞悬浮培养中进行大规模蛋白质生产</td></tr><tr><td>VWR&amp;nbsp; 数字迷你培养箱</td><td>VWR</td><td>10055-006</td><td>贴壁Sf9细胞培养箱</td></tr><tr><td>VWR&amp;nbsp; 微孔板孵育摇床</td><td>VWR</td><td>97043-606</td><td>用于Sf9细胞悬浮培养的24孔板培养箱</td></tr><tr><td>VWR 培养皿</td><td>VWR</td><td>CA73370-037</td><td></td></tr><tr><td>X-tremeGene 9 DNA&amp;nbsp; 转染试剂&amp;nbsp; 1.0 M</td><td>罗氏</td><td>6365787001</td><td>用于Sf9细胞转染以生成重组杆状病毒</td></tr></tbody></table>

利用杆状病毒表达载体系统生产重组prmt蛋白

Production of Recombinant PRMT Proteins using the Baculovirus Expression Vector System

蛋白质精氨酸甲基转移酶（PRMTs）可对多种蛋白质上的精氨酸残基进行甲基化修饰，这些蛋白质参与了众多细胞过程。PRMTs 能够以对称或不对称的方式对精氨酸的胍基进行单甲基化或双甲基化修饰。这些酶的酶学研究是一个复杂且备受关注的领域，需要毫克级高质量的重组蛋白。利用苜蓿银纹夜蛾核多角体病毒（Autographa californica multiple nucleopolyhedrovirus, AcMNPV）和草地贪夜蛾 Sf9（Spodoptera frugiperda 9）昆虫细胞的杆状病毒表达载体系统（BEVS），已被广泛用于多种 PRMTs（包括 PRMT 1、2 以及 PRMT 4 至 9）的表达筛选与蛋白生产。为了同时筛选这些蛋白的多个构建体（包括结构域片段、截短片段以及全长蛋白）的表达情况，我们采用了可放大的实验方法，结合可调节和可编程的多通道移液器，以及 24 孔和 96 孔板与配套试剂块。总体而言，这些方法优化实现了大规模制备杆状病毒 DNA、重组病毒及蛋白表达筛选。使用高装液量的 Sf9 细胞悬浮培养容器，有助于克服单批次大规模蛋白生产流程中的空间限制。本文中，我们详细描述了高效且经济地表达功能性 PRMTs 的实验方案，适用于生化、生物物理及结构研究。

杆状病毒表达系统（BEVS）方案的总体流程如图1所示。在结构基因组学联盟（SGC，多伦多）中，根据内部策略构建了多种PRMTs的表达载体，包括全长序列、结构域及截短片段，旨在提高可溶性、稳定性良好且表达水平相对较高的蛋白的成功率7,9。建议感兴趣的读者参考SGC此前发表的研究中对“片段”（fragment，指插入表达克隆中的基因序列区段）、“结构域”（domain，指PFAM注释的结构域）以及“表达构建体”（construct，指克隆至表达载体中的片段）的定义与设计方法7。本方案中所使用的PRMTs表达构建体用于在pFBOH-MHL载体中表达带有多聚组氨酸标签的蛋白，该载体为pFastBac1载体的衍生物。在图4中，我们展示了从Sf9细胞中4 mL规模表达后收集的菌体沉淀（步骤3.1.4）纯化得到的PRMT1、2、4-9的His标签可溶性构建体的SDS-PAGE分析结果。该凝胶图谱中未包含全长PRMT1和PRMT9，因为全长PRMT1已在大肠杆菌（E. coli）中成功表达，而通过BEVS系统表达的全长PRMT9则使用Flag标签进行纯化6。PRMT1的截短构建体、全长PRMT4以及所有PRMT8构建体表现出相对较高的产量，但蛋白洗脱液中含有一定比例的共纯化杂质。这些构建体需要进一步优化纯化方案。因此，在放大生产过程中，需采用其他策略以提高这些蛋白的纯度，例如：在与澄清裂解液孵育时减少镍珠用量；提高洗涤缓冲液中的咪唑浓度；使用TEV蛋白酶切除His标签后，再通过镍亲和树脂进行纯化；以及增加尺寸排阻层析和离子交换层析等额外纯化步骤。PRMT2的构建体产量显著低于其他蛋白，且全长PRMT2蛋白伴随一条明显的杂质条带。放大生产及包括IMAC和尺寸排阻层析在内的两步纯化证实，该构建体表达水平较低，且全长蛋白始终存在共纯化的杂质。对于PRMT5复合物，当与其必需结合伴侣MEP50共同表达并纯化时，已获得高纯度蛋白。PRMT9的截短构建体表达水平比其他PRMTs低约两到三倍，接近1.5 mg/L。尽管如此，该构建体的重组病毒储备液仍被用于放大生产，并成功获得了可用于X射线衍射的晶体，其与PRMT4、6、7的结构均已解析（图5）。
在放大生产过程中，使用相应的P2代病毒去感染Sf9昆虫细胞的悬浮培养物。此步骤可产生50/100/200 mL含有感染细胞及上清液中P3代病毒的培养物。对于大规模蛋白生产，将2 L的Sf9细胞分别培养于2.8 L的Fernbach摇瓶中，于150 rpm、27 °C条件下振荡培养（图6）。在生产当天，将2.5 L Tunair摇瓶中的2 L Sf9细胞（细胞活力 > 97%）或5 L试剂瓶中的4 L细胞稀释至细胞密度为4 × 106/mL。随后直接加入每升10–12 mL的杆状病毒感染昆虫细胞的悬浮培养物进行感染，并在25 °C、145 rpm条件下继续培养。直接使用杆状病毒感染昆虫细胞的悬浮培养物对生产批次进行感染，显著减少了病毒扩增过程中繁琐且耗时的操作步骤，避免了对感染细胞的额外操作，同时防止了病毒滴度下降和病毒降解。Sf9细胞培养的维持及放大生产均在高装液量的培养容器中进行，以实现单批次的大规模蛋白生产（图6）。
利用杆状病毒介导的表达平台生产的全长PRMT 4、5（与MEP50形成复合物）、6、7和9蛋白，已被用于SGC的酶动力学表征及抑制剂化合物筛选6。PRMT 4、6、7和9的全长或截短形式与多种化学探针及抑制剂结合的晶体结构已被解析，并存入蛋白质数据库（Protein Data Bank, PDB）。这些PRMT蛋白的表达质粒已提交至Addgene质粒库（Addgene是SGC的分发合作伙伴，https://www.addgene.org/），并向科研社区开放获取（图5）。
<img alt="PRMT表达过程示意图；基因构建体到蛋白质生产；包括SDS-PAGE分析。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62510/62510fig01.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="图1"> 
图1：杆状病毒表达过程各步骤的示意图概览 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62510/62510fig01large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="不同条件下细胞形态的细胞培养对比显微镜图像。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62510/62510fig02.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="图 2"> 
图 2：杆状病毒感染与未感染的 Sf9 细胞。感染的特征表现为昆虫细胞的结构变化，例如细胞直径增大 25–50%，细胞核增大，细胞形态均匀呈圆形，失去增殖能力以及对培养皿表面的贴壁能力，并伴随细胞活力下降。白色标尺为 200 µm。此处所示的感染特征在使用两种转染试剂（JetPrime 和 X-tremeGene 9）进行转染的细胞中表现一致。图中所示实例为使用 JetPrime 转染试剂的结果。(A) 作为对照的未感染 Sf9 细胞。(B) 杆状病毒感染的 Sf9 细胞。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62510/62510fig02large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="纯化装置：含Ni-NTA树脂的96孔滤板组件，移液方法示意图。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62510/62510fig03.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="图3"> 
图3：用于快速纯化测试表达蛋白的结合板组件。 详见正文步骤3.2.1-2 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62510/62510fig03large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="蛋白质电泳结果；蛋白质表达水平；PRMT 变体；带有标记物的凝胶泳道。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62510/62510fig04.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Figure 4"> 
图 4：蛋白质表达筛选结果。利用杆状病毒介导的蛋白表达系统，在 4 mL Sf9 悬浮培养细胞中感染相应 P1 重组病毒后，不同 PRMT 蛋白及 PRMT5-MEP50 复合物的蛋白质表达筛选结果。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62510/62510fig04large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="SDS-PAGE 凝胶显示蛋白质条带；质粒构建体表格；蛋白质大小分析。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62510/62510fig05.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Figure 5"> 
图 5：多伦多结构基因组联盟（SGC）用于晶体结构研究的 PRMT4、6、7 和 9 表达构建体汇总。 针对 PRMT4、6、7 和 9 的全长或截短形式，结合多种化学探针和抑制剂，其晶体结构已被解析并提交至蛋白质数据库（PDB）。这些 PRMT 的表达质粒已存入 Addgene 质粒库，并向科研社区开放获取（Addgene 是 SGC 的分发合作伙伴，https://www.addgene.org/）。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62510/62510fig05large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="使用Nalgene Fernbach烧瓶和Tunair摇瓶装置进行Sf9细胞培养和蛋白生产。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62510/62510fig06.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="图6"> 
图6：不同培养容器中Sf9昆虫细胞的维持与蛋白生产：（A）2.8 L Fernbach烧瓶用于细胞维持和蛋白生产。采用72%的装液量可在同一摇床平台上使通量提高2.5倍。（B）Tunair摇瓶（本图中仅显示10个中的9个）和装液量为80%的试剂瓶可显著提高摇床平台的生产能力。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62510/62510fig06large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>

杆状病毒表达载体系统（BEVS）是一种强大的平台，可用于表达筛选和生产蛋白精氨酸甲基转移酶（PRMTs），以用于生化、生物物理和结构研究。对于大多数PRMTs及其他需要真核表达平台的目标蛋白，均可产生毫克级的材料。

利用杆状病毒表达载体系统生产重组PRMT蛋白

蛋白质精氨酸甲基转移酶（PRMTs）可对多种蛋白质上的精氨酸残基进行甲基化修饰，这些蛋白质参与广泛的细胞过程。

本实验方案的总体目标是，在表达平台S（杆状病毒表达载体系统）的支持下，以成本效益较高的模式进行大规模生产，对多种蛋白精氨酸甲基转移酶构建体进行表达筛选，从而获得毫克量级的蛋白质，用于生化、生物物理及结构研究。Alma Seitova 博士将演示以下步骤：将处于指数生长期的 SF9 细胞用无血清昆虫培养基稀释至终浓度为每毫升 0.4 × 10⁶ 个细胞，并倒入无菌试剂储液槽中。使用可编程多通道移液器将0.5 mL稀释后的SF9细胞接种到24孔板的每孔中。此体积足以确保细胞均匀覆盖孔板的工作表面，同时不会过度稀释转染混合物，从而保证转染效率。将培养板中的一个孔标记为“仅细胞”，并将其用作对照，以比较转染与未转染细胞，评估是否存在潜在的感染迹象。将培养板在27°C条件下孵育至需要时，约一小时，使细胞贴附于细胞培养板上。在无添加物的昆虫培养基和无菌试剂储液槽中稀释充分混匀的转染试剂，并轻轻混匀10秒。使用12通道移液器，将102微升稀释后的转染试剂转移至无菌的96孔MicroWell板中。向96孔MicroWell板的相应孔中加入10微升浓度为0.2微克/微升的重组bacmid DNA，并通过轻轻摇动或从侧面轻弹平板进行混匀。将转染混合物于室温孵育15至20分钟，以形成复合物。使用专为在96孔板和24孔板之间转移液体而设计的可调式六通道移液器，将转染混合物逐滴加入转染板相应孔中的细胞上，并在27摄氏度下孵育4小时。为确保转染混合物在细胞单层上均匀分布，在孵育期间应轻轻前后摇动培养板数次。转染后4至5小时，加入1.5 mL无血清昆虫细胞培养基。加入终浓度为10%的热灭活胎牛血清和1%的抗生素-抗真菌剂。将细胞在27°C培养箱中培养72至96小时。在可能的情况下，每天轻轻摇动转染板一次。在转染后72至96小时观察转染细胞中明显的感染迹象。转染后四到五天，在倒置显微镜下，与对照细胞相比，转染细胞中应可观察到明显的感染迹象，且初始重组杆状病毒已分泌至细胞培养基中，可进行收集。使用可编程电子多通道移液器，同时收集P1代病毒，并用150微升P1代病毒感染新接种的SF9细胞，进行悬浮细胞的感染，操作在24孔板中进行。将剩余的全部P1病毒储备液在15分钟内离心沉淀，用感染的SF9细胞悬浮培养物覆盖24孔板，并用AirPore膜密封。将24孔板置于27°C、245 rpm振荡条件下培养72至96小时。在预定生产时间前四天，将处于指数生长期的SF9细胞以每毫升200万个细胞的终浓度接种于含1%终浓度抗生素和抗真菌剂的无血清昆虫培养基中，使用带挡板的锥形玻璃摇瓶进行传代培养。此步骤将产生含有感染昆虫细胞和上清液中P2病毒的悬浮培养物，用于后续生产批次中对新细胞的感染。加入相应的P2病毒，将感染后的细胞在25摄氏度的较低温度下孵育，以减缓细胞生长，并在轨道摇床（振幅1英寸）上以165 RPM的速度振荡培养。在预定生产时间前四天，将处于对数生长期的两升SF9细胞接种至昆虫无血清培养基中，细胞密度为每毫升100万个细胞，使用2.8升的Fernbach摇瓶进行培养。在27摄氏度、150 RPM的振荡条件下摇动烧瓶。研究人员Ashley Hutchinson将演示以下实验方案。将四升指数生长期的SF9细胞与无血清昆虫培养基混合，分装至大的五升试剂瓶中，最终细胞密度为每毫升400万个。加入10至12 mil的杆状病毒感染昆虫细胞的悬浮培养物。将感染的SF9细胞培养物置于摇床中，在25摄氏度的较低温度下以145 RPM振荡培养72至96小时。如图五所示，可在SF9细胞中利用杆状病毒瞬时表达系统表达PRMT家族的多种重组蛋白，获得毫克级产量，用于生物化学与生物物理的教学研究。在 SGC，已解析并存入蛋白质数据库（Protein Data Bank）的晶体结构包括蛋白质 PRMT4、6、7 和 9 的全长或截短形式，以及它们与多种化学探针和抑制剂结合的结构。这些 PRMTs 的表达质粒已由 SGC 存入基因文库，并向科研界开放获取。在本视频中，我们重点介绍了利用杆状病毒表达系统进行大规模生产时，对多种蛋白精氨酸甲基转移酶构建体成功开展实验筛选的关键要素。使用常规的可调节和可编程多通道移液器，使整个操作过程比以往更加迅速且高效。采用对细胞高效且细胞毒性较低的转染试剂来生成重组病毒，使得该细胞处理转染方案更具成本效益。利用悬浮培养的杆状病毒感染六种细胞的大规模批次进行蛋白生产，显著减少了耗时的活体起始扩增步骤所需的人力。 例如，将感染细胞与特殊培养物一起进行离心。这当然排除了对感染细胞的额外操作，以避免病毒在更严格的条件下发生降解。悬浮培养细胞的维持在此类放大生产中，借助培养容器中较高的培养液体积，帮助我们克服了生产规模的限制，并实现了大规模生产平台的建立。这对于无法获得生物反应器或生产流程中空间有限的实验室具有重要价值。尽管本方案已针对蛋白质精氨酸甲基转移酶家族的蛋白质进行描述，但该方法同样适用于其他任何需要表达平台以获得足够数量蛋白质用于生物化学与生物物理教学研究的蛋白质家族。

production-recombinant-prmt-proteins-using-baculovirus-expression

Research

科研

JoVE Journal

Biochemistry

生物化学

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改造杆状病毒表达载体以在昆虫细胞中产生分泌型植物蛋白

学习使用杆状病毒表达载体系统在SF9昆虫细胞中高效生产重组蛋白精氨酸甲基转移酶。该方法可快速获得毫克级PRMT蛋白，适用于生化、生物物理及结构生物学研究。

利用杆状病毒表达载体系统生产重组PRMT蛋白

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