Name: 通过 FASP 消化和数据独立分析，EPS-尿液的蛋白质配置文件 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-05-08T15:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 48 s
Description: 了解FASP消化结合数据独立采集质谱技术用于EPS尿液蛋白质组分析的完整流程。该方法可实现深度蛋白质组覆盖，适用于前列腺癌生物标志物发现研究。

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本工作由意大利大学与研究部（MIUR，Ministero Università Ricerca，PRIN 2017 项目资助，授予 MG）以及卡拉布里亚大区 FESR 2014–2020 计划行动 1.2.2 资助。 &#34;INNOPROST&#34;.

本研究获得了卡坦扎罗Magna Graecia大学机构伦理委员会的批准（批准号：RP 41/2018）。所有参与本研究的患者均签署了书面知情同意书。
1. 样品制备
<ol>
	<li>采集后2小时内，将EPS-尿液样本在室温下以2,100 × g 离心10分钟。将上清液储存于-80 °C，直至使用。</li>
</ol>
2. 样品解冻
<ol>
	<li>在消化前一日，将样品从 -80 °C 转移至 -20 °C。</li>
	<li>在样品处理前，先将样品在 4 °C 下放置 15–20 分钟，然后置于室温下。</li>
</ol>
3. FASP 试剂准备
<ol>
	<li>同一天配制以下溶液：尿素缓冲液、50 mM 碘乙酰胺（IAA）的尿素缓冲液、50 mM 三乙基碳酸氢铵（TEAB）以及 500 mM 二硫苏糖醇（DTT）。</li>
	<li>配制尿素缓冲液（8 M 尿素，100 mM Tris-HCl pH 8）：取 4,800 mg 尿素，加入 1 mL 1 M Tris pH 8 后，用 HPLC 水定容至 10 mL。每份样品需使用 800 µL 尿素缓冲液。</li>
	<li>配制 500 mM 二硫苏糖醇（DTT）：将 38.5 mg DTT 溶于 500 µL HPLC 水中。每份样品需使用 66.7 µL DTT。</li>
	<li>配制 50 mM 碘乙酰胺（IAA）的尿素缓冲液：将 9.25 mg IAA 溶于 1 mL 尿素缓冲液中。每份样品需使用 50 µL IAA。</li>
	<li>配制 50 mM 三乙基碳酸氢铵（TEAB）：将 150 µL 1 M TEAB 加入 2.85&#160;mL HPLC 水中。每份样品需使用 460 µL TEAB。</li>
	<li>用 HPLC 水配制胰蛋白酶溶液（100 ng/µL）。该溶液可于 -80 °C 保存，使用前立即解冻。每份样品需使用 2 µL（200 ng）。</li>
</ol>
4. 通过FASP进行蛋白质消化
<ol>
	<li>将每份 EPS-尿液样本 500 µL 与 66.7 µL 10% (w/v) 十二烷基硫酸钠 (SDS)、66.7 µL 500 mM DTT 和 33.3 µL 1 M Tris pH 8 混合稀释，以溶解蛋白质并还原二硫键。在 95 °C 下轻轻振荡孵育 10 分钟。</li>
	<li>在滤膜装置（10 kDa）中加入 300 µL 稀释后的 EPS-尿液样本，于 14,000 x g 20分钟。</li>
	<li>向滤膜中加入 200 µL 尿素缓冲液，于 14,000 x g 离心 g 15分钟。重复此步骤，然后弃去流出液。</li>
	<li>加入50 µL IAA溶液，6,000 x g离心 g 25 分钟。</li>
	<li>加入 200 µL 尿素缓冲液，于 14,000 x g 离心 g 20分钟。重复此步骤，然后弃去穿流液。</li>
	<li>加入200 µL 50 mM三乙基碳酸氢铵缓冲液（TEAB），在14,000 × g离心20分钟。重复此步骤。</li>
	<li>将滤器单元转移至新的收集管中。</li>
	<li>加入60 µL 50 mM TEAB缓冲液和200 ng胰蛋白酶，将样品置于37 °C恒温混匀仪中过夜孵育。 
	注意：为避免样品在过夜孵育过程中蒸发，需用一层铝箔包裹每个滤膜单元，再用一层帕拉膜（parafilm）包裹。</li>
	<li>胰蛋白酶孵育后，加入140 µL水，将小管在14,000 × g离心25分钟，收集消化液（180–200 µL）。</li>
</ol>
5. SCX 纯化试剂的准备
<ol>
	<li>按以下步骤配制 1 mL 洗涤液 1（0.5% 甲酸（FA）和 20% 乙腈（ACN））：将 50 µL 的 10% FA 和 200 µL 的 100% ACN 加入 750 µL 的 HPLC 水中。每个样品需要 100 µL 洗涤液 1。</li>
	<li>按以下步骤配制 1.5 mL 洗涤液 2（0.5% FA 和 80% ACN）：将 75 µL 的 10% FA 和 1.2 mL 的 100% ACN 加入 225 µL 的 HPLC 水中。每个样品需要 190 µL 洗涤液 2。</li>
	<li>配制 100 µL 洗脱液（500 mM 醋酸铵（AA）和 20% ACN）：将 25 µL 的 2 M AA 和 20 µL 的 100% ACN 加入 55 µL 的 HPLC 水中。</li>
	<li>按以下步骤制备 StageTips。
	<ol>
		<li>使用钝头注射器针头（16 号）将一层 SCX 树脂填充至 200 µL 移液枪头中。将 StageTip 插入预先打孔的微量离心管盖中，以固定微柱。</li>
		<li>将该管盖组装到一个已移除原盖的 2 mL 微量离心管上。组装好的微型固相萃取（micro-SPE）离心装置应可放入台式离心机中。由于打孔的管盖制备繁琐，可多次重复使用。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
6. SCX 纯化
<ol>
	<li>使用洗涤液2将每个样品的30 µL稀释至120 µL。</li>
	<li>在提取树脂上加入50 µL洗涤液1，以400 × g离心2分钟，对StageTip进行预处理。由于流动阻力取决于提取树脂在移液枪头中的填充紧密程度，可能需要调整离心速度，以获得20–30 µL/min的流速。在上样和洗涤过程中，应尽量避免柱尖干燥。</li>
	<li>用50 µL洗涤液2对StageTip进行平衡，并以400 × g离心2分钟。</li>
	<li>以较低的离心速度加载稀释后的样品（120 µL）。</li>
	<li>用50 µL洗涤液2洗涤StageTip，并以400 × g离心2分钟。再用50 µL洗涤液1重复洗涤一次。 
	注意：此步洗涤后，树脂必须完全干燥。</li>
	<li>使用较低的离心速度，缓慢加入7 µL洗脱液（500 mM醋酸铵（AA）和20%乙腈），洗脱肽段混合物。</li>
	<li>加入27 µL的0.1%甲酸（FA），以稀释醋酸铵，并制备用于LC-MS/MS初步进样的样品。最终稀释至34 µL后，尿液与肽段溶液的体积比为1:1（1 µL纯化后的消化产物对应于1 µL原始尿液样品）。</li>
</ol>
7. 使用 DDA 分析通过外标法进行蛋白质定量（图 2）
<ol>
	<li>通过将 2 µL 肽段消化产物注入 LC-MS/MS 并将所得总肽段峰面积与以下方式构建的校准曲线进行插值，确定样品中的蛋白质量：</li>
	<li>使用 HeLa 消化原液（100 µg/µL）配制五种不同浓度的 HeLa 消化溶液（1 ng/µL、2.5 ng/µL、7.5 ng/µL、25 ng/µL、75 ng/µL）。</li>
	<li>每种 HeLa 溶液重复进样两次（2 µL）。</li>
	<li>设置 LC-MS/MS 方法。
	<ol>
		<li>将 2 µL 的五种 HeLa 肽段混合物分别注入，在一根长 15 cm、内径 75 µm、填充有 3 µm C18 硅胶颗粒的色谱柱上，以 230 nL/分钟的流速，采用 75 分钟的线性梯度进行肽段分离。流动相由 A 相（0.1% 甲酸，2% 乙腈）和 B 相（0.1% 甲酸，80% 乙腈）组成。</li>
		<li>通过在 60 分钟内将 B 相比例从 6% 升至 42%，再在额外 8 分钟内升至 100%，进行梯度洗脱。维持 100% B 相 5 分钟，然后在 2 分钟内返回至 0% B 相。</li>
		<li>采用 DDA 模式，设置 top-12 采集方法，MS 全扫描范围为 350–1800 m/z，分辨率 70,000，AGC 目标值 1e6，最大注入时间 50 ms。前体离子隔离窗口设为 1.6 m/z，分辨率 35,000，AGC 目标值 1e5，最大注入时间 120 ms，HCD 碎裂能量为 25 NCE（归一化碰撞能量），动态排斥时间为 15 秒。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>使用 Sequest 作为搜索引擎，以 HUMAN Uniprot 完整蛋白序列数据库进行原始数据文件分析。在本研究所展示的实验中，数据库下载于 2016 年 3 月，包含 42,013 条序列。
	<ol>
		<li>采用以下参数设置：MS 容差 15 ppm，MS/MS 容差 0.02 Da，酶选择胰蛋白酶并允许两个漏切位点。将赖氨酸、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸的羧甲基化（+57.021）和甲硫氨酸的氧化设为可变修饰，半胱氨酸的羧甲基化（+57.021）设为固定修饰。肽段和蛋白鉴定的错误发现率（FDR）阈值设为 0.01，并使用 Percolator 进行过滤。</li>
		<li>计算所有 MS1 肽段信号的峰面积，并求所有肽段的总面积。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将 EPS-尿液样品获得的肽段混合物取 2 µL，采用与 HeLa 样品相同的 LC-MS/MS 方法进样，并使用与 HeLa 数据处理相同的参数分析原始数据文件。</li>
	<li>通过加和所有已鉴定肽段的峰面积，计算肽段信号的总强度，并与外标曲线进行插值。由此可获得 EPS-尿液蛋白消化产物中肽段含量的合理估计值。</li>
</ol>
8. C18 StageTip 方案的试剂准备
<ol>
	<li>配制500 µL溶液A（0.1%三氟乙酸（TFA），50%乙腈（ACN））：将250 µL 100%乙腈和10 µL 5% TFA加入240 µL HPLC用水中。</li>
	<li>配制2 mL溶液B（0.1% TFA）：将40 µL 5% TFA加入1960 µL HPLC用水中。</li>
	<li>配制100 µL洗脱溶液（0.1%甲酸（FA），50%乙腈（ACN））：将1 µL 10%甲酸和50 µL 100%乙腈加入49 µL HPLC用水中。</li>
	<li>按先前所述方法制备StageTips。本实验使用C18萃取 disks。</li>
</ol>
9. SCX/C18 StageTip 实验方案
注意：通过 C18 StageTip 方案纯化 EPS-尿液消化产物，以去除盐分。
<ol>
	<li>从2 µg肽段（通过初步进样定量）开始，用洗脱液2 SCX将消化产物溶液稀释4倍，随后按上述（第部分）所述步骤进行操作 &#34;SCX 纯化&#34;用洗脱液（500 mM 醋酸铵（AA）和 20% 乙腈（ACN））缓慢洗脱肽段混合物，使用较低的离心速度（流速为 5 µL/min），收集 7 µL 洗脱液。</li>
	<li>用150 µL含0.1%三氟乙酸（TFA）的溶液酸化SCX洗脱液，使pH低于3，有机溶剂浓度低于5%。</li>
	<li>用50 µL溶液A对C18 StageTip进行预处理，并以400 x g离心 g 孵育2分钟。用50 µL溶液B平衡C18 StageTip，然后在400 x g下离心 g 2 分钟。</li>
	<li>使用较低的旋转速度，将样品缓慢加载到stage-tip上。</li>
	<li>用50 µL溶液B洗涤C18 StageTip，然后离心。</li>
	<li>使用较低的离心速度，用10 µL洗脱液缓慢洗脱肽混合物。</li>
	<li>在30 °C下，使用真空离心浓缩仪将洗脱液（10 µL）干燥3分钟。加入47 µL 0.1% 甲酸（FA）。预计肽段浓度为40 ng/µL。采用DIA模式进行LC-MS/MS分析。</li>
</ol>
10. DIA 分析（图3）
<ol>
	<li>纳升液相色谱分离：使用15 cm长、内径75 µm、填充有3 µm C18硅胶颗粒的色谱柱，在230 nL/min流速下采用140分钟线性梯度分离肽段混合物。
	<ol>
		<li>以230 nL/min流速进行梯度洗脱，90分钟内将流动相B的比例从3%升至25%，随后30分钟内从25%升至40%，最后8分钟内从40%升至100%。</li>
		<li>在100% B条件下保持10分钟后，用流动相A平衡色谱柱15分钟。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>质谱参数：采用以下扫描循环进行数据非依赖采集（DIA）分析：(i) 一次全扫描MS事件，分辨率17,500（自动增益控制目标值1e6，最大注入时间50 ms），随后为 (ii) 20个隔离宽度为20 m/z的窗口，起始于m/z 350，(iii) 5个隔离宽度为50 m/z的窗口，以及(iv) 1个隔离宽度为200 m/z的窗口，DIA扫描范围截止于m/z 1200。DIA扫描在分辨率35,000下进行（自动增益控制目标值5e5，最大注入时间120 ms，归一化碰撞能量25 NCE）。</li>
</ol>
11. 用于文库构建的高pH反相C18分级分离
注意：将 EPS-尿液代表性样本混合，样本量需超过 10 µg，以便通过以下步骤建立用于 DIA 分析的数据依赖型谱库：
<ol>
	<li>用0.2%的TFA将肽混合物（11 µg）酸化，并将所得溶液加载至C18 StageTip上，该StageTip填充有两层萃取盘以提高载样量。我们估计单个微盘（来自16号规格注射器针头）的载样量在5–10 µg范围内。</li>
	<li>按照C18纯化中已描述的方法对固定相进行活化和平衡。</li>
	<li>通过逐步洗脱（n=10）进行肽段分级，洗脱液为含有0.2%氢氧化铵、10 mM TEAB以及体积分数递增的乙腈（4%、8%、12%、16%、20%、24%、28%、32%、40%、80%）的溶液，采用高pH反相C18柱进行分离。</li>
	<li>使用DIA方法相同的色谱参数分析这10个组分。将质谱仪设置为DDA模式，采用此前初步分析中使用的参数（见&#34;基于DDA分析的外标法蛋白质定量&#34;）。</li>
</ol>
12. 数据分析
<ol>
	<li>通过导入高反相C18分级分离的DDA LC-MS/MS实验所获得的蛋白质鉴定结果，在专用于DIA分析的软件中生成谱图库。</li>
	<li>将用于鉴定和定量的碎片离子的最小和最大数量分别设置为3和6，并以Q值0.01对获得的结果进行过滤。</li>
	<li>导入DIA原始文件，并为每个原始文件关联用于构建谱图库时所使用的相同FASTA文件。</li>
	<li>将用于蛋白质定量的独特肽段的最小和最大数量分别设置为1和10。</li>
	<li>通过累加碎片离子峰面积来计算每个蛋白质的强度。</li>
	<li>生成一个矩阵，包含各样本中已定量蛋白质的强度值。</li>
</ol>

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</ol>

所有作者均声明无利益冲突。

本研究提出了一种分析EPS-尿液样本的策略。FASP方案是尿液蛋白质组学的理想选择，因为它允许在酶解前对样本进行浓缩。事实上，采用该流程，可将数百微升的尿液样本加载到单个滤膜上并进行处理。此外，滤膜上的消化步骤在变性条件的选择上具有相对较高的灵活性。在本研究中，通过将尿液样本稀释于含有Tris、SDS和DTT的缓冲液中（终浓度：50 mM Tris、1% SDS、50 mM DTT）实现蛋白质变性。为了防止活性蛋白酶引起不必要的降解，样本解冻后立即进行高效变性。通过将洗涤体积从100 µL增加至200 µL，对原始FASP方案进行了优化。这样可更有效地去除残留物，特别是滤膜中的去垢剂。
在酶解后，使用快速LC-MS/MS数据依赖方法通过外标法进行蛋白质定量，然后对所有样品（起始量均为2 µg）进行后续步骤，包括双层StageTip纯化以及DIA模式下的LC-MS/MS分析。
FASP 的多功能性与 DIA 方法相关联，后者是一种灵敏度高且缺失值数量较少的方法。17在本研究中，共鉴定并定量了2387种蛋白质，从而能够绘制出EPS尿液详细的蛋白质组学图谱。上述2387种蛋白质的鉴定与定量得益于通过构建丰富的质谱谱图库而实现，该谱图库的获得 通过 高pH反相肽段分级分离，以及我们针对广泛目标的DIA方法 m/z 前体范围。该工作流程鉴定出在直接EPS分析中先前发现的超过80%的蛋白质，表明EPS尿蛋白质组中有相当一部分确实来源于表达的前列腺分泌物，因此是前列腺组织特异性蛋白质的丰富来源26.
综上所述，我们的实验设计结合了FASP的多功能性与DIA的高灵敏度，以获得尿液蛋白质组的丰富图谱。该策略推荐用于分析EPS-尿液样本，但也可推广至一般的尿液蛋白质组学研究，甚至其他类型的样本。

蛋白质组学技术的持续发展有望通过提供存在于多种样本（如组织和生物体液）中关键分子效应物的高分辨率图谱，在疾病诊断和治疗反应预测方面产生重大影响。从分析角度来看，尿液具有多个优势，例如易于采集，且其蛋白质组相较于其他生物体液具有更高的稳定性1。在泌尿系统癌症的生物标志物发现研究中，尿液的蛋白质组学分析尤为值得关注，因为它能够实现对目标组织附近区域的无创取样2。特别是，一种在前列腺相关疾病研究中具有前景的样本是EPS-尿液3,4（即直肠指检（DRE）后收集的尿液样本）。在样本采集前进行的这一操作可使尿液富含前列腺特异性蛋白。EPS-尿液是研究前列腺相关疾病（包括前列腺癌（PCa））的理想候选样本5，因为通过直肠指检，肿瘤分泌的蛋白质可释放至尿液中，从而提高检测到癌组织特异性蛋白的可能性。
质谱（MS）在实现潜在蛋白质生物标志物的检测与定量方面发挥着关键作用。在过去二十年中，得益于质谱仪器和数据分析软件的持续改进，基于质谱的蛋白质组学分析方案使得单次液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）运行中可检测到的蛋白质数量不断增加6。
基于质谱的蛋白质组学样品制备通常包括对蛋白质混合物进行酶解消化，可通过多种方案实现，例如：溶液内消化、MStern印迹7、悬浮捕获（S-trap）8、固相增强型样品制备（SP3）9、StageTip内消化10以及滤膜辅助样品制备（FASP）11。所有这些方案均可用于尿液蛋白质组学研究，尽管在鉴定出的蛋白质和肽段数量以及重复性方面结果可能有所不同12。
在本研究中，我们的关注点集中在采用FASP方案对EPS-尿液进行分析。FASP方案最初设计用于分析从组织和细胞培养物中提取的蛋白质，但随后其应用范围扩展至其他类型的样本，如尿液13。与直接在溶液中进行消化的方法相比，FASP是一种更为灵活的蛋白质组学策略14，因为它能够在酶解前有效去除蛋白质混合物中的去垢剂及其他污染物（如盐类）15，从而允许选择最优的蛋白质溶解条件。此外，FASP的另一个特点是能够实现样本浓缩。这一点在尿液蛋白质组学分析中尤为重要，因为它允许从相对较大的样本体积（数百微升）开始实验。鉴于FASP方案的潜力，已有多个研究致力于工作流程的自动化，旨在降低实验变异性，并实现大量样本的并行处理16。
在我们的工作流程中，FASP 之后采用数据非依赖性分析（DIA）模式进行 LC-MS/MS 检测，该方法可实现高蛋白质组覆盖率、良好的定量精确性以及较低的缺失值发生率。DIA 是一种高灵敏度的方法，其特点是所有离子均被选中进行 MS/MS 扫描，这与数据依赖性分析（DDA）相反，在 DDA 中仅对强度最高的离子进行碎裂。质谱仪在 DIA 模式下运行时，通过不同隔离宽度的扫描循环覆盖整个 m/z 前体离子范围。该方法能够在单位时间内可重复地检测到大量肽段，从而提供样本的蛋白质组学快照17。此外，DIA 产生的数据还具有另一个重要特性：支持事后（a posteriori）分析18。DIA 数据比 DDA 获得的数据更为复杂，因为在 DIA 中，每个 m/z 窗口内多个前体离子共存并被共同隔离，导致 MS/MS 谱图为复合谱图19。将这些复合的 MS/MS 谱图解析为独立且特异的肽段信号，需要依赖两个关键要素：谱图数据库和专用的数据分析软件。谱图数据库通常通过数据依赖性实验生成，一般需结合肽段分级分离以最大化蛋白质组覆盖率，从而提供一份包含数千个在特定样本中可检测到的前体离子及其对应肽段 MS/MS 谱图的实验列表。数据分析软件则利用谱图数据库中的信息解析 DIA 数据，生成特异的提取离子色谱图，实现肽段的鉴定与定量。尽管目前无数据库依赖的 DIA 数据分析已成为可能，但基于数据库的 DIA 方法在蛋白质组覆盖率方面仍表现更优20。
此处描述的样品制备方案（图1）包括以下步骤：离心（去除细胞碎片）、FASP消化、StageTip纯化21、蛋白质定量以及DIA分析。该方案最初设计用于前列腺癌生物标志物研究中EPS尿液的分析，但也可适用于任何尿液样本的蛋白质组学分析。

<table><tbody><tr><td>1 M Tris HCL pH 8.0</td><td>Lonza</td><td>51238</td><td></td></tr><tr><td>用于合成的2-碘乙酰胺</td><td>Merck</td><td>8047440100</td><td></td></tr><tr><td>用于HPLC LC-MS级的乙腈</td><td>VWR</td><td>83640.290</td><td></td></tr><tr><td>乙酸铵</td><td>Fluka</td><td>9690</td><td></td></tr><tr><td>氢氧化铵溶液</td><td>Sigma</td><td>30501</td><td></td></tr><tr><td>氢氧化铵滴定标准品，5N 水溶液</td><td>Merck</td><td>318612-500ML</td><td></td></tr><tr><td>二硫苏糖醇</td><td>Amresco</td><td>0281-25G</td><td></td></tr><tr><td>Empore 47 mm 阳离子萃取盘</td><td>Microcolumn</td><td>2251</td><td></td></tr><tr><td>Empore C18 萃取盘</td><td>Varian</td><td>12145004</td><td></td></tr><tr><td>Optima级甲酸</td><td>Fisher Scientific</td><td>A117-50</td><td></td></tr><tr><td>Hela蛋白消化标准品</td><td>Fisher Scientific</td><td>88329</td><td></td></tr><tr><td>带有Ultracel-10膜的Microcon-10kDa离心过滤装置</td><td>MERCK</td><td>MRCPRT010</td><td></td></tr><tr><td>十二烷基硫酸钠溶液</td><td>Merck</td><td>71736-500ML</td><td></td></tr><tr><td>三乙基铵碳酸氢盐缓冲液</td><td>Merck</td><td>T7408-100ML</td><td></td></tr><tr><td>三氟乙酸</td><td>Riedel-de Ha&amp;euml;n</td><td>34957</td><td></td></tr><tr><td>来源于猪胰腺的胰蛋白酶</td><td>Merck</td><td>T6567-1MG</td><td></td></tr><tr><td>尿素</td><td>Merck</td><td>U6504-500G</td><td></td></tr><tr><td>用于HPLC梯度的水</td><td>Fisher Scientific</td><td>W/0106/17</td><td></td></tr><tr><td>Proteome Discoverer 1.4</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Spectronaut 14.0</td><td>Biognosys</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

通过fasp消化和数据非依赖性分析获得的eps尿液蛋白质组谱

Proteomic Profile of EPS-Urine through FASP Digestion and Data-Independent Analysis

滤器辅助样品制备法（FASP）因其能够浓缩稀释样品，并且兼容多种去垢剂，已被广泛用于蛋白质组学样品制备。FASP等自下而上（bottom-up）的蛋白质组学工作流程越来越多地依赖于数据非依赖性分析（DIA）模式下的液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）方法，这种扫描方式可实现深度的蛋白质组覆盖，并显著降低数据缺失率。
本报告中，我们将详细介绍一种结合FASP方法、双层StageTip纯化步骤以及DIA模式下LC-MS/MS技术的尿液蛋白质组作图工作流程。作为模型样本，我们分析了前列腺按摩后尿液（EPS-尿液），即在进行直肠指检（DRE）后采集的尿液样本，该样本在前列腺癌生物标志物发现研究中具有重要意义。

尿液蛋白质组学分析方案包括以下步骤：FASP消化、通过外标校准法估计蛋白质含量、双阶段StageTip纯化（SCX和C18）以及DIA模式下的LC-MS/MS分析。
蛋白质消化后，对所得肽段进行StageTip SCX纯化，随后进行初步上样。通过处理LC-MS/MS原始数据文件，获得鉴定出的肽段数量、鉴定出的蛋白质数量以及检测到的肽段峰面积。将所有鉴定出的肽段峰面积加和得到的总面积，用于通过外标法插值估算蛋白质含量：外标为以五种不同上样量（分别为2、5、15、50、150 ng）注入的HeLa蛋白质消化产物。本研究中分析的六个样品的蛋白质含量因样品而异，平均值为78 ng/µL。
蛋白质定量后，从每个样本中取 2 µg 消化后的蛋白质，通过顺序排列的 SCX 和 C18 StageTip 进行纯化，然后进行 DIA 分析。用于搜索 DIA 数据的谱图库是通过对代表性样本（例如，样本混合物）进行高 pH 反相分级分离及 DDA LC-MS/MS 分析后建立的。根据上述参数，我们在所研究的六个 EPS 尿液样本中累计鉴定并定量了 2387 个蛋白质组（补充表 1 和 图 4）。
为了从定性角度评估已鉴定和定量的蛋白质列表的相关性，将所得矩阵与先前在直接获取的 EPS22 中鉴定出的 624 种蛋白质列表进行比较。该样本通过更具侵入性的方法采集，已被证实是潜在前列腺癌生物标志物的重要来源。在 EPS 尿液样本中，我们的 FASP/DIA 方案成功检测到了 624 种蛋白质中的 508 种。
<img alt="样品制备与蛋白质组学：离心、FASP、SCX、C18纯化、DIA质谱分析。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62512/62512fig01.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图1"> 
图1：蛋白质组学工作流程。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62512/62512fig01large.jpg" target="_blank">请点击此处查看本图的放大版本。</a>
<img alt="HeLa 溶液工作流程图；FASP 法、DDA 分析、SCX 纯化、蛋白质定量。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62512/62512fig02.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图 2"> 
图 2：基于外标法（HeLa 消化液）的蛋白质定量实验设计示意图。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62512/62512fig02large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="样品分馏与纯化示意图；用于构建谱图库和DIA数据分析的LC-MS/MS分析。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62512/62512fig03.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Figure 3"> 
图3：DIA分析的关键步骤：（i）通过高pH反相分馏和DDA分析构建谱图库，（ii）采用DIA方法进行样品分析，（iii）使用Spectronaut进行数据分析。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62512/62512fig03large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的高清版本。</a>
<img alt="蛋白质丰度曲线；排序与浓度；图表；蛋白质组学数据分析；人类蛋白质。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62512/62512fig04.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Figure 4"> 
图4：检测到的EPS尿液蛋白质的排序图。部分选定的蛋白已标注。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62512/62512fig04large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
补充表1：Spectronaut中六个EPS尿液样本中定量蛋白质的代表性表格。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62512/Supplementary%20Table%201.xls" target="_blank">请点击此处下载该表格。</a>

本文介绍了一种经过优化的滤膜上消化方案，并详细说明了以下步骤：蛋白质消化、肽段纯化以及数据非依赖性采集分析。该策略应用于表达性前列腺分泌物——尿液样本的分析，可实现尿液蛋白质组的高覆盖度和低缺失值的无标记定量分析。

通过FASP消化和数据非依赖性分析获得的EPS尿液蛋白质组谱

过滤辅助样品制备法（FASP）因其能够浓缩稀释样品且兼容……，被广泛用于蛋白质组学样品制备。

FASP 方法在尿液蛋白质组学研究中具有重要意义，因为它能够兼容强变性缓冲液，并且能够在滤膜上浓缩样品，这对于稀释的蛋白质样品尤为关键。FASP 方法结合数据非依赖性采集质谱分析技术，使我们能够实现对前列腺按摩后尿液（EPS-尿液）中蛋白质组的深度覆盖。目前，我们正在将您即将看到的这一方法应用于前列腺癌生物标志物的发现研究中。该操作步骤将由 Licia Prestagiacomo、Paola Morelli 和 Caterina Gabriele 演示。在样本采集后两小时内，将 EPS-尿液样本在室温下以 2,100 RCF 离心 10 分钟。然后将上清液储存在 -80 摄氏度直至使用。将样品置于冰上或4°C环境中。为加快实验进程，可在消化前一天将样品从-80°C转移至-20°C。所需储备溶液包括：500毫摩尔的DTT、10% SDS、pH为8的1摩尔Tris缓冲液。将每份500微升的EPS-尿液样本与67微升SDS、67微升DTT和33微升Tris缓冲液混合稀释。在95摄氏度下孵育10分钟，同时轻轻振荡。组装截留分子量为10,000道尔顿的离心过滤装置。然后，向滤膜中加入 300 微升稀释后的 EPS-尿液样本。在 14,000 g 条件下离心约 20 分钟。离心进行约 15 分钟后，可暂时中断操作，以检查过滤过程是否顺利进行。继续操作，直至全部溶液通过滤膜。然后加入 200 µL 尿素缓冲液，在 14,000 ×g 离心 15 分钟。重复此步骤一次。当穿流液即将接触滤膜时，用移液枪吸出穿流液，清空收集用的Eppendorf管。蛋白质已安全固定在滤膜上。进行半胱氨酸烷基化时，需在使用前立即配制碘乙酰胺溶液。称取约10毫克碘乙酰胺，置于一个Eppendorf管中，用尿素缓冲液溶解，配制成浓度为9.25毫克/毫升（即50毫摩尔/升）的溶液。向每个滤膜中加入50微升碘乙酰胺溶液，在6,000 ×g离心25分钟。较低的离心速度可防止滤膜完全干燥。蛋白质烷基化后，用两份连续的200微升尿素缓冲液洗涤滤膜，并在14,000 g下离心20分钟。弃去滤过液。加入200微升50毫摩尔的三乙基铵碳酸氢盐缓冲液，并在14,000 g下离心20分钟。重复此步骤。在完成最后一次碳酸氢盐洗涤后，将滤膜装置转移至新的收集管中。然后加入 60 微升 50 毫摩尔的 TEAB 缓冲液。加入1微升浓度为200纳克/微升的胰蛋白酶溶液。或者，您也可以在Eppendorf管中为所有样品配制消化缓冲液，然后向每个滤膜中加入61微升消化缓冲液。如果使用ThermoMixer以避免样品在过夜孵育过程中蒸发，请先用一层铝箔包裹每个滤膜单元，再用一层Parafilm封口膜包裹。将样品在37摄氏度下孵育过夜。次日早晨，将滤膜转移至台式离心机中进行极短时间的离心。离心后，打开Eppendorf管盖，加入140 µL水。将离心管在14,000 g条件下离心25分钟，以收集肽段。收集到的体积应约为190 µL。为去除消化产物中残留的SDS，建议在进行LC-MS-MS分析前对肽段进行强阳离子交换纯化。使用镊子或剪刀等尖锐工具刺穿Eppendorf管盖，制备微柱支架。该支架用于在离心过程中固定微柱。由于制备较为繁琐，支架可多次重复使用。使用钝头工具和针头，从合适的萃取盘上取下一块斑块。萃取盘是由含有吸附颗粒的软性高分子材料制成。本实验中，吸附剂由具有强阳离子交换特性的颗粒组成。将斑块放入一个200微升的移液器吸头中。使用活塞将塞子推向吸头末端。应牢固地推动小圆盘，但避免用力过度。将吸头插入支架中，并使用一个已移除原装盖子的 2 毫升 Eppendorf 离心管组装旋转微柱。16 号针头的塞子的上样容量约为 5 微克肽。用连续两次洗涤对微柱进行预处理。合适的流速取决于将滤盘压入移液器吸头的力度。目标是使流速达到每分钟20至30微升。在洗涤和加样过程中，应避免吸头完全变干。用洗涤液二将样品稀释五倍，并以较慢速度将结果溶液上样。流速应控制在每分钟约15至20微升。如有需要，弃去穿流液。洗去残留的去垢剂。然后，让色谱柱自然干燥，再进行肽段洗脱。将微柱转移至一支干净的1.5 mL离心管中，并立即加入洗脱液。即为含有20%乙腈的500毫摩尔每升乙酸铵溶液7微升。用27微升含0.1%甲酸的水溶液稀释洗脱液，以降低有机溶剂的百分比，然后将所得溶液2微升注入液相色谱-串联质谱（LC-MS-MS），采用数据依赖模式进行检测。本方案所用液相色谱-质谱联用仪（LC-MS）的设置细节将在视频的后续部分给出。完成数据库搜索和肽段误差整合后，计算总峰面积，然后将其与外部标准曲线进行比较，以估算FASP消化液中的肽段浓度。在估算肽段含量后，根据下述方法，通过连续两次StageTip纯化，从FASP消化液中纯化出相当于两微克肽段的新等分试样。本方案中使用的液相色谱-质谱（LC-MS）系统基于直接进样至分析柱。如果您使用的是带有捕获柱的系统，则可省略离线C18纯化步骤。请记得为每种色谱材料使用专用的进样针和活塞。用10微升洗脱液从C18 Stage Tip上洗脱肽段后，将洗脱液在真空离心浓缩仪中部分蒸发数分钟，注意避免完全蒸干。然后加入47微升0.1%甲酸，将所得溶液置于HPLC小瓶中用于LC-MS分析。所用系统基于直接上样至分析柱，无需使用捕获柱。分析柱由自制而成，方法是将一段75微米内径的毛细管在去除部分聚酰胺涂层后拉制而成。所得的尖端可用陶瓷切割刀轻轻修整。然后将该毛细管放入装填装置中，用浓度为50毫克/毫升的异丙醇C18 3微米固定相颗粒悬浮液进行填充。需要使用10至20巴的氮气或氦气压力。可使用替代的或商用色谱柱，以每分钟亚微升级流速运行。将色谱柱组装在T型接头上。另外两个端口分别连接至高压电源和HPLC进样环。通过在等度洗脱条件下运行系统来评估最佳喷雾电压，然后开始分析。按照所示进行为期两小时的色谱梯度分离肽段。数据采集包括一次快速的全扫描质谱（MS）一级扫描，随后对26个可变宽度的前体离子窗口进行二级质谱（MS-MS）扫描。前20个窗口的m/z宽度从20开始，覆盖350至750 Thomson的m/z范围。然后对接下来的五个窗口采用 50 m/z 的宽度，最后以一次隔离宽度为 200 Thompson 的 MS-MS 扫描结束。较窄的窗口对应谱图中肽段前体更为密集的区域。进行 DIA 分析时需要一个谱图库。为了生成谱图库，可以使用与DIA采集相同的LC-MS-MS系统以及相同的色谱梯度，进行若干次数据依赖型实验。样品分馏可提高蛋白质组覆盖度。可使用Stage Tips进行样品分馏。强阳离子交换和碱性反相是两种有效的替代方法。从若干FASP消化产物混合而成的10微克样品开始，用0.2% TFA将样品酸化至终浓度。将肽段加载至高容量C18 Stage Tips上。若肽段量较大，应使用多个小柱。对于10微克样品，建议使用两个小柱。按照先前所述方法进行C18纯化。准备多个收集洗脱液的小瓶，数量与组分数相同。在此情况下，通过逐步洗脱产生10个组分。最后一次洗涤后，加入20微升第一种洗脱液：0.2%氢氧化铵、10毫摩尔/升TEAB、4%乙腈。在第一个离心管中完全洗脱第一组分后，将 Stage Tip 转移至下一个收集管。使用0.2%氢氧化铵、10毫摩尔每升TEAB作为洗脱液，分步加入20微升，并逐步增加乙腈的用量进行稀释。在对样品进行分组并针对每组进行数据依赖性采集实验后，通过MS-MS数据的数据库搜索生成质谱图库。随后，该文库将被导入具备DIA数据分析功能的软件中，用于基于至少三个转换离子对所分配的至少一个独特肽段进行蛋白质定量。预期可覆盖尿液蛋白质组的广泛范围。此图展示了跨越五个数量级丰度范围的蛋白质鉴定与定量结果。本文所介绍的工作流程结合了FASP方案的浓缩优势与多功能性以及DIA扫描模式的高灵敏度，从而提供了尿液蛋白质组的丰富图谱。由于我们的分析流程未包含捕获柱的使用，因此FASP消化产物通过强阳离子交换和反相Stage Tip进行了纯化。当捕获柱直接连接至分析柱时，可省略反相 Stage Tips 步骤。建议将此工作流程用于分析 EPS 尿液样本，但也可将其应用扩展至尿液蛋白质组学的一般研究。

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科研

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Biochemistry

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绘制疾病中功能失调的蛋白质-蛋白质相互作用图谱

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通过FASP消化和数据非依赖性分析获得的EPS尿液蛋白质组谱

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