朗根多夫方法的修改，用于从成年小鼠中同时分离心房和心室肌细胞
2021年5月13日
该协议描述了Langendorff方法的修改，包括主动脉插管的深度，以便同时从成年小鼠中分离心房和心室肌细胞。
该协议可以帮助提高灌注小鼠心脏的心房产量。该方法的主要优点是可以在相同的消化条件下同时分离心房和心室肌细胞。这种方法可以在细胞和亚细胞水平上深入了解心脏病的机制。
对8至10周龄的雄性C57黑六只小鼠实施安乐死后，使用组织镊子抬起西腓的皮肤。然后使用组织剪刀，在皮肤上做一个小的横向切口。在皮肤和筋膜之间进行钝性解剖。
将皮肤切口向腋窝伸展，两侧呈V形，并继续通过胸腔切口。然后使用组织镊子，夹住胸骨并将胸腔向上偏转，以完全暴露心脏和肺部。使用弯曲的镊子，剥离心包。
如果胸腺覆盖大血管，使用两个弯曲的镊子将胸腺向两侧撕裂，然后轻轻地将心脏底部向尾部拉动，直到主动脉及其支动脉可见为Y形血管。横断左颈总动脉的主动脉，然后切开肱头动脉。切除心脏，立即将其浸入含有Tyrode溶液的培养皿中，以清洗并泵出残留的血液。
然后将心脏转移到另一个含有溶液一的培养皿中。在体视显微镜下，使用精细的虹膜剪刀修剪任何多余的组织。从注射器中排出气泡。
然后在两个直系镊子的帮助下，进行逆行主动脉插管，注意整个插管过程在液体表面下进行。调整插管深度，使套管尖端位于升主动脉，注意不要穿透主动脉瓣。然后用预结3-O缝合线，将主动脉固定到套管缺口。
从注射器中轻轻注射溶液一以冲洗掉残留的血液。然后将管的心脏连接到 Langendorff 装置，注意不要将任何气泡引入心脏。将插管的心脏连接到Langendorff装置后，用溶液一填充心脏约两分钟。
使用一次性无菌聚乙烯移液器，吸取约2.5毫升溶液三，并在水浴中预热以备后用。然后消化组织，用剩余的溶液三填充心脏约11至12分钟。用溶液三灌注的前两分钟后，通过蠕动泵将灌注溶液循环到灌注液储液器中重复使用，直到消化完成。
当心脏肿胀，变得略微苍白和松弛时，使用齿镊子轻轻捏住心肌。如果印记可见，终止消化并将心脏从装置中分离出来。为了分离动脉和心室肌细胞，使用镊子去除心室和心房，并将它们放在不同的培养皿中。
然后将预热的溶液三加入两个盘子中。使用钝镊子，将组织研磨成浑浊的质地，然后轻轻移液组织以进行均匀消化，而不会引入气泡。为了阻止剩余的酶活性，使用移液管将浑浊的消化组织转移到溶液四中，然后以192倍G离心20秒，除去上清液后，将细胞沉淀物重悬于溶液五中。
为了避免钙悖论和钙过载，通过逐渐向细胞悬浮液中加入总共50微升每升氯化钙100毫摩尔，逐步重新引入钙。一旦添加了所有的氯化钙，将细胞储存在Tyrode的溶液中，用于膜片钳研究。插管深度与心房及其附属物的灌注有关。
当套管尖端位于升主动脉时，两个心耳都充气，表明心房灌注充分。然而，当套管尖端位于主动脉根部时，两个心耳均被切断，表明灌注不足。在升主动脉通过插管分离的心房肌细胞在钙再引入之前和之后通过主动脉根部插管分离的心房肌细胞具有更高的存活率。
相反，在钙再引入之前和之后，通过升主动脉或主动脉根部的插管分离的心室肌细胞的存活率没有差异。隔离的心房和心室肌细胞中钠电流的全细胞膜片钳记录以及电流密度证实了分离细胞的质量符合电生理实验的要求。当切除主动脉时，确保保留足够的腺体进行结扎。
否则，套管可能在结扎后穿透主动脉瓣。
概述
本协议描述了Langendorff方法的修改，用于同时分离成年小鼠的心房和心室肌细胞。该方法增强了心房肌细胞的产量，同时保持了用于电生理学研究的分离细胞质量。
关键研究组成部分
科学领域
- 心血管生理学
- 细胞生物学
- 电生理学
背景
- Langendorff方法是一种广泛用于心脏灌流的技术。
- 同时分离心房和心室肌细胞可以提供更好的心脏功能洞察。
- 了解肌细胞行为对于研究心脏疾病至关重要。
- 提高心房肌细胞产量对于准确的实验结果至关重要。
研究目的
- 增强从小鼠心脏中分离心房肌细胞的产量。
- 允许同时分离心房和心室肌细胞。
- 研究心脏疾病的细胞机制。
使用的方法
- 处死成年雄性C57BL/6小鼠以提取心脏。
- 进行逆行主动脉插管以进行灌流。
- 用特定溶液对心脏进行灌流以进行消化。
- 分离肌细胞并为电生理学研究做准备。
主要结果
- 使用修改方法分离的心房肌细胞显示出更高的存活率。
- 同时分离不影响心室肌细胞的质量。
- 电生理学记录证实了分离细胞的活力。
- 最佳插管深度对于有效的心房灌流至关重要。
结论
- 修改的Langendorff方法提高了心房肌细胞产量。
- 同时分离增强了心脏生理学研究能力。
- 本协议可以促进对心脏疾病机制的更好理解。
常见问题
Executive Industry Relevance
Simultaneous isolation of atrial and ventricular myocytes using a modified Langendorff method addresses a critical bottleneck in cardiac target validation and mechanistic de-risking. This protocol enables high-quality, reproducible cell preparations essential for predictive electrophysiological assays and translational cardiac research. The approach supports robust early discovery and preclinical workflows by ensuring reliable access to both atrial and ventricular cell types from a single preparation.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables direct interrogation of atrial and ventricular mechanisms in disease-relevant systems.
- Supports functional target validation by providing viable myocytes for mechanistic studies.
- Facilitates predictive confidence in cardiac safety and efficacy assessments.
Screening & Assay Development
- Delivers standardized, high-viability cardiomyocytes for downstream electrophysiological assays.
- Improves assay reproducibility by controlling for cell source and preparation conditions.
- Enables scalable preparation of both atrial and ventricular cells for compound screening.
Translational & Preclinical Research
- Aligns cellular models with disease-relevant atrial and ventricular pathologies.
- Ensures continuity from early discovery through preclinical cardiac safety studies.
- Reduces biological risk by validating cell quality for patch clamp and functional assays.
Pipeline & Workflow Integration
This protocol integrates at the interface of early discovery and preclinical cardiac research, supporting workflows from hypothesis testing to lead identification and safety de-risking.
- Discovery Biology: Provides robust cellular substrates for mechanistic hypothesis testing and pathway analysis.
- Screening: Supplies reproducible, quantitative readouts for electrophysiological assay development.
- Analytics: Enables direct measurement of sodium currents and cell viability for comparative studies.
- Translational Research: Bridges cellular findings to preclinical cardiac models by ensuring cell quality and relevance.
- Enterprise Reuse: Establishes a standardized, reusable protocol for consistent cardiomyocyte isolation across projects.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in cardiac research.
- Operational Value: Enhances standardization, reproducibility, and scalability of cell isolation workflows.
- Strategic Value: Improves go/no-go decision quality and capital efficiency by reducing late-stage biological risk.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of cardiac programs.
Implementation Considerations
- Requires technical expertise in cardiac dissection and Langendorff perfusion.
- Needs access to specialized perfusion apparatus and patch clamp infrastructure.
- Demands rigorous cross-team standardization of cannulation and digestion steps.
- Adaptation may be needed for different mouse strains or cardiac disease models.
- Careful control of cannulation depth is critical for optimal atrial cell yield and viability.
