采用FlashPack方法简易自制超高效毛细管色谱柱

采用FlashPack方法简易自制超高效毛细管色谱柱。本实验方案旨在介绍一种优化的快速、简便的超高效毛细管色谱柱填柱方法，用于液相色谱-质谱联用蛋白质组学分析。现代蛋白质组学依赖于与超高效毛细管液相色谱联用的质谱技术。

肽段分离通常在内径为75微米的毛细管柱中进行。与商业产品相当，毛细管柱也可在实验室自行制备。自制柱的分离性能与商业产品相似，同时可大幅节约成本，并允许对固定相材料和柱尺寸进行定制。

本文演示了一种用于实验室自制毛细管色谱柱的优化填充方法，我们称之为 FlashPack。该优化方法的核心思想是：在仍使用常见的 100 bar 压力罐填充装置的前提下，采用极高浓度的固定相浆液进行填充。这需要持续打破在高浓度固定相条件下于色谱柱入口处形成的固定相团聚物，因为这些团聚物会阻碍新的固定相材料进入毛细管。

从技术上讲，我们通过使用磁力搅拌子作为锤子，持续加热并在吸附剂填充的金属丝内部移动毛细管来实现这一目标。正确应用 FlashPack 可使填充速度提高至原来的 10 倍。这使其适用于填充粒径更小、更软的超高效吸附剂，并可在合理时间内制造长达一米的极长色谱柱。

色谱柱制备过程包括五个步骤。三个准备步骤，包括装柱装置的组装以及毛细管和吸附剂浆液的制备。随后，在60至100 bar的压力下，首先在压力罐中对毛细管进行填装。

接着将填充好的毛细管连接到高效液相色谱系统，通过高压将吸附剂装填并切割色谱柱至所需尺寸。FlashPack 操作步骤需要对常规方案中的第三步和第四 步进行修改。首先，我们准备一个装填装置。

它由一个氮气罐组成，出口压力至少为50巴。该气罐连接至放置在磁力搅拌器中的压力罐的排气阀。排气阀的出口通过内径较小的PEEK毛细管插入水中，从而实现对减压过程的精确控制。

接下来，我们准备一根毛细管。填料可装填至带有集成玻璃烧结片的烧结毛细管中，该烧结片由Kasil和甲酰胺制成；另一种选择是将填料装填至由Sutter激光拉制仪制备的拉制毛细管中。

毛细管的长度必须比预期的色谱柱长度长10至15厘米。以下视频以拉制的喷雾毛细管填装为例进行演示。使用剪切的凝胶加样枪头保护拉制的喷雾毛细管末端。

详细信息请参见稿件的文本版本。下一步是吸附剂悬浊液的制备。首先，将约50毫克干吸附剂放入1.5毫升离心管中。

这将是一个储存吸附剂的小瓶。本视频使用了Dr.Maisch公司生产的Reprosil Pur C18 AQ 1.9微米吸附剂。向储存吸附剂的小瓶中加入1毫升甲醇。

涡旋10秒，然后在超声浴中继续超声10秒。让吸附剂充分浸泡20至30分钟，再进行一次涡旋和超声处理。

准备一个工作用的吸附剂小瓶。该小瓶必须为锥底小瓶，且能够放入压力室中。可以使用另一个1.5毫升离心管，或其他类型的小瓶，具体取决于特定压力室的设计。

使用一个带裙边的锥形底螺口管，将其切割至与压力弹高度一致。将储存柱吸附剂中的吸附剂重新悬浮，并与一个尺寸为2×3毫米的磁力搅拌子一同转移500微升至工作柱吸附剂小瓶中。用甲醇将工作小瓶中的液体体积补至1毫升。

将工作小瓶置于桌面上静置10分钟，使吸附剂通过重力沉降。此步骤的结果应为一个锥形底部小瓶，其底部松散吸附剂层高度约为4毫米。如果吸附剂层过低，可从储备小瓶中添加更多吸附剂。

如此制备的工作用小瓶可用于在数月内多次制备多根色谱柱。若工作用填料小瓶静置未搅拌超过两小时，则在装柱前必须再次进行涡旋振荡、超声处理，并静置沉降。当所有准备工作完成后，进入第四步，即在加压装置中进行装柱。

使用熔融石英毛细管和压力炸弹时，务必佩戴护目镜。同时，不建议佩戴防护手套。手套会显著降低操作小直径毛细管所需的手指触觉，从而导致操作失误。

将吸附剂小瓶放入压力罐中，并将所有接头拧紧。以每分钟60至100转的速度开始旋转，将带有烧结滤片或拉制而成的喷雾毛细管插入压力罐中。将其推至小瓶最底部，然后上提2至3毫米，并固定接头。

施加固定毛细管所需的最小作用力。检查毛细管是否已正确固定，必须确保用手无法将毛细管拔出。

非常缓慢地打开压力炸弹阀门，同时确保毛细管的开口端远离您的面部。观察填充过程的初始步骤。一旦加压，填料立即充满毛细管，使其整体变得不透明。

一旦吸附剂开始在毛细管远端填充，背压即会升高，流速减慢，毛细管内原本均匀的吸附剂悬浊液会重新形成多个吸附剂段，各段之间由不含吸附剂的间隙分隔。已填充的吸附剂表现为颜色较深、持续增长的连续区域。在整个填充过程中，应保持吸附剂填充区域至少占毛细管长度的70%，并保留少量不含吸附剂的间隙。

在装填过程中需注意几个常见问题。这些问题需要在操作过程中及时调整设置，以确保填料能够高效地进入毛细管。最常见的问题是，当已装入毛细管内的填料仍在移动时，新的填料却停止进入毛细管。

大多数情况下，毛细管入口会被自聚集的吸附剂颗粒堵塞。请逐一执行以下步骤，直至吸附剂流动恢复，然后跳过其余与问题相关的步骤。将转速提高至每分钟500转，随后立即调回至60 RPM。

大多数情况下，这能恢复吸附剂的流动。在后续的装柱过程中，检查转速是否至少达到60 RPM。如果仍无改善，可短暂释放装柱罐的压力，然后立即重新加压。

如果问题仍未解决，或阻塞再次发生，请重新调整毛细管在吸附剂层内的位置。吸附剂缺失可能是由于毛细管开口端过高，导致柱末端未接触到磁棒；或者毛细管位置过低，插入了离心管底部。

首先完全释放反应弹内的压力，然后松开螺母，将毛细管推至底部，再回拉两毫米。固定螺母。打开阀门以对反应弹加压，并继续填充。

有关装柱问题的更多细节在方法的文字版本中有详细描述。继续装柱，直至达到目标柱长度加5至7厘米为止。停止旋转，并非常缓慢地释放压力罐内的压力。

稍微打开炸弹阀，等待水瓶内的气泡释放减缓。然后将阀门再开大一些，再次等待气泡释放速度减慢。通过这种逐步增加的方式释放压力，直至阀门不再有气体排出为止。

切勿一次性完全打开阀门，否则会导致毛细管内产生气泡，并使吸附剂倒流回小瓶中。若发生此情况，需重新对反应罐加压，并等待色谱柱再次填装完毕。

当排气阀不再有气体排出时，将装填好的毛细管从压力罐中取出。切勿让色谱柱干燥。若不能立即连接至高效液相色谱（HPLC）系统进行进一步装填，请将整根毛细管浸入10%乙醇溶液中保存。

未连接的 HPLC 柱以相同方式保存。若今日不再进行填装，需将吸附剂小瓶从高压釜中取出并拧紧盖子，留待后续柱填装使用。

第五步，高效液相色谱柱填装。通过高效液相色谱连接装置将填装好的毛细管连接至高效液相色谱系统。启动高比例有机溶剂的流动。

根据填充长度调整流速，目标压力约为 300 bar。对于 40 厘米长的填充毛细管，使用 200–300 标准毫升/分钟的流速。注意观察毛细管内是否存在松散的吸附剂，这会增加总的填充长度。

在不中断流动的情况下，将柱体部分浸入超声波清洗池中两次。注意仅需浸入柱体的一部分，切勿将柱体两端及毛细管连接处浸入。

当吸附床不再收缩时，将柱体在超声浴中再浸入两次，同时保持流动不中断。在300 bar压力下继续运行柱子额外10分钟。停止流动，等待压力降至3 bar以下，然后拆下柱子。

目视检查色谱柱是否存在间隙或变色现象。若发现上述情况，可在流动状态下重复超声处理。对于关键实验，建议制备新的色谱柱。

将色谱柱切割至所需长度。正确的切割是保证色谱柱效率的前提。使用刻划工具在聚酰胺涂层上刻出切口。

部分压裂毛细管，将两段分开。使用陶瓷片或研磨膜对色谱柱前端进行抛光。使用超高压连接件将色谱柱重新连接至液相色谱系统。

起始工作流速为2%B。工作流速需根据色谱柱参数进行调整。例如，内径为100微米的色谱柱以每分钟500纳升的流速运行。

等待压力平衡后，检查色谱柱的反压。制备良好的色谱柱，其反压应与其长度和填料特性成正比。例如，一根30厘米长、填充有2微米填料的毛细管柱，在2%溶剂B条件下，反压为450至500 bar。若所制备的色谱柱反压处于预期范围内，即可投入使用。

如果背压远超出预期范围，则色谱柱或液相色谱系统存在问题。使用FlashPack进行填装可在100 bar的填装压力下，于一小时内完成50厘米长、填料粒径为1.9微米的毛细管柱填装。例如，我们制备了一根30厘米长、内径为100微米的超高压色谱柱，将其填装至拉制而成的喷雾毛细管中，填料为1.9微米的Reprosil-Pur C18 AQ吸附剂。

在60 bar压力下，将填料装填至50厘米长的拉制毛细管发射器中。在40分钟内将毛细管填充至40厘米长度，毛细管内仍残留部分未填充的吸附剂。将填充好的毛细管连接至高效液相色谱系统，并以300纳升/分钟的流速使用溶剂B进行冲洗，本实验中溶剂B为80%乙腈、0.1%甲酸。

最终装填长度为43厘米。色谱柱被截断至30厘米。在每分钟500纳升、99%溶剂B的工作流速下，色谱柱产生的背压为275巴，接近预期值。

为测试色谱柱性能，我们使用2%-50%B的15分钟梯度分离了50 fmol细胞色素C蛋白的胰蛋白酶消化产物。色谱峰高度对称，拖尾最小，平均半峰宽约为三秒。

所述方案能够在常见的100 bar装柱装置中，在合理的时间内制备出超高效液相色谱（UHPLC）柱。短型高效液相色谱（HPLC）或超高效液相色谱（UPLC）柱可在数分钟内完成装填，而30–50厘米长的色谱柱装填时间也少于一小时。该方法适用于将具有反相（RP）或其他任何化学性质的吸附剂高效地装填至任意内径的色谱柱中。

所制备的色谱柱在相同尺寸和吸附剂参数下，其效果与任何其他商用色谱柱具有可重复性且相当。