用Fluo-4/AM染色苹果果肉中的胞质Ca²⁺

作为一种重要的矿物元素，钙在苹果等果树果实的生长和品质调控中发挥着关键作用，能够调节果实的硬度、糖含量、贮藏期以及贮藏期间的生理失调。钙成像是检测细胞质中钙离子动态变化最常用的方法。小分子荧光探针（如 fluo-4/AM）具有对钙离子的特异性选择性，可通过酯化孵育实现非侵入性加载，具有操作灵活、快速且无细胞毒性的优点。

本方案将介绍一种将小分子化学荧光试剂Fluo-4/AM加载到植物原生质体中的方法。原生质体提取：向一个1.5毫升离心管中加入0.5毫升酶解液。选取一个健康且成熟的苹果，将果肉切成10 × 5 × 1 立方毫米大小的片状。

将果肉组织放入酶解液中，然后盖紧管盖。在28摄氏度条件下孵育1小时，于黑暗环境中以70 rpm振荡。

随后，清洗原生质体碎片，吸除全部酶解液，然后加入 0.5 毫升基础溶液。以 300 ×g 的速度离心 2 分钟。通过吸取底部溶液即可获得原生质体悬液。

小分子化学荧光试剂染色。按1:1:2的比例，将2毫摩尔的Fluo-4/AM、20%乙基127和10倍浓度的磷酸盐缓冲液混合，配制Fluo-4/AM负载溶液。取1微升Fluo-4/AM负载溶液加入99微升原生质体悬液中。

荧光染料的终浓度为 5 微摩尔。混匀溶液后盖上管盖。同时，镧系元素铁对小分子化学荧光试剂的钙离子或特异性具有影响。

向98微升原生质体悬浮液中加入一微升或十微升镧离子，然后加入一微升fluo-4/AM染料负载溶液。镧离子的终浓度为100微摩尔。混匀溶液后盖紧管盖。

在避光条件下37摄氏度孵育30分钟。随后以300 ×g离心2分钟。吸除上清至剩余17 µL溶液，加入17 µL基础溶液。

将原生质体悬液在37摄氏度下孵育30分钟以充分完成反应。随后，吸取50微升原生质体悬液滴加到载玻片上，在荧光显微镜下观察。选择20倍放大倍数及GFP通道进行观察。

将亮度统一调整为0.5。本方法中的关键步骤是洗涤原生质体中的染料，并孵育30分钟。洗涤不充分会导致观察时荧光背景过高，而孵育有助于探针更好地进入细胞质。

原生质体活力检测：将原生质体悬浮液在37摄氏度下孵育30分钟后，取99微升。向原生质体悬浮液中加入1毫升FD溶液。用移液器反复吹打数次以混匀溶液，然后盖紧管盖。

避光、室温孵育五分钟。制备载玻片，并在荧光显微镜的GFP通道下观察。我们向您展示图一的实验结果。

我们采用酶解法从果肉中获得原生质体。部分原生质体含有液泡，而另一些则不含。原生质体用FD染色5分钟，显示细胞质中出现荧光，表明高温（37摄氏度）不影响原生质体的活力，如图2所示。

原生质体在一种钙离子荧光指示剂中未表现出荧光，或该指示剂未成功加载至原生质体中。随后将Fluo-4/AM加载到原生质体后，细胞质部分出现荧光，而液泡则未产生荧光。在原生质体Fluo-4/AM加载过程中，加入了可有效阻断钙离子通道的镧系离子，其作用于细胞膜。

在100微摩尔浓度的镧离子存在下，细胞质钙离子的荧光强度显著降低。该结果进一步表明，Fluo-4/AM 能有效保留在细胞质的钙离子中，并可反映钙离子含量的动态变化。图三：使用 IMH Approved Plus 6.0 软件分析 Fluo-4/AM 实验结果，加入镧离子后，细胞质钙离子的荧光值显著下降。

在本视频中，所有原生质体均通过酶解法获得。我们成功在37摄氏度下将荧光探针导入原生质体。此外，该方法未影响原生质体的活力。

综上所述，本文所述方法较为详尽，可提供苹果果肉细胞质中钙离子动态变化的10个均等支持，从而为进一步开展钙相关研究奠定基础。