Name: 超高频超声成像分析黑色素瘤Braf/Pten基因工程小鼠模型中的淋巴结体积 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-09-08T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 18 s
Description: 学习使用超高频超声成像技术监测Braf/Pten基因工程小鼠模型中腹股沟淋巴结体积变化的方法。该技术可非侵入性地定量评估转移性黑色素瘤进展，适用于临床前药物疗效研究。

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作者谨此感谢 S. Burchielli（FTGM，比萨）在动物实验操作方面的协助。本研究由 ISPRO—Istituto per lo Studio la Prevenzione e la Rete Oncologica 提供机构经费支持，资助对象为 LP；并由 AIRC—Associazione Italiana Ricerca sul Cancro 资助，项目编号 MFAG #17095。&#160;LP

本研究所述所有方法均已获得意大利卫生部批准（动物实验方案编号：#754/2015-PR 和 #684/2018-PR）。
1. 黑色素瘤诱导
注意：本研究使用了6周龄的Tyr::CreER+,BrafCA/+,Ptenlox/lox&#160;小鼠 [B6.Cg-Braftm1Mmcm Ptentm1Hwu Tg(Tyr-cre/ERT2)13Bos/BosJ (Braf/Pten)]（参见材料表）。
<ol>
	<li>用4-羟基他莫昔芬（4-HT）处理小鼠，将3 µL浓度为5 mM的4-HT滴加至约1 cm大小区域2 上背部剃毛区域的皮肤，如先前所述11,16,17连续3天。 
	注意：这将激活 Cre 酶，导致野生型 Braf 转变为 BrafV600E，并造成 Pten 的缺失。这两个突变足以诱导黑色素瘤的形成。</li>
	<li>观察到&#160;原发性肿瘤在皮肤涂抹部位于2-3周内形成，并达到50-100 mm³的体积3 4 周时。同时，在此时间点观察其他皮肤部位、淋巴结和肺部的转移情况（t0).</li>
	<li>使用游标卡尺测量原发肿瘤及皮下转移灶的体积，采用超声成像测量腹股沟淋巴结的体积。一周后重复上述测量（t1，皮肤涂抹后5周）以及两周后（t2，皮肤涂抹后6周）。</li>
	<li>在最后一次时间点，通过过量吸入气体麻醉剂七氟烷处死小鼠。</li>
	<li>通过肉眼检查分析原发肿瘤和淋巴结，然后将其切除以进行组织学研究，如文献报道所示16.</li>
</ol>
2. 成像步骤
<ol>
	<li>将小鼠放入气体麻醉诱导室中，使用纯氧携带3%异氟烷进行麻醉，直至小鼠完全失去意识。通过脚掌夹捏无反应来确认麻醉深度。</li>
	<li>将动物转移至加热板上——该加热板为超高频超声（UHFUS）成像系统的一个组成部分——并使其保持仰卧位。使用涂有凡士林的直肠探针测量体温，并调节加热板温度，以维持小鼠体温在生理范围（36 ± 1°C）内。</li>
	<li>用兽用眼膏润湿小鼠眼睛，防止麻醉期间角膜干燥。通过小鼠鼻罩持续供给麻醉气体（1.5%异氟烷，纯氧为载体），并根据需要调整异氟烷浓度，以维持适当的麻醉深度。</li>
	<li>在前肢和后肢脚掌涂抹导电膏，并将其固定于加热板内置的ECG电极板上。检查生理参数（心率、呼吸信号及核心体温）是否被正确采集并显示。</li>
	<li>使用脱毛剂去除双侧腹股沟区域的毛发，并涂抹超声耦合介质。</li>
	<li>将UHFUS线性探头（中心频率40 MHz）安装至UHFUS成像系统中专用的三维电机上，以实现探头的自动步进式移动。</li>
	<li>正确调整超声探头的方向与位置，获取腹股沟淋巴结（左侧/右侧）的短轴图像，并将感兴趣区域置于焦点区域。</li>
	<li>按照先前所述方法18，以一系列二维B模式图像扫描整个腹股沟淋巴结体积。通过微米级步长的线性移动换能器，在多个层面采集图像，从而生成基于自动呼吸和心电门控的动态 cine 图像序列，构建三维数据。</li>
	<li>设置图像采集参数如下：扫描距离范围为2至5 mm（根据淋巴结大小而定）；步长为44 µm，每只淋巴结可获得46–114个扫描步/切片，每只动物采集时间为1–3分钟。以原始格式（DICOM）数字存储所采集图像，用于后续离线分析。</li>
	<li>成像结束后，停止气体麻醉，将动物置于加热板上呈胸卧位恢复。密切照看动物，直至其意识充分恢复，能够自主维持俯卧姿势。</li>
</ol>
3. 超声图像的后处理
<ol>
	<li>在超声图像后处理软件平台中打开左/右腹股沟淋巴结的DICOM 3D图像数据集。</li>
	<li>分割：
	<ol>
		<li>选择多切片方法，以同时显示当前帧以及3D采集过程中每幅图像对应的所有帧缩略图。</li>
		<li>选择第一帧的缩略图，将其加载至轮廓绘制视图。在轮廓绘制视图中，单击鼠标左键沿淋巴结边界放置点。当设置完所需数量的点（通常为10–15个点）后，单击鼠标右键完成轮廓绘制。</li>
		<li>完成第一个轮廓后，使用缩略图视图选择下一幅图像进行轮廓绘制。如有需要，可在轮廓之间跳过若干图像（平均间隔3帧），以减少每个3D体积所需的手动描记次数。 
		注意：超声图像后处理软件平台将自动在手动描记的轮廓之间生成插值轮廓，从而缩短分析时间。</li>
		<li>重复此过程，直至整个体积被完整勾画。完成后，点击完成。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>生成3D线框模型及体积测量：
	<ol>
		<li>在3D模式窗口工作区中，单击图像显示区域下方的体积测量图标，以激活表面视图。 
		注意：表面视图会生成一个整合视图，将用户定义的体积映射到所采集的图像上。该视图可旋转至任意所需角度。</li>
		<li>记录立方体视图左下角显示的体积测量值。 
		注意：分割及3D体积生成也可通过自行开发的软件和/或通用的免费/商业图像处理软件实现。从手动分割开始，软件应提供对淋巴结轮廓的数学或像素级描述，并将这些轮廓在三维空间中组合，以重建淋巴结的外表面。成像流程及超声图像后处理的所有步骤总结于图2中。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Schvartsman, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Management+of+metastatic+cutaneous+melanoma%3A+updates+in+clinical+practice%5BTitle%5D)+AND+%22Therapeutic+Advances+in+Medical+Oncology%22%5BJournal%5D)">Management of metastatic cutaneous melanoma: updates in clinical practice.</a> Therapeutic Advances in Medical Oncology. 11, 1758835919851663(2019).</li>
<li>Blum, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultrasound+examination+of+regional+lymph+nodes+significantly+improves+early+detection+of+locoregional+metastases+during+the+follow-up+of+patients+with+cutaneous+melanoma+-+Results+of+a+prospective+study+of+1288+patients%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer%22%5BJournal%5D)">Ultrasound examination of regional lymph nodes significantly improves early detection of locoregional metastases during the follow-up of patients with cutaneous melanoma - Results of a prospective study of 1288 patients.</a> Cancer. 88 (11), 2534-2539 (2000).</li>
<li>Olmedo, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+lymph+node+ultrasound+prior+to+sentinel+lymph+node+biopsy+in+384+patients+with+melanoma%3A+a+cost-effectiveness+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Actas+Dermo-Sifiliograficas%22%5BJournal%5D)">Use of lymph node ultrasound prior to sentinel lymph node biopsy in 384 patients with melanoma: a cost-effectiveness analysis.</a> Actas Dermo-Sifiliograficas. 108 (10), 931-938 (2017).</li>
<li>Voit, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultrasound+morphology+criteria+predict+metastatic+disease+of+the+sentinel+nodes+in+patients+with+melanoma%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Oncology%22%5BJournal%5D)">Ultrasound morphology criteria predict metastatic disease of the sentinel nodes in patients with melanoma.</a> Journal of Clinical Oncology. 28 (5), 847-852 (2010).</li>
<li>Hayes, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prospective+cohort+study+of+ultrasound+surveillance+of+regional+lymph+nodes+in+patients+with+intermediate-risk+cutaneous+melanoma%5BTitle%5D)+AND+%22British+Journal+of+Surgery%22%5BJournal%5D)">Prospective cohort study of ultrasound surveillance of regional lymph nodes in patients with intermediate-risk cutaneous melanoma.</a> British Journal of Surgery. 106 (6), 729-734 (2019).</li>
<li>Ipenburg, N. A., Thompson, J. F., Uren, R. F., Chung, D., Nieweg, O. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Focused+ultrasound+surveillance+of+lymph+nodes+following+lymphoscintigraphy+without+sentinel+node+biopsy%3A+a+useful+and+safe+strategy+in+elderly+or+frail+melanoma+patients%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+Surgical+Oncology%22%5BJournal%5D)">Focused ultrasound surveillance of lymph nodes following lymphoscintigraphy without sentinel node biopsy: a useful and safe strategy in elderly or frail melanoma patients.</a> Annals of Surgical Oncology. 26 (9), 2855-2863 (2019).</li>
<li>Jayapal, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differentiation+between+benign+and+metastatic+cervical+lymph+nodes+using+ultrasound%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Pharmacy+and+Bioallied+Sciences%22%5BJournal%5D)">Differentiation between benign and metastatic cervical lymph nodes using ultrasound.</a> Journal of Pharmacy and Bioallied Sciences. 11, Suppl 2 338-346 (2019).</li>
<li>Dankort, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Braf%28V600E%29+cooperates+with+Pten+loss+to+induce+metastatic+melanoma%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Genetics%22%5BJournal%5D)">Braf(V600E) cooperates with Pten loss to induce metastatic melanoma.</a> Nature Genetics. 41 (5), 544-552 (2009).</li>
<li>Damsky, W. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((%CE%B2-catenin+signaling+controls+metastasis+in+Braf-activated+Pten-deficient+melanomas%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell%22%5BJournal%5D)">β-catenin signaling controls metastasis in Braf-activated Pten-deficient melanomas.</a> Cancer Cell. 20 (6), 741-754 (2011).</li>
<li>Xie, X., Koh, J. Y., Price, S., White, E., Mehnert, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Atg7+overcomes+senescence+and+promotes+growth+of+BrafV600E-driven+melanoma%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Discovery%22%5BJournal%5D)">Atg7 overcomes senescence and promotes growth of BrafV600E-driven melanoma.</a> Cancer Discovery. 5 (4), 410-423 (2015).</li>
<li>Kohler, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+cutaneous+melanoma+induced+by+mutant+BRaf+arises+from+expansion+and+dedifferentiation+of+mature+pigmented+melanocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Mouse cutaneous melanoma induced by mutant BRaf arises from expansion and dedifferentiation of mature pigmented melanocytes.</a> Cell Stem Cell. 21 (5), 679-693 (2017).</li>
<li>Yuan, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phenformin+enhances+the+therapeutic+benefit+of+BRAF%28V600E%29+inhibition+in+melanoma%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Phenformin enhances the therapeutic benefit of BRAF(V600E) inhibition in melanoma.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (45), 18226-18231 (2013).</li>
<li>Marsh Durban, V., Deuker, M. M., Bosenberg, M. W., Phillips, W., McMahon, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+AKT+dependency+displayed+by+mouse+models+of+BRAFV600E-initiated+melanoma%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">Differential AKT dependency displayed by mouse models of BRAFV600E-initiated melanoma.</a> Journal of Clinical Investigation. 123 (12), 5104-5118 (2013).</li>
<li>Hooijkaas, A. I., Gadiot, J., vander Valk, M., Mooi, W. J., Blank, C. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+BRAFV600E+in+an+inducible+murine+model+of+melanoma%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Pathology%22%5BJournal%5D)">Targeting BRAFV600E in an inducible murine model of melanoma.</a> American Journal of Pathology. 181 (3), 785-794 (2012).</li>
<li>Steinberg, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BRAF+inhibition+alleviates+immune+suppression+in+murine+autochthonous+melanoma%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Immunology+Research%22%5BJournal%5D)">BRAF inhibition alleviates immune suppression in murine autochthonous melanoma.</a> Cancer Immunology Research. 2 (11), 1044-1050 (2014).</li>
<li>Vitiello, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antitumoral+effects+of+attenuated+Listeria+monocytogenes+in+a+genetically+engineered+mouse+model+of+melanoma%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">Antitumoral effects of attenuated Listeria monocytogenes in a genetically engineered mouse model of melanoma.</a> Oncogene. 38 (19), 3756-3762 (2019).</li>
<li>Moon, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Melanocyte+stem+cell+activation+and+translocation+initiate+cutaneous+melanoma+in+response+to+UV+exposure%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Melanocyte stem cell activation and translocation initiate cutaneous melanoma in response to UV exposure.</a> Cell Stem Cell. 21 (5), 665-678 (2017).</li>
<li>Zhao, L., Zhan, Y. T., Rutkowski, J. L., Feuerstein, G. Z., Wang, X. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Correlation+between+2-and+3-dimensional+assessment+of+tumor+volume+and+vascular+density+by+ultrasonography+in+a+transgenic+mouse+model+of+mammary+carcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Ultrasound+in+Medicine%22%5BJournal%5D)">Correlation between 2-and 3-dimensional assessment of tumor volume and vascular density by ultrasonography in a transgenic mouse model of mammary carcinoma.</a> Journal of Ultrasound in Medicine. 29 (4), 587-595 (2010).</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

本研究获得的数据证实了超声成像技术在监测转移性黑色素瘤Braf/Pten小鼠模型腹股沟淋巴结转移方面的应用能力。如先前研究所示16，该技术特别适用于评估药物治疗的效果，因为它能够在同一动物个体中通过比较t1和t&#160;t2时间点与t0时间点采集的测量数据，实现对淋巴结体积变化的动态监测。这种方法提高了实验结果的可靠性，因为个体间差异以及其他可能影响基础淋巴结大小的因素均已被纳入考量。此外，超声成像技术有助于遵循“3R”原则，减少每个实验组所需的动物数量。
在Braf/Pten小鼠中，不仅腹股沟淋巴结，而且臂淋巴结和腋窝淋巴结也是转移扩散的部位。然而，建议重点关注腹股沟淋巴结，因为其他淋巴结距离原发肿瘤部位过近，在原发肿瘤发展过程中通常会改变其位置和形态。或者，如果选择不同的肿瘤诱导部位（如耳朵或足垫），臂淋巴结和腋窝淋巴结可能更适合超声成像8。至于其他转移部位，由于组织中存在空气，肺部无法通过超声...

黑色素瘤是一种侵袭性皮肤癌，常扩散至其他皮肤部位（皮下转移），以及淋巴结、肺、肝、脑和骨骼1。在过去十年中，多种新药已进入临床应用，显著延长了转移性黑色素瘤患者的生存期。然而，仍存在诸多局限，包括治疗反应的时间和程度差异较大、严重不良反应以及获得性耐药的出现1。因此，至关重要的是在转移扩散的早期阶段即予以发现，即当肿瘤累及局部淋巴结时。
通常通过活检局部淋巴结（前哨淋巴结）来检测黑色素瘤细胞的存在。然而，超声成像正逐渐成为一种检测转移性受累的非侵入性方法，因其优于临床评估，有助于避免不必要的活检2,3,4。此外，超声成像似乎适用于淋巴结的长期监测，尤其是在高龄和/或合并其他疾病的情况下5,6。超声分析所检测到的可用于区分正常与转移性淋巴结的特征包括体积增大、形态由椭圆形变为圆形、边缘不规则、回声模式改变以及血流信号改变（增加）7。
Tyr::CreER+,BrafCA/+,Ptenlox/lox 基因工程小鼠（Braf/Pten 小鼠）最近已向科学界提供，作为转移性黑色素瘤的一种组织特异性且可诱导的动物模型8。在此动物模型中，原发性肿瘤发展极为迅速：在由野生型（wt）Braf 转换为 BrafV600E 并伴随 Pten 缺失的诱导后 2–3 周内即可观察到肿瘤，4 周内肿瘤体积可达 50–100 mm3。在随后的 2 周内，原发性肿瘤的生长伴随着其他皮肤部位、淋巴结和肺部转移负荷的进行性增加。
Braf/Pten 小鼠已被广泛用于多种研究目的，包括解析黑色素瘤发生过程中涉及的信号通路9,10黑色素瘤细胞起源的鉴定11,12,13以及在靶向治疗和免疫治疗方面对新治疗方案的测试8,14,15,16具体而言，我们使用了Braf/Pten小鼠来证明，其减弱的 单核细胞增生李斯特菌 (Lmat) 可作为抗黑色素瘤疫苗。在治疗性全身给药时，Lmat 不引起总体毒性，因其可选择性地在肿瘤部位富集。此外，Lmat 能显著减小原发性黑色素瘤体积，并减轻淋巴结和肺部的转移负荷。在分子水平上，Lmat 可诱导黑色素瘤细胞的凋亡性杀伤，这至少部分归因于其非细胞自主性作用，即在肿瘤局部募集 CD4+ 和 CD8+ T 淋巴细胞。16.
当使用Braf/Pten小鼠进行黑色素瘤建模时，可通过游标卡尺测量来监测原发肿瘤和皮下转移灶的生长情况。然而，对于淋巴结和肺部的受累情况，则需要采用其他技术进行检测，最好是能够对同一只动物进行长期追踪的非侵入性方法。本文介绍了超声成像技术（图1）结合后续对所获数据进行三维体积分析的方法，用于纵向监测腹股沟淋巴结体积增大的过程。

<table><tbody><tr><td>4-羟基他莫昔芬</td><td>默克</td><td>H6278</td><td>用于肿瘤诱导的药物</td></tr><tr><td>B6.Cg-Braftm1Mmcm Ptentm1Hwu Tg(Tyr-cre/ERT2)13Bos/BosJ（Braf/Pten）小鼠</td><td>杰克逊实验室</td><td>013590</td><td></td></tr><tr><td>蓝胶</td><td>Sooft Ialia</td><td></td><td>眼科凝胶溶液</td></tr><tr><td>BRAFV600E 抗体</td><td>Spring Bioscience Corporation</td><td>E19290</td><td></td></tr><tr><td>异氟烷（IsoFlo）</td><td>硕腾</td><td></td><td>用于气体麻醉的液体</td></tr><tr><td>MLANA 抗体</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>M2-7C10</td><td></td></tr><tr><td>Sigma 凝胶</td><td>Parker</td><td></td><td>电极凝胶</td></tr><tr><td>透声凝胶透明</td><td>Telic SAU</td><td></td><td>超声耦合剂</td></tr><tr><td>Veet</td><td>Reckitt Benckiser IT</td><td></td><td>脱毛膏</td></tr><tr><td>紧凑型双麻醉系统</td><td>富士胶片，Visualsonics 公司</td><td></td><td>配备鼻罩和诱导室的异氟烷麻醉系统</td></tr><tr><td>MX550S</td><td>富士胶片，Visualsonics 公司</td><td></td><td>UHFUS 线性探头</td></tr><tr><td>Vevo 3100</td><td>富士胶片，Visualsonics 公司</td><td></td><td>UHFUS 系统</td></tr><tr><td>Vevo 成像系统</td><td>富士胶片，Visualsonics 公司</td><td></td><td>UHFUS成像工作站及配备加热板的生理监测进展单元</td></tr><tr><td>Vevo Lab</td><td>富士胶片，Visualsonics 公司</td><td></td><td>超声图像后处理软件平台</td></tr></tbody></table>

通过超高频超声成像分析braf/pten基因工程小鼠黑色素瘤模型中的淋巴结体积

Analysis of Lymph Node Volume by Ultra-High-Frequency Ultrasound Imaging in the Braf/Pten Genetically Engineered Mouse Model of Melanoma

Tyr::CreER+,BrafCA/+,Ptenlox/lox&#160;基因工程小鼠（Braf/Pten 小鼠）被广泛用作转移性黑色素瘤的体内模型。经他莫昔芬处理诱导原发肿瘤后，可在诱导后4至6周内观察到转移负荷的增加。本文展示了如何利用超高频超声（UHFUS）成像技术，通过测量腹股沟淋巴结体积的增加，来监测其转移累及程度的进展。
使用UHFUS系统对麻醉小鼠进行扫描，采用UHFUS线性探头（22-55 MHz，轴向分辨率为40 µm）。将动物置于仰卧位，以短轴视图采集腹股沟淋巴结（左右两侧）的B模式图像。通过电机驱动的机械臂以44 µm的步长采集超声图像记录。随后，将二维（2D）B模式图像导入超声图像后处理软件平台，在获取的二维横截面图像中对腹股沟淋巴结进行半自动识别与分割。最终，系统自动完成三维（3D）体积的完整重建，并生成淋巴结体积的三维渲染图像，同时以绝对测量值形式输出体积数据。
这种非侵入性的体内技术耐受性良好，允许在2周内对同一实验动物进行多次成像扫描。因此，它非常适合用于评估药物治疗对转移性疾病的影响。

在对 Tyr::CreER+,BrafCA/+,Ptenlox/lox 小鼠皮肤涂抹 4-HT 后，Cre 活性被诱导，从而在基因组水平上发生由野生型 Braf 向 BrafV600E 的转换，同时 Pten 基因丢失（图 3A）。2 至 3 周内，小鼠原位出现原发性肿瘤，外显率为 100%。在 4-HT 处理后第 4 周（t0），原发性肿瘤体积达到 50–100 mm3，此后可继续使用游标卡尺测量其生长情况，持续约 2 周（t1 和 t2；图 3B，上图）。由于肿瘤体积过大，后续时间点无法继续观察，小鼠需实施安乐死。
就转移负荷而言，在给予4-HT处理后4至6周内，腹股沟淋巴结中的色素沉着呈逐渐增加的趋势（图3B，下排图）。这种色素沉着的...

黑色素瘤是一种极具侵袭性的疾病，会迅速扩散至其他器官。本方案描述了超高频超声成像结合三维重建技术的应用，用于监测转移性黑色素瘤Braf/Pten小鼠模型中腹股沟淋巴结体积的变化。

通过超高频超声成像分析Braf/Pten基因工程小鼠黑色素瘤模型中的淋巴结体积

Tyr::CreER+、BrafCA/+、Ptenlox/lox 基因工程小鼠（Braf/Pten 小鼠）被广泛用作转移性黑色素瘤的体内模型。一旦……

本方法通过测量腹股沟淋巴结体积的增加，实现对其转移性累及程度的监测。该方法无创且耐受性良好，因此可在两周时间内对同一实验动物安排多次影像学检查。该方法适用于评估药物治疗对转移性疾病的影响。我们将该方法应用于Braf/Pten黑色素瘤模型，但原则上，该方法可适用于多种转移性癌症的临床前小鼠模型，以评估不同药物的疗效。本次实验操作由本实验室的博士后Marianna Vitiello博士和IFC-CNR的研究员Claudia Kusmic博士进行演示。诱导黑色素瘤时，连续三天，每天在上背部约一平方厘米的去毛皮肤区域涂抹三微升（3 µL）五毫摩尔（5 mM）的4-羟基他莫昔芬。皮肤涂抹六周后，使用卡尺测量原发肿瘤的体积，随后测量皮下转移灶的体积。然后，通过超声成像测量腹股沟淋巴结的体积。在通过肉眼观察分析原发肿瘤和淋巴结后，将其切除以进行组织学研究。确认麻醉成功后，将动物转移至超高频超声成像仪的加热板上，保持动物仰卧位。使用涂有凡士林的直肠探针监测并调节加热板温度，以维持小鼠体温在生理范围内。在前肢和后肢足垫涂抹导电膏，并用胶带将其固定于嵌入加热板内的心电图电极板上。检查生理参数是否已正确采集并显示。使用脱毛剂去除双侧腹股沟区域的毛发，并涂上声耦合介质。然后，将超高频超声线阵探头固定在成像系统中专用的三维电机上，以实现探头的自动步进式移动。正确调整超声探头的方向和位置，以获取腹股沟淋巴结的短轴切面图像，并将感兴趣区域置于焦点区。设置扫描距离为2至5毫米，步长为44微米，每张淋巴结切片的扫描步数为46至114步，每只动物的采集时间为1至3分钟。通过换能器以微米级步长进行线性移动，将腹股沟淋巴结的整个体积作为一系列二维B模式图像进行扫描，采集多个层面的图像，从而基于呼吸和心电门控电影回路生成三维数据。成像后，以原始格式对采集的图像进行数字存储，以便后续离线分析。对于超声图像的后处理，打开腹股沟淋巴结三维图像的数据集，选择多切片方法，然后按下“开始”按钮，以同时显示当前帧以及三维采集过程中所获取每幅图像对应的所有帧缩略图。选择第一个能够清晰显示淋巴结的帧缩略图，将其加载至轮廓绘制视图中。在勾画视图中，用鼠标左键沿淋巴结边界点击以放置点。设置完所需的点数后，单击鼠标右键完成轮廓勾画。完成第一个轮廓后，使用缩略图视图选择下一张图像进行勾画。如有需要，可在轮廓之间跳过若干图像，以减少每个三维体积所需的手动描记次数。重复此过程，直至完成整个体积的勾画，然后点击“完成”。在三维模式窗口工作区中，单击图像显示区域下方的体积测量图标，以查看淋巴结体积的数值，并激活淋巴结体积的三维渲染表面视图。使用4-羟基他莫昔芬处理小鼠可诱导CreER酶活性，导致基因组水平上Braf基因从野生型转变为突变型Braf V600E，同时Pten基因丢失。在4-羟基他莫昔芬处理后四周，原发肿瘤体积达到50至100立方毫米，此后可继续使用游标卡尺测量其生长情况，持续两周。在此期间，可观察到腹股沟淋巴结中色素沉着逐渐增加。黑色素沉积 invariably 由转移性黑色素瘤细胞引起，经黑色素瘤抗原MelanA和Braf V600E的免疫组织化学染色证实。 在分割阶段结束时，所有切面均显示了淋巴结外部轮廓的叠加结果。此处展示了同一只动物在4-HT处理后四周、五周和六周时右侧腹股沟淋巴结的三维重建图像。同时，还对同一只动物左右两侧腹股沟淋巴结随时间推移的体积增加进行了定量分析。建议将超声成像与适当的免疫组织化学染色相结合，以在分子水平上确认癌细胞的存在。除了淋巴结外，皮下转移灶的体积也可通过超声成像进行长期监测。如果两周的时间过短，难以观察到所研究药物的效果，可选择更外周的诱导位点或肿瘤易感性较低的基因型。

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