通过超高频超声成像分析Braf/Pten基因工程小鼠黑色素瘤模型中的淋巴结体积

本方法通过测量腹股沟淋巴结体积的增加，实现对其转移性累及程度的监测。该方法无创且耐受性良好，因此可在两周时间内对同一实验动物安排多次影像学检查。该方法适用于评估药物治疗对转移性疾病的影响。

我们将该方法应用于Braf/Pten黑色素瘤模型，但原则上，该方法可适用于多种转移性癌症的临床前小鼠模型，以评估不同药物的疗效。本次实验操作由本实验室的博士后Marianna Vitiello博士和IFC-CNR的研究员Claudia Kusmic博士进行演示。诱导黑色素瘤时，连续三天，每天在上背部约一平方厘米的去毛皮肤区域涂抹三微升（3 µL）五毫摩尔（5 mM）的4-羟基他莫昔芬。

皮肤涂抹六周后，使用卡尺测量原发肿瘤的体积，随后测量皮下转移灶的体积。然后，通过超声成像测量腹股沟淋巴结的体积。在通过肉眼观察分析原发肿瘤和淋巴结后，将其切除以进行组织学研究。

确认麻醉成功后，将动物转移至超高频超声成像仪的加热板上，保持动物仰卧位。使用涂有凡士林的直肠探针监测并调节加热板温度，以维持小鼠体温在生理范围内。在前肢和后肢足垫涂抹导电膏，并用胶带将其固定于嵌入加热板内的心电图电极板上。

检查生理参数是否已正确采集并显示。使用脱毛剂去除双侧腹股沟区域的毛发，并涂上声耦合介质。然后，将超高频超声线阵探头固定在成像系统中专用的三维电机上，以实现探头的自动步进式移动。

正确调整超声探头的方向和位置，以获取腹股沟淋巴结的短轴切面图像，并将感兴趣区域置于焦点区。设置扫描距离为2至5毫米，步长为44微米，每张淋巴结切片的扫描步数为46至114步，每只动物的采集时间为1至3分钟。通过换能器以微米级步长进行线性移动，将腹股沟淋巴结的整个体积作为一系列二维B模式图像进行扫描，采集多个层面的图像，从而基于呼吸和心电门控电影回路生成三维数据。

成像后，以原始格式对采集的图像进行数字存储，以便后续离线分析。对于超声图像的后处理，打开腹股沟淋巴结三维图像的数据集，选择多切片方法，然后按下“开始”按钮，以同时显示当前帧以及三维采集过程中所获取每幅图像对应的所有帧缩略图。选择第一个能够清晰显示淋巴结的帧缩略图，将其加载至轮廓绘制视图中。

在勾画视图中，用鼠标左键沿淋巴结边界点击以放置点。设置完所需的点数后，单击鼠标右键完成轮廓勾画。完成第一个轮廓后，使用缩略图视图选择下一张图像进行勾画。

如有需要，可在轮廓之间跳过若干图像，以减少每个三维体积所需的手动描记次数。重复此过程，直至完成整个体积的勾画，然后点击“完成”。在三维模式窗口工作区中，单击图像显示区域下方的体积测量图标，以查看淋巴结体积的数值，并激活淋巴结体积的三维渲染表面视图。

使用4-羟基他莫昔芬处理小鼠可诱导CreER酶活性，导致基因组水平上Braf基因从野生型转变为突变型Braf V600E，同时Pten基因丢失。在4-羟基他莫昔芬处理后四周，原发肿瘤体积达到50至100立方毫米，此后可继续使用游标卡尺测量其生长情况，持续两周。在此期间，可观察到腹股沟淋巴结中色素沉着逐渐增加。黑色素沉积 invariably 由转移性黑色素瘤细胞引起，经黑色素瘤抗原MelanA和Braf V600E的免疫组织化学染色证实。

在分割阶段结束时，所有切面均显示了淋巴结外部轮廓的叠加结果。此处展示了同一只动物在4-HT处理后四周、五周和六周时右侧腹股沟淋巴结的三维重建图像。同时，还对同一只动物左右两侧腹股沟淋巴结随时间推移的体积增加进行了定量分析。

建议将超声成像与适当的免疫组织化学染色相结合，以在分子水平上确认癌细胞的存在。除了淋巴结外，皮下转移灶的体积也可通过超声成像进行长期监测。如果两周的时间过短，难以观察到所研究药物的效果，可选择更外周的诱导位点或肿瘤易感性较低的基因型。