Name: RNA 测序的三种微分表达分析方法:利马、边缘、DESeq2 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-09-18T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 10 s
Description: 学习使用limma、EdgeR和DESeq2三种R包进行RNA测序差异表达分析的方法。本方案以胆管癌数据为例，演示从数据下载、预处理到差异基因筛选和可视化的完整生物信息学分析流程。

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本研究得到了&#8194;国家&#8194;自然&#8194;科学&#8194;基础&#8194;的&#8194;中国&#8194;（资助&#8194;No. 81860276）和国家重点研发计划重点专项基金项目&amp;#38;D 计划（资助）&#8194;No. 2018YFC1003200）

注意：打开 R-studio 程序并加载 R 文件 &#34;DEGs.R&#34;，该文件可从补充文件/脚本中获取。
1. 数据下载与预处理
<ol>
	<li>从癌症基因组图谱（The Cancer Genome Atlas, TCGA）下载胆管癌（cholangiocarcinoma, CHOL）的高通量测序（HTSeq）计数数据。此步骤可通过以下 R 代码轻松实现。
	<ol>
		<li>点击 运行 以安装 R 软件包。</li>
		<li>点击 运行 以加载 R 软件包。 
		if(!requireNamespace(&#34;BiocManager&#34;, quietly=TRUE)) 
		&#160;+ install.packages(&#34;BiocManager&#34;) 
		BiocManager::install(c(&#34;TCGAbiolinks&#34;, &#34;SummarizedExperiment&#34;))</li>
		<li>设置工作目录。 
		library (TCGAbiolinks) 
		library(SummarizedExperiment) 
		setwd(&#34;C:/Users/LIUSHIYI/Desktop&#34;)</li>
		<li>选择癌症类型。 
		cancer &#60;- &#34;TCGA-CHOL&#34;</li>
		<li>运行来自 &#34;GDCquery.R&#34; 文件的 R 代码以下载数据。文件 &#34;GDCquery.R&#34; 可从补充文件/脚本中获取： 
		source(&#34;Supplementary files/Scripts/GDCquery.R&#34;) 
		head(cnt) 
		##TCGA-3X-AAVA-01A-11R-A41I-07 
		##ENSG00000000003 4262 
		##ENSG00000000005 1 
		##ENSG00000000419 1254 
		##ENSG00000000457 699 
		##ENSG00000000460 239 
		##ENSG00000000938 334 
		注：执行后，CHOL HTSeq 计数数据将被下载并命名为 &#34;cnt&#34;，其中行代表 ensemble 基因 ID，列代表样本 ID。请注意样本 ID 中第 14 至 15 位的数字；数字 01 至 09 表示肿瘤组织，10 至 19 表示正常组织。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将 ensemble 基因 ID 转换为基因符号。
	<ol>
		<li>根据注释文件的存储路径将其导入 R。注释文件（gencode.v22.annotation.gtf）可从补充文件中获取。 
		&#8203;gtf_v22 &#60;- rtracklayer::import('Supplementary files/gencode.v22.annotation.gtf')</li>
		<li>运行来自 &#34;gtf_v22.R&#34; 文件的 R 代码，该文件可从补充文件/脚本中获取： 
		source(&#34;Supplementary files/Scripts/gtf_v22.R&#34;)</li>
		<li>应用函数 &#34;ann&#34; 将 ensemble 基因 ID 转换为基因符号。 
		cnt=ann(cnt,gtf_v22)</li>
	</ol>
	</li>
	<li>过滤低表达基因
	<ol>
		<li>点击 运行 以安装 R 软件包 &#34;edgeR&#34;。 
		&#8203;BiocManager::install(&#34;edgeR&#34;)</li>
		<li>点击 运行 以加载 R 软件包 &#34;edgeR&#34;。 
		&#8203;library(edgeR)</li>
		<li>运行以下 R 代码，保留至少在两个样本中每百万计数（counts per million, CPM）值大于 1 的基因。 
		keep &#60;- rowSums(cpm(cnt)&#62;1)&#62;=2 
		cnt &#60;- as.matrix(cnt[keep,]) 
		&#8203;注：使用每百万计数（CPM）值而非原始读段计数，以消除因测序深度不同而引起的偏差。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 通过 &#34;limma&#34; 进行差异表达分析
<ol>
	<li>点击 运行 安装 R 软件包 &#34;limma&#34;. 
	BiocManager::install(&#34;limma&#34;)</li>
	<li>点击 运行 加载 R 包 &#34;limma&#34;, &#34;edgeR&#34;. 
	library(limma) 
	library(edgeR)</li>
	<li>运行以下 R 代码以创建设计矩阵。 
	组 &#60;- substring(colnames(cnt), 14, 15) # 提取分组信息 
	组 [组 %in% &#34;01&#34;] &#60;- &#34;癌症&#34; # 将“01”设为肿瘤组织 
	组 [组 %in% &#34;11&#34;] &#60;- &#34;正常&#34; # 将“11”设为正常组织 
	&#8203;组 &#60;- 因子（组，水平 = c(&#34;正常&#34;,&#34;癌症&#34;))
	<ol>
		<li>创建设计矩阵。 
		设计 &#60;- model.matrix (~组别) 
		design 的行名 &#60;- colnames(cnt)</li>
		<li>创建 DGEList 对象。 
		dge &#60;- DGEList(counts = cnt, group = group)</li>
		<li>对数据进行归一化处理。 
		dge &#60;- calcNormFactors(dge, method = &#34;TMM&#34;)</li>
		<li>运行以下 R 代码，以执行基于 limma-trend 方法的差异表达分析。 
		dge 
		## 一个类的对象 &#34;DGEList&#34; 
		##$counts 
		##TCGA-3X-AAVA-01A-11R-A41I-07 
		##TSPAN6 4262 
		##DPM1 1254 
		##SCYL3 699 
		##C1orf112 239 
		##&#8203;FGR 334</li>
		<li>计算每分钟计数（CPM）值。 
		&#8203;lodge &#60;- cpm(dge, log=TRUE, prior.count=3)</li>
		<li>点击 运行 拟合线性模型以预测数据或推断变量之间的关系。 
		合适 &#60;- lmFit（logdge，design）</li>
		<li>基于贝叶斯方法计算 T 值、F 值和对数优势比。 
		合适 &#60;- eBayes(fit, trend=TRUE)</li>
		<li>提取结果表格。 
		res_limma&#60;- as.data.frame(topTable(fit, n=Inf)) 
		 
		head(res_limma) 
		## logFC AveExpr t P值 adj.P值 B 
		##RP11-252E2.2 -4.899493 -2.488589 -20.88052 2.386656e-25 4.931786e-21 47.28823 
		##BX842568.1 -4.347930 -2.595205 -20.14532 1.082759e-24 1.118706e-20 45.83656 
		##CTC-537E7.3 -5.154894 -2.143292 -19.59571 3.452354e-24 2.216114e-20 44.72001 
		##RP11-468N14.3 -6.532259 -2.029714 -19.49409 4.289807e-24 2.216114e-20 44.51056 
		##AP006216.5 -4.507051 -2.670915 -19.25649 7.153356e-24 2.956339e-20 44.01704 
		##RP11-669E14.4 -4.107204 -2.828311 -18.93246 1.448209e-23 4.987633e-20 43.33543 
		#差异表达分析的结果保存在 &#34;res_limma&#34;，包括基因编号（gene id）、log2 倍数变化值（logFC）、基因在实验中的平均 log2 表达水平（AveExpr）、修正的 t 统计量（t）、相应的 p 值（P.Value）、经错误发现率校正的 p 值（adj.P.Val）以及差异表达基因的 log-odds 值（B） 
		&#8203;注意：该功能 &#34;calcNormFactors()&#34; 的 &#34;edgeR&#34; 用于对数据进行标准化，以消除样本制备、文库构建及测序过程带来的影响。在设计矩阵构建过程中，需将实验设计（例如：组织类型：正常或肿瘤组织）与矩阵中的样本编号相对应。limma-trend 适用于测序深度相同的数据，而 limma-voom 适用于以下情况：（i）样本文库大小不同；（ii）未使用 TMM 方法进行标准化的数据；（iii）数据量较大 &#34;噪声&#34; 在数据中，正值的logFC表示该基因在实验中上调，而负值则表示该基因下调。</li>
		<li>鉴定差异表达基因。 
		res_limma$sig &#60;- 作为因子( 
		&#160;ifelse(res_limma$adj.P.Val &#60; 0.05 &amp;#38; abs(res_limma$logFC) &#62; 2, 
		&#160; &#160;ifelse(res_limma$logFC &#62; 2 ，'up'，'down'），'not'） # 调整后的 p 值 &#60; 0.05 和 |log2FC| &#62;= 2 是用于鉴定差异表达基因的阈值 
		summary(res_limma$.sig) 
		##向下而非向上 
		##1880 &#8203;17341 1443</li>
		<li>将结果表格输出到文件中。 
		write.csv(res_limma, file = 'result_limma.csv')</li>
		<li>点击 运行 安装 R 软件包 &#34;ggplot2&#34;. 
		install.packages(&#34;ggplot2&#34;)</li>
		<li>点击 运行 加载 R 包 &#34;ggplot2&#34;. 
		library(ggplot2)</li>
		<li>运行以下 R 代码： &#34;volcano.R&#34; 以生成火山图。该文件 &#34;volcano.R&#34; 可从补充文件中获取。 
		来源&#34;补充文件/脚本/volcano.R&#34;) 
		火山图（res_limma，&#34;logFC&#34;,&#34;adj.P.Val&#34;,2,0.05) 
		注意：基因可根据其log2FC和adj-p值被映射到不同位置，上调的差异表达基因以红色标出，下调的差异表达基因以绿色标出。</li>
		<li>点击 导出 保存火山图。 
		&#8203;注意：火山图可以以不同格式（如 pdf、TIFF、PNG、JPEG 格式）生成并下载。基因可根据其 log2FC 和 adj 值映射到不同位置 p 值，上调的差异表达基因（log2FC &#62; 2，调整 p &#60; 0.05）以红色标出，下调的差异表达基因（log2FC &#60; -2，调整 p &#60; 0.05）的基因用绿色表示，非差异表达基因用灰色表示。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. 通过 &#34;edgeR&#34; 进行差异表达分析
<ol>
	<li>点击 运行 加载 R 包 &#34;edgeR&#34;. 
	library(edgeR)</li>
	<li>运行以下 R 代码以创建设计矩阵。 
	组 &#60;-substring(colnames(cnt), 14, 15) 
	组 [group %in% &#34;01&#34;] &#60;- &#34;癌症&#34; 
	组 [组 %in% &#34;11&#34;] &#60;- &#34;正常&#34; 
	group=factor(group, levels = c(&#34;正常&#34;,&#34;癌症&#34;)) 
	设计 &#60;-model.matrix(~组别) 
	design 的行名 = cnt 的列名</li>
	<li>点击 运行 创建 DGEList 对象。 
	dge &#60;- DGEList(counts=cnt)</li>
	<li>对数据进行归一化处理。 
	dge &#60;- calcNormFactors(dge, method = &#34;TMM&#34;)</li>
	<li>点击 运行 用于估计基因表达值的离散程度。 
	dge &#60;- estimateDisp(dge, design, robust = T)</li>
	<li>点击 运行 将模型拟合到计数数据。 
	合适 &#60;- glmQLFit(dge, design)</li>
	<li>进行统计检验。 
	合适 &#60;- glmQLFTest(fit)</li>
	<li>提取结果表格。结果已保存在 &#34;res_edgeR&#34;，包括对数倍数变化值、对数每百万计数（log CPM）、F值、p值和FDR校正后的p值。 
	res_edgeR = as.data.frame(topTags(fit, n = Inf)) 
	head(res_edgeR) 
	## logFC logCPM F P值 FDR 
	##GCDH -3.299633 5.802700 458.5991 1.441773e-25 2.979280e-21 
	##MSMO1 -3.761400 7.521111 407.0416 1.730539e-24 1.787993e-20R 
	##CL1 -3.829504 5.319641 376.5043 8.652474e-24 5.516791e-20 
	##ADI1 -3.533664 8.211281 372.6671 1.067904e-23 5.516791e-20 
	##KCNN2 -5.583794 3.504017 358.6525 2.342106e-23 9.679455e-20 
	##GLUD1 -3.287447 8.738080 350.0344 3.848408e-23 1.194406e-19 
	#结果保存在 &#34;res_edgeR&#34;，包括对数倍数变化值（logFC）、对数每百万计数（log CPM）、F 值、p 值以及经 FDR 校正的 p 值</li>
	<li>鉴定差异表达基因。 
	res_edgeR$sig = as.factor( 
	ifelse(res_edgeR$FDR &#60; 0.05 &amp;#38; abs(res_edgeR$logFC) &#62; 2, 
	ifelse(res_edgeR$logFC &#62; 2 ，“上”，“下”），“否”） 
	summary(res_edgeR$sig) 
	##向下而非向上 
	##1578 15965 3121</li>
	<li>将结果表格输出到文件中。 
	write.csv(res_edgeR, file = 'res_edgeR.csv')</li>
	<li>创建火山图。 
	火山图（res_edgeR，&#34;logFC&#34;,&#34;错误发现率&#34;,2,0.05)</li>
	<li>点击 导出 保存火山图。</li>
</ol>
4. 通过 &#34;DESeq2&#34; 进行差异表达分析
<ol>
	<li>点击 运行 安装 R 包 &#34;DESeq2&#34;. 
	BiocManager::install(&#34;DESeq2&#34;)</li>
	<li>点击 运行 加载 R 包 &#34;DESeq2&#34;. 
	library(DESeq2)</li>
	<li>运行以下 R 代码以确定分组因子。 
	组 &#60;-substring(colnames(cnt), 14, 15) 
	组 [group %in% &#34;01&#34;] &#60;- &#34;癌症&#34; 
	组 [group %in% &#34;11&#34;] &#60;- &#34;正常&#34; 
	group=因子(group, 水平 = c(&#34;正常&#34;,&#34;癌症&#34;))</li>
	<li>创建 DESeqDataSet 对象。 
	dds &#60;-DESeqDataSetFromMatrix（cnt，DataFrame（group），design = ~group） 
	dds 
	##class: DESeqDataSet 
	##dim: 20664 45 
	##元数据(1)：版本 
	##检测(1)：计数 
	##行名(20664): TSPAN6 DPM1 ... RP11-274B21.13 LINC01144 
	##rowData 名称(0)： 
	##列名(45)：TCGA-3X-AAVA-01A-11R-A41I-07 ... 
	##colData 名称（1）：group</li>
	<li>执行分析。 
	dds &#60;- DESeq(dds)</li>
	<li>生成结果表格。 
	res_DESeq2 &#60;- data.frame(results(dds)) 
	 
	head(res_DESeq2) 
	## 基因平均表达量 log2倍数变化 lfcSE 统计量 p值 padj 
	##TSPAN6 4704.9243 -0.8204515 0.3371667 -2.433370 1.495899e-02 2.760180e-02 
	##DPM1 1205.9087 -0.3692497 0.1202418 -3.070894 2.134191e-03 4.838281e-03 
	##SCYL3 954.9772 0.2652530 0.2476441 1.071106 2.841218e-01 3.629059e-01 
	##C1orf112 277.7756 0.7536911 0.2518929 2.992109 2.770575e-03 6.101584e-03 
	##FGR 345.8789 -0.6423198 0.3712729 -1.730047 8.362180e-02 1.266833e-01 
	##CFH 27982.3546 -3.8761382 0.5473363 -7.081823 1.422708e-12 1.673241e-11 
	注意：结果将保存在 &#34;res_DESeq2&#34;，包括标准化读数计数的均值（baseMean）、对数倍数变化值（log2FoldChange）、对数倍数变化的标准误（lfcSE）、沃尔德统计量（stat）、原始 p 值（pvalue）和校正后 p 值（padj）</li>
	<li>鉴定差异表达基因。 
	res_DESeq2$sig = as.factor( 
	&#160;ifelse(res_DESeq2$padj &#60; 0.05 &amp;#38; abs(res_DESeq2$log2FoldChange) &#62; 2, 
	&#160; &#160;ifelse(res_DESeq2$log2FoldChange &#62; 2，“上”，“下”），“否”） 
	summary(res_DESeq2$sig) 
	##向下而非向上 
	##1616 16110 2938</li>
	<li>将结果表格输出到文件中。 
	write.csv(res_DESeq2, file = 'res_DESeq2.csv')</li>
	<li>创建火山图。 
	火山图（res_DESeq2，&#34;log2倍数变化&#34;,&#34;padj&#34;,2,0.05)</li>
	<li>点击 导出 保存火山图。</li>
</ol>
5. 维恩图
<ol>
	<li>点击 Run 以安装 R 软件包 &#34;VennDiagram&#34;。 
	install.packages(&#34;VennDiagram&#34;)</li>
	<li>点击 Run 以加载 R 软件包 &#34;VennDiagram&#34;。 
	library (VennDiagram)</li>
	<li>绘制上调差异表达基因（DEGs）的维恩图。 
	grid.newpage() 
	grid.draw(venn.diagram(list(Limma=rownames(res_ 
	limma[res_limma$sig==&#34;up&#34;,]), 
	&#160; edgeR=rownames(res_edgeR[res_edgeR$sig==&#34;up&#34;,]), 
	&#160; DESeq2=rownames(res_DESeq2[res_DESeq2$sig== 
	&#160; &#34;up&#34;,])), 
	&#160;NULL,height = 3,width = 3,units = &#34;in&#34;, 
	&#160;col=&#34;black&#34;,lwd=0.3,fill=c(&#34;#FF6666&#34;,&#34;#FFFF00&#34;, 
	 "#993366&#34;), 
	&#160;alpha=c(0.5, 0.5, 0.5),main = &#34;上调差异表达基因（DEGs）&#34;))</li>
	<li>点击 Export 以保存维恩图。</li>
	<li>绘制下调差异表达基因（DEGs）的维恩图。 
	grid.newpage() 
	grid.draw(venn.diagram(list(Limma=rownames(res_ 
	limma[res_limma$sig==&#34;down&#34;,]), 
	&#160; &#160;edgeR=rownames(res_edgeR[res_edgeR$sig== 
	&#34;down&#34;,]), 
	&#160; &#160;DESeq2=rownames(res_DESeq2[res_DESeq2$sig==&#34;down&#34;,])), 
	&#160;NULL,height = 3,width = 3,units = &#34;in&#34;, 
	&#160;col=&#34;black&#34;,lwd=0.3,fill=c(&#34;#FF6666&#34;,&#34;#FFFF00&#34;, 
	&#34;#993366&#34;), 
	&#160;alpha=c(0.5, 0.5, 0.5),main = &#34;下调差异表达基因（DEGs）&#34;))</li>
	<li>点击 Export 以保存维恩图。</li>
</ol>

<ol><li>Tambonis, T., Boareto, M., Leite, V. B. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+Expression+Analysis+in+RNA-seq+Data+Using+a+Geometric+Approach%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Computational+Biology%22%5BJournal%5D)">Differential Expression Analysis in RNA-seq Data Using a Geometric Approach.</a> Journal of Computational Biology. 25, 1257-1265 (2018).</li>
<li>Wang, Z., Gerstein, M., Snyder, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA-Seq%3A+a+revolutionary+tool+for+transcriptomics%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews.+Genetics%22%5BJournal%5D)">RNA-Seq: a revolutionary tool for transcriptomics.</a> Nature Reviews. Genetics. 10, 57-63 (2009).</li>
<li>Anders, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Count-based+differential+expression+analysis+of+RNA+sequencing+data+using+R+and+Bioconductor%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Count-based differential expression analysis of RNA sequencing data using R and Bioconductor.</a> Nature Protocols. 8, 1765-1786 (2013).</li>
<li>McDermaid, A., Monier, B., Zhao, J., Liu, B., Ma, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interpretation+of+differential+gene+expression+results+of+RNA-seq+data%3A+review+and+integration%5BTitle%5D)+AND+%22Briefings+in+Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">Interpretation of differential gene expression results of RNA-seq data: review and integration.</a> Briefings in Bioinformatics. 20, 2044-2054 (2019).</li>
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该稿件此前未发表过，也未在其他地方考虑发表。所有作者均对本稿件的重要知识内容做出了贡献，并已阅读和批准最终稿件。我们声明不存在利益冲突。

通过RNA-seq差异分析可轻松识别癌症中大量异常转录本5。然而，RNA-seq差异表达分析的应用常受到限制，因其需要掌握R语言技能并具备选择合适方法的能力。为解决这一问题，本文详细介绍了三种最常用的方法（limma、EdgeR和DESeq2），并提供了应用RNA-seq差异表达分析的教程。这将有助于理解三种方法之间的异同，帮助研究者为自身数据选择合适的方法，并深入理解复杂的动态生物学过程。
本文介绍了一种通过limma、edgeR和DESeq2分别进行RNA-seq差异表达分析的详细实验方案，共分为五个阶段：（i）数据的下载与预处理，（ii）-（iv）分别使用limma、edgeR和DESeq2进行差异表达分析，（v）通过维恩图比较这三种方法的分析结果。
这三种方法在差异表达分析过程中既有相似之处，也有不同的步骤。limma 使用线性模型进行统计，适用于所有基因表达技术，包括微阵列、RNA-seq 和定量 PCR8,</...

RNA测序（RNA-seq）是转录组学中最广泛使用的技术之一，具有诸多优势（例如，数据可重复性高），并极大地加深了我们对复杂生物过程功能与动态的理解1,2。在不同生物学背景下识别异常转录本（也称为差异表达基因，DEGs）是RNA-seq分析中的关键步骤。RNA-seq使得深入理解与发病机制相关的分子机制和生物学功能成为可能。因此，差异分析被认为在肿瘤的诊断、预后评估和治疗中具有重要价值3,4,5。目前，已有越来越多的开源R/Bioconductor软件包被开发用于RNA-seq差异表达分析，尤其是limma、DESeq2和EdgeR1,6,7。然而，差异分析需要掌握一定的R语言技能以及选择合适方法的能力，而这些内容在医学教育课程中尚属欠缺。
本方案基于从癌症基因组图谱（The Cancer Genome Atlas, TCGA）提取的胆管癌（CHOL）RNA-seq 计数数据，分别使用R程序11执行三种最常用的方法（limma8、EdgeR9 和 DESeq210），以鉴定CHOL组织与正常组织之间的差异表达基因（DEGs）。limma、EdgeR 和 DESeq2 的三个分析流程相似，但在分析过程的具体步骤上存在差异。例如，EdgeR 和 limma8, 9 需要对RNA-seq计数数据进行标准化处理，而DESeq2则利用其自身的文库差异校正方法，无需预先标准化10。此外，edgeR 特别适用于RNA-seq数据，而limma则可用于微阵列和RNA-seq数据。limma采用线性模型评估差异表达基因12，而edgeR的统计方法基于负二项分布，包括经验贝叶斯估计、精确检验、广义线性模型和拟似然检验9。
综上所述，我们分别提供了使用limma、DESeq2和EdgeR进行RNA-seq差异表达分析的详细实验方案。通过参考本文，用户可轻松完成RNA-seq差异分析，并为其数据选择合适的差异分析方法。

<table><tbody><tr><td>R</td><td></td><td>版本 3.6.2</td><td>免费软件</td></tr><tr><td>Rstudio</td><td></td><td></td><td>免费软件</td></tr></tbody></table>

三种用于rna测序的差异表达分析方法：limma、edger、deseq2

Three Differential Expression Analysis Methods for RNA Sequencing: limma, EdgeR, DESeq2

RNA测序（RNA-seq）是转录组学中最广泛使用的技术之一，能够揭示基因改变与复杂生物学过程之间的关系，在肿瘤的诊断、预后评估和治疗中具有重要价值。RNA-seq数据的差异分析对于识别异常转录至关重要，limma、EdgeR和DESeq2是进行差异分析的有效工具。然而，RNA-seq差异分析需要掌握一定的R语言技能以及选择合适方法的能力，而这些内容在医学教育课程中尚属欠缺。
本文提供了利用 limma、DESeq2 和 EdgeR 分别鉴定胆管癌（CHOL）与正常组织之间差异表达基因（DEGs）的详细实验方案，结果以火山图和维恩图展示。limma、DESeq2 和 EdgeR 这三种分析流程总体相似，但在分析过程的具体步骤上存在差异。例如，limma 采用线性模型进行统计分析，而 edgeR 和 DESeq2 则使用负二项分布模型。此外，EdgeR 和 limma 需要输入经标准化的 RNA-seq 计数数据，而 DESeq2 则无需预先标准化的数据。
本文提供了三种差异分析方法（limma、EdgeR 和 DESeq2）的详细实验方案。这三种方法的分析结果部分重叠。每种方法均有其优势，方法的选择仅取决于具体的数据情况。

可视化差异表达分析结果的方法有多种，其中火山图和维恩图尤为常用。limma 以 |logFC|≥2 且 adj.P.Val &lt;0.05 为阈值，在 CHOL 组织与正常组织之间共鉴定出 3323 个差异表达基因（DEGs），其中 1880 个在 CHOL 组织中下调，1443 个上调（图 1a）。同时，edgeR 鉴定出 1578 个下调的 DEGs 和 3121 个上调的 DEGs（图 1b）；DESeq2 鉴定出 1616 个下调的 DEGs 和 2938 个上调的 DEGs（图 1c）。比较这三种方法的结果，共有 1431 个上调的 DEGs 和 1531 个下调的 DEGs 重叠（图 2）。
<img alt="基因表达的火山图，log2FC 对 -log10P，显示...

提供了用于RNA测序的差异表达分析方法的详细方案：limma、EdgeR、DESeq2。

三种用于RNA测序的差异表达分析方法：limma、EdgeR、DESeq2

RNA测序（RNA-seq）是转录组学中最广泛使用的技术之一，因为它能够揭示遗传改变与基因表达之间的关系……

用于RNA测序的三种差异表达分析方法：limma、EdgeR 和 DESeq2。打开 RStudio 程序，然后加载R文件DEGs。该文件可从补充文件一中获取。数据下载与预处理。1.1 从癌症基因组图谱（The Cancer Genome Atlas）下载胆管癌的高通量测序计数数据。此步骤可通过以下代码轻松实现。单击运行以安装 R 软件包。单击运行以加载 R 软件包。设置工作目录。选择癌症类型。运行 GDCquery 文件中的 R 代码以下载数据。GDCquery 文件可从补充文件/脚本中获取。执行后，可下载胆管癌RNA测序计数数据，并将其命名为CNT，其中行代表ensemble基因ID，列代表样本ID。请注意样本ID中第14至15位的数字：数字01至09表示肿瘤组织，10至19表示正常组织。将基因集ID转换为基因符号。根据注释文件的存储路径将其导入R。注释文件可从补充文件中获取。运行来自 gtf v22 文件的 R 代码，该文件可从补充文件/脚本中获取。应用函数将 ensemble 基因 ID 转换为基因符号。1.3。过滤低表达基因。点击运行以安装 edgeR 软件包“点击运行以加载 R 软件包 edgeR”运行以下 R 代码，保留至少在两个样本中每百万计数（counts per million）大于 1 的基因。二、通过 limma 进行差异表达分析“点击运行以安装 R 软件包 limma”点击运行以加载 R 软件包 limma“edgeR”运行以下 R 代码以创建设计矩阵。提取组别信息。将01设为肿瘤组织。将11设为正常组织。创建设计矩阵。创建 DGEList 对象。对数据进行标准化。运行以下 R 代码以执行基于 limma-trend 方法的差异表达分析。计算 CPM 值。单击“运行”以拟合线性模型来预测数据或推断变量之间的关系。基于贝叶斯方法计算 T 值、F 值和对数似然比。提取结果表格。差异表达分析的结果保存在 res_limma 中，其中包含 log2 倍数变化值。该基因在实验中的平均 log2 表达水平。经修正的 T 统计量、P 值、经错误发现率校正的 p 值以及差异表达基因的 log-odds 值。识别差异表达基因。因此，调整后的 P 值小于 0.05，且 log 倍数变化的绝对值大于或等于 2，是筛选差异表达基因的阈值。res limma 结果显示，与正常组织相比，胆管癌组织中有 1,443 个基因上调，1,880 个基因下调。将结果表格输出至文件。单击“运行”以安装 R 软件包 ggplot2。“单击运行以加载 R 软件包 ggplot2”。运行火山图文件中的 R 代码以生成火山图，该火山图文件可从补充文件中获取。基因可根据其 log2 倍数变化和校正后的 P 值映射到不同的位置。因此，上调的差异表达基因以红色显示。下调的差异表达基因以绿色显示。点击“导出”以保存火山图。三、通过 edgeR 进行差异表达分析：点击“运行”以加载 R 软件包 edgeR，运行以下 R 代码以创建设计矩阵。单击“运行”以创建 DGEList 对象并标准化数据。单击“运行”以估计基因表达值的离散度。单击“运行”以对计数数据进行模型拟合。进行统计检验。提取结果表格。结果保存在 res edgeR 中，包括对数倍数变化值、logCPM、F 值、p 值以及经错误发现率校正的 p 值。鉴定差异表达基因。edgeR 分析结果表明，与正常组织相比，胆管癌组织中有 3,121 个基因上调，1,578 个基因下调。将结果表格输出至文件。创建火山图。点击导出以保存火山图。四、通过 DESeq2 进行差异表达分析。单击“运行”以安装 R 软件包 DESeq2”“单击“运行”以加载 R 软件包 DESeq2”运行以下 R 代码以确定分组因子。创建 DESeq2 数据集对象。执行分析。生成结果表格。结果保存在 res DESeq2 中，包括标准化读段数的均值、log 倍数变化值、log 倍数变化标准误、检验统计量、原始 P 值以及校正后的 P 值。识别差异表达基因（DEGs）。DESeq2 分析结果显示，与正常组织相比，胆管癌组织中有 2938 个基因上调，1616 个基因下调。将结果表格输出至文件，并绘制火山图。单击导出以保存火山图。五、维恩图。单击运行以安装 R 软件包 venn diagram。单击“运行”以加载R软件包venn diagram。绘制上调差异表达基因的维恩图。单击“导出”以保存维恩图，绘制下调差异表达基因的维恩图。单击导出以保存维恩图。六、代表性结果。图一展示了通过limma、edgeR和DESeq2获得的所有基因的火山图。负对数 p 值对数倍数变化作图。红色点表示上调的差异表达基因，绿色点表示下调的差异表达基因。Limma 鉴定出胆管癌组织中一千八百八十个下调的差异表达基因和一千四百四十三个上调的差异表达基因。EdgeR 鉴定出 1578 个下调的差异表达基因，以及 3121 个上调的差异表达基因。DESeq2 鉴定出 1616 个下调的差异表达基因，以及 2938 个上调的差异表达基因。图 2 的维恩图展示了 limma、edgeR 和 DESeq2 分析结果之间的重叠部分。比较这三种方法的结果，共有1431个上调的差异表达基因和1531个下调的差异表达基因存在重叠。七、结论。在本方案中，我们提供了利用R软件包limma、edgeR和DESeq2对高通量测序计数数据进行多种差异分析的详细操作流程。这三种方法在分析流程中具有相似性与共通之处。这三种药物的作用在一定程度上存在重叠。三种药物各自具有其优势，具体选择仅取决于您的数据采集时间。如果有我的当前数据，应优先使用 limma；但对于测序数据，则优先使用 edgeR 和 DESeq2。

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