Name: 尽量减少小鼠肝内胰岛移植期间输注后门静脉出血 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-05-10T15:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 41 s
Description: 学习改进的小鼠肝内胰岛移植手术技术，通过明胶海绵或脂肪垫止血法有效减少门静脉出血和术后死亡率。该方法可应用于肝癌及肝脏疾病研究，提高移植成功率。

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本研究由美国退伍军人事务部（VA-ORD BLR&amp;#38;D 优秀奖 I01BX004536）以及美国国立卫生研究院资助项目 # 1R01DK105183、DK120394、DK118529（资助对象：HW）支持。我们谨向 Michael Lee 先生和 Lindsay Swaby 女士致以感谢，感谢他们提供的语言编辑帮助

所有操作均获得南卡罗来纳医科大学和查尔斯顿拉尔夫·约翰逊医疗中心机构动物护理和使用委员会的批准。
1. 使用链脲佐菌素（STZ）诱导糖尿病
<ol>
	<li>受体小鼠准备：
	<ol>
		<li>分别称量每只小鼠的体重。</li>
		<li>使用血糖仪检测尾静脉血样中的血糖水平。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>三种不同情况下的STZ剂量确定：
	<ol>
		<li>对于患有脂肪肝疾病的小鼠，注射一次链脲佐菌素（STZ）[40 mg/kg/天，腹腔（i.p.）注射]&#160;连续5天。</li>
		<li>对于 NOD-SCID 小鼠，在过夜禁食后，腹腔注射单次剂量为 125 mg/kg 的 STZ。</li>
		<li>对C57BL/6小鼠腹腔注射单次剂量为225 mg/kg的STZ。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>STZ（13.5 mg/mL）的计算： 
	注意：此计算针对5只体重为30 g的C57BL/6小鼠：
	<ol>
		<li>总体重：5只小鼠 × 30克/只 = 150克</li>
		<li>所需STZ：150 g × 225 mg/1000g STZ = 33.75 mg</li>
	</ol>
	</li>
	<li>STZ 的制备：
	<ol>
		<li>根据预先计算的剂量称量STZ。</li>
		<li>将称量好的STZ粉末转移至预冷的10 mL烧杯中，置于冰上。</li>
		<li>向烧杯中加入3 mL柠檬酸钠溶液以溶解链脲佐菌素（STZ）。</li>
		<li>充分混匀，&#160;经0.22 μm孔径滤器过滤除菌，并在配制后10分钟内使用该STZ溶液。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>STZ 注射：
	<ol>
		<li>将所需量的STZ溶液（足够一只小鼠使用）吸入1 mL注射器中。</li>
		<li>在小鼠腹部右下象限进行腹腔注射。</li>
		<li>注射后观察小鼠5分钟，在将其放回笼子之前检查此期间是否有任何不适迹象。</li>
		<li>在STZ注射后，每天使用血糖仪通过尾静脉采血监测血糖水平。 
		注意：在本实验中，当小鼠非空腹血糖水平达到 &#62; 连续两天 350 mg/dL。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 胰岛制备
注意：人胰岛在 CMRL-1066 培养基中培养，培养基中添加 10% 胎牛血清（FBS）和 1% 青霉素/链霉素（P/S），培养密度为每 100 mm 细胞培养皿 10,000 个胰岛当量数（IEQ）9。小鼠胰岛在 DMEM 培养基中培养，培养基中同样添加 10% FBS 和 1% P/S，培养密度相同13。6 至 10 周龄的雄性 NOD-SCID 和 C57BL/7 小鼠购自商业来源。
<ol>
	<li>通过轻轻刮取，将培养的胰岛从细胞培养皿上分离。</li>
	<li>使用1 mL注射器手动挑选所需数量的胰岛（例如300–350个胰岛），并将其放入预冷的无菌1.5 mL离心管中，置于冰上。</li>
	<li>使用微型离心机离心10秒。</li>
	<li>吸除上清液，保留少量液体以避免丢失沉淀物。</li>
	<li>将沉淀物重悬于200 μL含0.5%牛血清白蛋白（BSA）的HBSS中。</li>
	<li>用0.5 mL胰岛素注射器吸取重悬的胰岛悬液。</li>
	<li>将注射器垂直放置，静置1分钟，使胰岛沉降至注射器底部。</li>
	<li>推动注射器活塞，排出所有气泡，保留约100–150 μL含有胰岛的液体。</li>
	<li>将注射器针头朝下，轻轻敲击注射器侧面，使胰岛在液体中均匀分布。此时胰岛已准备好用于注射。</li>
</ol>
3. 胰岛移植
<ol>
	<li>使用2%异氟烷诱导并维持小鼠全身麻醉。通过检查足底反射是否消失来确认动物已充分麻醉。</li>
	<li>剃除小鼠腹部区域的毛发。</li>
	<li>术前单次给予布托啡诺（0.1 mg/kg，腹腔注射）。</li>
	<li>用2%碘伏和75%酒精交替擦拭三次，对手术区域进行消毒。</li>
	<li>使用显微剪刀行剖腹手术，制作1-1.5 cm的切口。</li>
	<li>用牵开器打开腹腔。随后根据下述方法A或方法B进行操作。</li>
</ol>
4. 方法A：（使用明胶海绵止血，图1A）14,15,16
<ol>
	<li>小鼠准备
	<ol>
		<li>在切口周围放置无菌纱布。</li>
		<li>用镊子轻轻拉出肠管，并将其置于纱布上。</li>
		<li>根据位置识别门静脉，并充分暴露。</li>
		<li>在整个手术过程中，用温热的生理盐水浸湿的纱布覆盖肠管。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将预装胰岛的胰岛素注射器针头穿过靠近十二指肠的门静脉（图1B）。操作时，持针使针孔（斜面）朝下，并在穿入门静脉壁前，使开口面的角度与门静脉壁平行。
	<ol>
		<li>回抽活塞，吸取少量血液（20–50 μL）进入注射器，以首先混匀胰岛。</li>
		<li>在反复回抽和推进活塞的同时，缓慢将胰岛注入门静脉。</li>
		<li>取一块明胶海绵（约 0.5 cm × 0.5 cm）覆盖注射部位。</li>
		<li>拔出针头时，用棉签尖端压住明胶海绵。</li>
		<li>继续按压明胶海绵约 2 分钟，确认无活动性出血。</li>
		<li>将棉签尖端滚动并移开&#160;，确保明胶海绵良好覆盖门静脉。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
5. 方法B：（用脂肪垫止血，图1C）17
<ol>
	<li>充分暴露门静脉。
	<ol>
		<li>使用两个棉签从左侧和右侧夹住暴露的门静脉。</li>
		<li>辨认十二指肠与门静脉之间的脂肪组织垫。</li>
		<li>在将针头插入门静脉之前，先穿透脂肪组织垫（图1D）。</li>
		<li>按照方法A中4.2.1和4.2.2部分所述的类似步骤输注胰岛。</li>
		<li>拔出针头时，用棉签按压脂肪组织。</li>
		<li>拔针后继续按压脂肪垫1分钟。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>确认门静脉无出血后，轻柔地将肠管复位至腹腔内的原始位置。</li>
	<li>关闭腹腔前，在腹腔内留置0.5 mL温盐水（36–37 °C）。 
	注：温盐水有助于术后肠道蠕动与恢复，并预防肠坏死。</li>
	<li>使用5-0缝线缝合肌肉层。</li>
	<li>使用4-0缝线缝合皮肤层。</li>
	<li>将小鼠置于铺有加热垫的清洁笼中，直至其完全从麻醉中恢复。</li>
	<li>术后48小时内，每12小时给予一次镇痛剂（例如，腹腔注射布托啡诺0.1 mg/kg）并持续提供辅助加热。 
	&#8203;注：胰岛移植手术过程约需15–20分钟完成。</li>
</ol>
6. H&amp;#38;E 染色及全肝组织切片摄影
<ol>
	<li>肝脏灌注
	<ol>
		<li>按照第3.1部分所述，将小鼠进行麻醉。</li>
		<li>小心暴露门静脉，并剪断下腔静脉。</li>
		<li>通过门静脉使用20 mL 10%多聚甲醛，以20 mL注射器配合25G针头手动灌注肝脏，持续约5分钟18。 
		注：肝脏灌注可清除肝组织中的血液，改善固定效果，同时不干扰胰岛移植物。</li>
		<li>将灌注后的完整肝脏从其他器官中分离出来。</li>
		<li>将灌注后的肝组织在10%多聚甲醛中固定24小时。</li>
		<li>将组织包埋于石蜡中。</li>
		<li>切取厚度为5 µm的组织切片，并置于载玻片上用于染色。</li>
		<li>采用标准方法进行苏木精与伊红（H&amp;#38;E）、胰岛素、纤维蛋白及多形核中性粒细胞（PMN）染色15,16。</li>
		<li>在显微镜下扫描整个肝组织切片。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Pellegrini, S., Cantarelli, E., Sordi, V., Nano, R., Piemonti, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+state+of+the+art+of+islet+transplantation+and+cell+therapy+in+type+1+diabetes%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Diabetology%22%5BJournal%5D)">The state of the art of islet transplantation and cell therapy in type 1 diabetes.</a> Acta Diabetology. 53 (5), 683-691 (2016).</li>
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<li>Cui, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thrombomodulin+improves+early+outcomes+after+intraportal+islet+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Transplantation%22%5BJournal%5D)">Thrombomodulin improves early outcomes after intraportal islet transplantation.</a> American Journal of Transplantation. 9 (6), 1308-1316 (2009).</li>
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<li>Cabral, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+of+hepatocytes+and+sinusoidal+endothelial+cells+from+mouse+liver+perfusion%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Purification of hepatocytes and sinusoidal endothelial cells from mouse liver perfusion.</a> Journal of Visualized Experiments. (132), e56993(2018).</li>
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</ol>

所有作者均声明不存在利益冲突。

本研究展示了两种改进的操作步骤，可预防出血并可能降低小鼠在自体肝内胰岛移植（IIT）过程中的死亡率。本研究使研究人员能够直观观察胰岛移植模型，该模型在研究移植后即刻发生的血液介导的炎症反应方面具有独特优势。IIT模型是研究胰岛细胞存活以及肝脏缺血性损伤对胰岛移植反应的独特模型19。本文在既往研究基础上优化了操作流程，减少了早期并发症导致的小鼠死亡。方法A14,15,16&#160;和方法B8,9均已在多项研究中被采用。我们发现，胰岛在肝脏全范围内分布，且移植后移植物中性粒细胞浸润和血栓形成等典型IIT相关病理特征在移植后即刻即已显著出现。
小鼠肝内胰岛移植包含几个关键步骤。由于人和小鼠的胰岛直径均可达到200 μm，移植时必须使用至少...

通过门静脉进行的门静脉内胰岛移植（IIT）是临床环境中人类胰岛移植最常用的方法。小鼠IIT模型为研究胰岛移植以及测试可提高胰岛移植疗效的有前景干预措施提供了极佳的机会1。IIT最早于20世纪70年代被描述，并由多个研究团队所采用1,2,3,4,5。在2000年人类胰岛移植取得突破性进展后，该方法重新受到广泛关注6,7。然而，大多数胰岛移植研究倾向于选择肾包膜下作为实验性胰岛移植的首选部位，因其操作简便且成功率较高。相比之下，IIT技术难度更高，因此在胰岛移植研究中使用较少8,9。然而，与IIT不同的是，移植至肾包膜下的胰岛不会经历以血栓形成、炎症反应和肝组织缺血为特征的即刻血液介导的炎性反应，因此其功能优于移植至肝脏的胰岛。因此，肾包膜下移植模型可能无法完全模拟人类胰岛移植过程中胰岛所面临的应激环境10,11,12。
在小鼠中进行胰岛移植（IIT）的主要并发症之一是移植后注射部位出血，这可能导致不同品系小鼠出现10–30%的死亡率12。本文介绍了两种经过优化的方法，可更快速、更安全地止血，并降低IIT术后小鼠的死亡率。对这些优化步骤进行可视化演示，将有助于研究人员识别这一技术难度较高操作的关键步骤。&#160;此外，通过苏木精和伊红（H&amp;#38;E）染色的肝脏组织（完整切片）进行组织学检查，确定了受体肝脏中胰岛移植物的位置。

<table><tbody><tr><td>10% 中性缓冲福尔马林（v/v）</td><td>Fisher Scientific</td><td>23426796</td><td></td></tr><tr><td>1 mL 带针注射器</td><td>AHS</td><td>AH01T</td><td></td></tr><tr><td>20 mL 注射器</td><td>BD</td><td>301031</td><td></td></tr><tr><td>25G × 5/8&quot; 皮下注射针头</td><td>BD</td><td>305122</td><td></td></tr><tr><td>酒精消毒片，无菌</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-363-750</td><td></td></tr><tr><td>动物麻醉系统</td><td>VetEquip, Inc.</td><td>901806</td><td></td></tr><tr><td>盐酸丁丙诺啡注射液</td><td>Par Sterile Products, LLC</td><td>NDC 42023-179-05</td><td></td></tr><tr><td>离心管，15 mL</td><td>Fisher Scientific</td><td>0553859A</td><td></td></tr><tr><td>CMRL-1066</td><td>Corning</td><td>15110CV</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Corning</td><td>10013CV</td><td></td></tr><tr><td>乙醇，绝对（200 proof），分子生物学级</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP2818500</td><td></td></tr><tr><td>超细显微解剖剪，4&amp;rdquo; 直头锐利</td><td>Roboz Surgical Instrument Co.</td><td>RS-5882</td><td></td></tr><tr><td>胎牛血清（FBS）</td><td>Corning</td><td>35011CV</td><td></td></tr><tr><td>FreeStyle&amp;nbsp; 血糖仪</td><td>Abbott</td><td>Lite</td><td></td></tr><tr><td>FreeStyle 血糖检测试纸</td><td>Abbott</td><td>Lite</td><td></td></tr><tr><td>明胶海绵（可吸收明胶海绵，USP）</td><td>Pharmacia &amp;amp; Upjohn Company</td><td>34201</td><td></td></tr><tr><td>Graefe 镊子，4&amp;rdquo; 超精细尖端</td><td>Roboz Surgical Instrument Co.</td><td>RS-5136</td><td></td></tr><tr><td>加热垫</td><td>Amazon</td><td>B07HMKMBKM</td><td></td></tr><tr><td>Hegar-Baumgartner 持针器，5.25&amp;rdquo;</td><td>Roboz Surgical Instrument Co.</td><td>RS-7850</td><td></td></tr><tr><td>胰岛素注射器，带 27 号针头</td><td>BD</td><td>879588</td><td></td></tr><tr><td>碘伏消毒片</td><td>Fisher Scientific</td><td>19-027048</td><td></td></tr><tr><td>异氟烷</td><td>Piramal Critical Care</td><td>NDC 66794-017-25</td><td></td></tr><tr><td>青霉素/链霉素（P/S）</td><td>HyClone</td><td>SV30010</td><td></td></tr><tr><td>聚丙烯缝线 4-0</td><td>Med-Vet International</td><td>MV-8683</td><td></td></tr><tr><td>聚丙烯缝线 5-0</td><td>Med-Vet International</td><td>MV-8661</td><td></td></tr><tr><td>氯化钠，0.9% 静脉注射液</td><td>VWR</td><td>2B1322Q</td><td></td></tr><tr><td>链脲佐菌素（STZ）</td><td>Sigma</td><td>S0130</td><td></td></tr><tr><td>手术巾，无菌</td><td>Med-Vet International</td><td>DR1826</td><td></td></tr><tr><td>组织包埋盒</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-272416</td><td></td></tr></tbody></table>

小鼠肝内胰岛移植过程中减少输注后门静脉出血的方法

Minimizing Post-Infusion Portal Vein Bleeding during Intrahepatic Islet Transplantation in Mice

尽管目前在临床实践中普遍接受肝脏作为人胰岛移植的主要部位，但在大多数啮齿类动物的临床前胰岛移植研究中，胰岛通常被移植至肾包膜下。该模型被广泛使用的原因在于，小鼠肝内胰岛移植在技术上具有挑战性，且术后尤其是移植后穿刺部位出血，可导致较高比例的小鼠死于手术并发症。本研究展示了两种可最大限度减少输注后门静脉出血发生的方法。第一种方法是在注射部位应用可吸收的止血明胶海绵；第二种方法是先将胰岛注射针穿过脂肪组织，再进入门静脉，利用脂肪组织作为物理屏障以阻止出血。这两种方法均能有效防止因出血导致的小鼠死亡。研究展示了完整的肝脏切片，显示了移植后胰岛的分布情况以及胰岛血栓形成的证据，这是肝内胰岛移植的典型特征。这些改进的实验方案优化了肝内胰岛移植的操作流程，可能有助于各实验室建立该技术，用于在临床前条件下研究胰岛的存活与功能。

我们通过门静脉进行了同基因型和异种胰岛移植。在两种胰岛移植模型中，移植物功能均呈剂量依赖性。在使用C57BL/6小鼠的同基因型胰岛移植模型中，移植250个胰岛可导致短暂的正常血糖，随后小鼠恢复至高血糖状态。接受500个胰岛移植的小鼠在移植后超过30天达到并维持正常血糖水平（图2A）。两组小鼠的体重均有所增加（图2B）。
类似地，在将人胰岛移植到糖尿病NOD-SCID小鼠的胰岛移植模型中，比较了移植45、85或140 IEQ/kg体重胰岛时移植物的功能。当移植45 IEQ/g（约每只小鼠225–275个胰岛）的人胰岛时，无法实现正常血糖。当胰岛数量增加至85 IEQ/g（约每只小鼠400–450个胰岛）时，移植后第60天有35.7%（10/28）的受体达到正常血糖（与45 IEQ/g组相比，p = 0.02）。此外，接受140 IEQ/g（约每只小鼠600–650个胰岛）人胰岛移植的受体中，有83.3%（5/6）达到正常血糖。<strong class="xfig"...

本文介绍了在小鼠体内成功实施门静脉内胰岛移植的优化手术步骤。该手术是一种具有临床相关性但技术上具有挑战性的外科操作。

尽管目前在临床实践中普遍将肝脏作为人胰岛移植的主要部位，但胰岛是被移植于……

肝脏是临床人胰岛移植的主要部位。小鼠肝内胰岛移植在技术上具有挑战性，许多小鼠可能因手术并发症（尤其是出血）而死亡。本研究中，我们展示的两种方法均能有效防止因出血导致的小鼠死亡。我们的方法可通过将癌细胞、间充质干细胞和肝细胞直接注射至肝脏，应用于肝癌及其他肝脏疾病的研究。首先，用轻柔刮擦的方法从培养物中分离人胰岛细胞。使用1立方厘米的注射器，在冰上将300至350个胰岛收集至无菌的1.5毫升离心管中。当所有胰岛都被挑出后，将离心管短暂离心10秒，使细胞沉淀。弃去上清液，仅保留少量体积以防止沉淀丢失，然后将胰岛重悬于200 µL含有5% BSA的HBSS中。将重悬的胰岛转移至一支5 mL胰岛素注射器中，并将注射器针头朝上放置1分钟，使胰岛沉降到推杆端。 按下活塞以排除气泡，保留约100至150微升溶液在注射器中，然后将注射器倒置并轻轻敲击，使胰岛均匀分布。确认小鼠无足底反射反应后，涂抹眼膏以防止角膜干燥。剃除麻醉小鼠腹部的毛发，并用2%碘溶液和75%酒精交替擦拭三次，对术区进行消毒。接着，在腹部做一个1至1.5厘米的切口，打开腹膜腔。在切口周围放置一块无菌纱布，用镊子或棉签轻轻将肠管转移至纱布上。然后用浸有生理盐水的纱布覆盖肠管，暴露门静脉。为防止胰岛移植引起的出血，使用明胶海绵时，应持针使针尖斜面朝下，并在将针头插入门静脉前，调整针尖位置，使其开口与门静脉壁平行。在将胰岛注入门静脉之前，回抽活塞，使20至50微升血液进入注射器，与胰岛混合，同时反复按压和回抽活塞。当所有胰岛输送完毕后，在注射部位覆盖一块约5厘米×5厘米的明胶海绵。拔出针头时，用棉签轻压明胶海绵，使其紧贴门静脉。固定明胶海绵约 2 分钟，并滚动海绵以确保其完全覆盖门静脉。止血后，将肠管轻柔地复位至腹膜腔原位，并向腹腔内注射 500 µL 温盐水。使用缝线关闭肌肉层和皮肤层。然后将小鼠置于铺有加热垫的清洁笼具中，并持续监测直至其完全从麻醉中恢复，每12小时给予一次镇痛处理，加热维持48小时。为防止胰岛移植引起的出血，使用脂肪垫进行止血：在暴露门静脉后（操作如前所示），用两个棉签分别从左右两侧固定暴露的门静脉，并找到位于十二指肠与门静脉之间的脂肪组织垫。在将针头插入门静脉之前，先用针尖穿透脂肪垫。按照演示方法将胰岛注入门静脉。当所有胰岛输送完毕后，在拔出针头的同时用棉签轻压脂肪组织约1分钟。然后将肠管放回腹腔，并按照演示进行其余的术后护理操作。胰岛移植的效果具有剂量依赖性，当移植500个胰岛时，同基因型胰岛移植后30天可观察到正常血糖水平；而当移植250个胰岛时，仅出现短暂的正常血糖，小鼠在移植后10天即恢复至高血糖状态。两组小鼠均出现体重增加的现象，当将人胰岛移植到糖尿病NOD-SCID小鼠体内时，也观察到类似反应：移植较大量的胰岛当量时可观察到正常血糖，而移植较少数量时则无法实现。移植后出现出血的大多数小鼠在手术后死亡，而未出血的小鼠则存活。移植后28天，胰岛素染色显示人胰岛在肝脏中呈均匀分布，主要靠近血管。除了胰岛素外，在移植的人胰岛内还观察到纤维蛋白和多形核细胞浸润。肝内胰岛移植会在门静脉上产生较大的孔洞，可能导致出血。采用我们改进的两种操作步骤可预防出血，并降低胰岛移植术后的死亡率。门静脉内胰岛移植模型能够模拟临床人体胰岛移植过程。我们优化的实验流程可提高受体的存活率，从而在移植后进一步研究胰岛细胞的功能。

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