荧光标记小型细胞外囊泡的摄取 体外 以及在脊髓中

通过可视化观察小细胞外囊泡（sEVs）被脊髓中不同细胞的摄取情况，可以确认sEVs递送是否成功。这有助于在啮齿类动物模型中开展针对鞘内给予的、来源于不同来源的sEVs的作用机制及治疗效果研究。本方案可用于观察sEVs在正常脊髓组织中被细胞摄取的过程，并有助于评估sEVs及其携带分子在脊髓相关疾病、疼痛和炎症中的作用。

本实验步骤将由我以及 Dr. Seena Ajit 实验室的两名研究生 Xuan Luo 和 Zhucheng Lin 共同演示。首先，将 18 毫米的盖玻片放入 12 孔板中，然后在每个孔中接种 Neuro-2a 细胞，每孔加入 1 毫升含 10% FBS 和 1% 青霉素-链霉素的完全 DMEM 培养基。当细胞融合度达到 80% 至 90% 时，将各孔中的培养基更换为无外泌体的 DMEM 培养基，并在每孔中分别加入 1、5 或 10 微克标记的 sEVs。

分别在1小时、4小时和24小时进行。按照等体积染料对照，对剩余孔进行剂量和时间依赖性摄取实验。将新生幼鼠脑组织置于含有冰冷的Hanks平衡盐溶液（添加10 mmol/L HEPES）的60毫米培养皿中，分离两侧大脑皮层并去除脑膜。

然后用灭菌刀片将组织切碎。将组织转移至含有Pepane或脱氧核糖核酸酶I消化缓冲液的15毫升锥形管中，在37摄氏度下孵育20分钟，每5分钟轻轻摇动一次试管。吸除上清液后，向管中加入5毫升完全DMEM培养基。为终止酶活性，请小心操作，使用5毫升玻璃血清移液管和火焰抛光的巴斯德移液管充分吹打以解离组织。

将细胞悬液通过40微米细胞筛，然后在4摄氏度下以250 × g离心5分钟，吸去上清液，并将细胞重悬于10毫升完全DMEM培养基中，接种至75平方厘米培养瓶。贴壁4小时后，更换上清液和培养基为15毫升新鲜DMEM培养基。体外培养14天后，为分离小胶质细胞和少突胶质细胞，将培养瓶置于320 RPM的摇床中振荡6小时。

在37摄氏度下使用5毫升细胞解离酶处理10分钟。为了消化剩余的星形胶质细胞，加入5毫升完全DMEM以终止酶活性，然后在4摄氏度下以250 × g离心5分钟收集细胞。用完全DMEM重悬细胞，并将细胞接种至24孔板中直径为12毫米的1.5号盖玻片上。

用 PBS 洗涤细胞 3 次，然后在室温下用 PBS 中 4% 多聚甲醛（PFA）固定 10 分钟。用 PBS 洗涤固定后的细胞 3 次，每次 5 分钟，并用 PBS 中 0.1% Triton X-100 透化处理 10 至 15 分钟。然后再次用 PBS 重复洗涤。

使用 PBS 中含 5% 正常山羊血清（NGS）的溶液在室温下封闭细胞 1 小时；将神经-2a 细胞与微管相关蛋白 2（map two-way）抗体、原代星形胶质细胞与胶质纤维酸性蛋白（GFAP）抗体按 1:500 的比例溶于新鲜的含 5% NGS 的 PBS 中，在 4 摄氏度下避光轻摇孵育过夜。用 PBS 洗涤细胞 3 次后，加入荧光素标记的二抗，溶于含 5% NGS 的 PBS 中，在室温下避光于摇床孵育 2 小时。

用 PBS 重复洗涤，并在室温下用每毫升 1 微克的 DAPI 孵育细胞 10 分钟。再次用 PBS 洗涤细胞 3 次。使用抗荧光淬灭封片剂将盖玻片封于 1 号载玻片上，置于暗处过夜干燥，并将制备好的玻片在 4 摄氏度保存，直至在共聚焦显微镜下成像。

解剖脊髓，并在4%多聚甲醛（PFA）的PBS溶液中4摄氏度固定24小时。随后在4摄氏度下用30%蔗糖的PBS溶液保护组织24小时，或直至组织沉底，然后将组织在4摄氏度保存至进行免疫组织化学实验。将L4-L5节段脊髓包埋于OCT包埋剂中，然后置于干冰上冷冻至完全固化。使用冷冻切片机将组织切成30微米厚的切片，并将切片收集至含有PBS的24孔板中。

用含0.3%Triton的PBS溶液清洗切片，每次5分钟，共清洗3次；在室温下用含5%MGS的0.3%Triton PBS溶液封闭非特异性结合位点，封闭2小时。将切片置于摇床上，于4摄氏度孵育过夜。用含0.3%Triton的PBS溶液清洗切片，每次5分钟，共清洗3次。

然后加入适当浓度的二抗。根据文稿所述，在室温下孵育两小时，仅使用PBS洗涤切片，并在室温下用1微克/毫升的DAPI孵育10分钟。随后在光学显微镜下重复PBS洗涤步骤，用细毛笔将切片转移至透明粘附载玻片上封片。

用封片剂将盖玻片润湿后，在室温避光条件下过夜固化，随后使用共聚焦显微镜及相应的激光器采集图像。RA 2 6 4 0.7 来源的sEVs的平均粒径为140纳米，峰值粒径为121.8纳米，大多数可检测到的颗粒粒径位于外泌体或sEVs典型的50至150纳米范围内。对sEVs、细胞裂解液及外泌体耗竭培养基进行的Western blot分析表明，来源于sEVs的蛋白样品中含有sEV标志物蛋白Alix、CD81和GAPDH。

细胞裂解液中富含内质网，其驻留蛋白Calnexin因此可作为细胞污染的阴性标志物，因为Calnexin在小细胞外囊泡（sEVs）中不存在。观察到sEVs的摄取在1小时即发生；对于1、5和10微克的sEVs，在孵育后4小时可检测到荧光信号；而对于4、5和10微克的sEVs，在孵育后4小时亦可检测到荧光。检测了原代星形胶质细胞对PKH26标记的sEVs的摄取情况，发现原代皮层星形胶质细胞对sEVs的摄取在24小时达到最大荧光信号；而在神经元、星形胶质细胞和小胶质细胞中，PKH26标记的sEVs在注射后6小时摄取量最大，并观察到最强荧光信号。

通过设置对照组、未标记的小细胞外囊泡（sEVs）以及染料对照，可以消除因游离染料非特异性标记而产生的假阳性信号。可通过检测生物分子货物向受体细胞和组织的转移情况，以及分析生物分子或靶基因表达水平的变化，来确认sEVs的摄取。此外，还可进行行为学研究，以探讨sEV递送的功能性影响。