Name: 吸收荧光标记的小细胞外囊泡 在体外 和脊髓 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-05-23T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 1 s
Description: 了解使用PKH染料标记巨噬细胞来源的小细胞外囊泡并在体外和脊髓内追踪其摄取的方法。该技术有助于研究sEVs在脊髓疼痛和炎症中的治疗潜力。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

本研究由美国国立卫生研究院神经疾病与中风研究所（NIH NINDS R01NS102836）以及宾夕法尼亚州卫生部通用研究增强计划（CURE）向 Seena K. Ajit 提供的资助支持。我们感谢 Bradley Nash 博士对稿件的审阅。

注意：所有操作均遵循美国国立卫生研究院（NIH）《实验动物护理与使用指南》的规定，并经机构动物护理与使用委员会批准。 &amp;#38; 德雷塞尔大学医学院动物使用委员会。使用定时妊娠的CD-1小鼠进行星形胶质细胞培养，所有母鼠均在受孕后15天接收。使用10至12周龄的C57BL/6小鼠进行 体内 摄取实验
1. 从 RAW 264.7 巨噬细胞中分离小细胞外囊泡（sEVs）
<ol>
	<li>将RAW 264.7细胞在含有10%无外泌体胎牛血清（FBS）和1%青霉素-链霉素（pen-strep）的DMEM无外泌体培养基中，于75 cm2培养瓶中培养24–48小时。</li>
	<li>收集300 mL条件培养基，在4 °C下以300 × g离心10分钟。</li>
	<li>收集上清液，在4 °C下以2,000 × g离心20分钟。</li>
	<li>将上清液转移至离心管中，在4 °C下以12,000 × g离心35分钟。</li>
	<li>收集上清液，经0.22 µm针头滤器过滤。</li>
	<li>转移至超速离心管中，在4 °C下以110,000 × g离心80分钟。</li>
	<li>保留上清液（无外泌体培养基），将沉淀物重悬于2 mL 1×磷酸盐缓冲液（PBS）中，在4 °C下以110,000 × g离心1小时。</li>
	<li>将沉淀物重悬于100 µL PBS中，用于后续纳米颗粒追踪分析（NTA）和透射电子显微镜（TEM）表征，或重悬于放射免疫沉淀分析（RIPA）裂解液中用于蛋白质印迹（western blotting）。</li>
</ol>
2. sEVs 的表征
<ol>
	<li>纳米颗粒追踪分析（NTA） 
	注意：使用NTA测量来自RAW 264.7细胞的纯化sEVs的粒径分布及颗粒数量/浓度。
	<ol>
		<li>用过滤后的PBS稀释sEVs，使每个视野中包含20–60个囊泡，以实现最佳追踪效果。</li>
		<li>使用恒流速的注射泵将稀释后的样品注入流动池中。</li>
		<li>采集3–5段各30秒的视频。设置快门速度和增益，并手动调节相机参数，使尽可能多的囊泡可见并可被追踪和分析。</li>
		<li>每次记录之间推进样品以进行重复测量。优化NTA采集后的分析参数，并在不同样品间保持参数一致。</li>
		<li>使用NTA软件分析每段视频，获得囊泡的平均粒径和浓度。</li>
		<li>所有NTA测量均需采用相同的系统设置，以确保一致性。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>蛋白质印迹（Western blot）
	<ol>
		<li>根据试剂盒说明书，使用蛋白定量试剂盒测定sEVs、细胞裂解液和外泌体耗竭培养基中的总蛋白含量。</li>
		<li>细胞裂解液制备：将RAW 264.7细胞在75 cm2培养瓶中培养至80–90%汇合度。用0.25%胰蛋白酶消化10–15分钟，用培养基中和胰蛋白酶，然后在400 × g离心5分钟收集细胞。将细胞重悬于新鲜生长培养基中。</li>
		<li>使用血细胞计数板计数细胞，取1 × 106个细胞转移至另一离心管中。用PBS洗涤细胞两次（离心条件同上），并在最后一次离心所得细胞沉淀中加入50 µL裂解缓冲液（含蛋白酶抑制剂混合物的RIPA缓冲液）。</li>
		<li>涡旋混匀细胞，冰上孵育20分钟。在4 °C、10,000 × g离心30分钟，收集上清液（即裂解液）至新的微量离心管中，保存于−80 °C直至使用。</li>
		<li>使用截留分子量为3 kDa的离心过滤器将2 mL外泌体耗竭培养基浓缩至100 µL，再进行蛋白定量。将sEVs与裂解缓冲液按1:1比例混合，涡旋30秒，冰上孵育15分钟，用于蛋白定量。</li>
		<li>将等量蛋白（2 µg）的sEVs、RAW 264.7细胞裂解液和外泌体耗竭培养基与还原性上样缓冲液混合。</li>
		<li>在95 °C变性样品5分钟，冰上冷却5分钟，然后在10,000 × g离心2分钟。将样品上样至12% Tris-甘氨酸蛋白凝胶&#160;，在125 V电压下电泳45分钟。</li>
		<li>在25 V电压下将蛋白转移至聚偏二氟乙烯（PVDF）膜，持续2小时。</li>
		<li>转膜完成后，用封闭缓冲液（见材料表）在室温下封闭PVDF膜1小时。</li>
		<li>在摇床上，4 °C孵育一抗过夜。 
		注意：所用一抗包括抗CD81抗体（1:1,000）、抗ALG-2相互作用蛋白X（Alix）抗体（1:1,000）、抗Calnexin抗体（1:1,000）和抗甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH）抗体（1:1,000）。</li>
		<li>用1× Tris-盐水缓冲液含0.1% Tween 20（TBST）洗涤膜3次，每次15分钟，在摇床上室温孵育1小时，加入辣根过氧化物酶（HRP）标记的山羊抗小鼠IgG或驴抗兔IgG二抗（1:10,000）。</li>
		<li>用1× TBST洗涤膜3次，每次15分钟，使用HRP底物检测蛋白信号。</li>
		<li>使用蛋白质印迹成像系统通过增强化学发光法分析印迹结果。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>透射电子显微镜（TEM）
	<ol>
		<li>将sEVs重悬于0.1 M磷酸缓冲液（PB）中含2%多聚甲醛（PFA）的溶液中进行固定；涡旋2次，每次15秒。</li>
		<li>在洁净的Parafilm膜上滴加10 µL sEV悬液。将碳膜支持的Formvar铜网（涂层面向下）漂浮于液滴上，让囊泡在干燥环境中吸附20分钟。</li>
		<li>将铜网（膜面朝下）置于PB液滴上洗涤3次，每次2分钟。</li>
		<li>将铜网转移至50 µL 1%戊二醛中孵育5分钟。</li>
		<li>用100 µL蒸馏水洗涤铜网8次，每次2分钟。</li>
		<li>将铜网置于1%醋酸双氧铀液滴上染色2分钟，进行对比增强。</li>
		<li>在覆有Parafilm的冰盘上，将铜网置于含0.2%醋酸双氧铀和2%甲基纤维素的50 µL溶液中，孵育10分钟，进行包埋。</li>
		<li>使用不锈钢环支撑铜网，并用滤纸吸除多余液体。</li>
		<li>将铜网保留在环上，室温晾干10分钟。</li>
		<li>在80 kV电压下使用透射电子显微镜观察样品。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. sEVs 的标记
<ol>
	<li>将20 µg sEVs溶于1 mL稀释缓冲液中，或在1 mL稀释缓冲液中加入等体积的PBS作为染料对照。</li>
	<li>将3 µL PKH67或PKH26染料溶于1 mL稀释缓冲液中，并用移液器混匀。</li>
	<li>将稀释后的PKH染料加入稀释的sEVs中，用移液器混匀。室温避光孵育5分钟。对于染料对照，将稀释后的染料与步骤3.1中稀释的PBS混合。</li>
	<li>向含有染料和sEV混合物的离心管以及染料对照管中各加入2 mL含1%牛血清白蛋白（BSA）的PBS，以吸收多余的染料。</li>
	<li>在4 °C下以110,000 × g离心1小时。弃去上清液，将沉淀物重悬于2 mL PBS中，再次在4 °C下以110,000 × g离心1小时。用PBS重复洗涤一次，将标记的sEVs或染料对照重悬于等体积的PBS中。</li>
	<li>采用Bradford法测定总蛋白含量。</li>
</ol>
4. 神经-2a细胞对sEVs的摄取
<ol>
	<li>将18 mm盖玻片放入12孔板中，每孔接种10 × 104个Neuro-2a细胞，加入总体积为1 mL的完全DMEM培养基（含10% FBS和1%青霉素-链霉素）。</li>
	<li>当细胞融合度达到80–90%时，更换为无外泌体的DMEM培养基。每孔分别加入1、5或10 µg标记的sEVs，孵育1、4或24小时，以进行剂量和时间依赖性摄取实验；或加入等体积的染料对照。</li>
</ol>
5. 原代星形胶质细胞培养
<ol>
	<li>出生后第4天，通过诱导低温使4只新生幼鼠麻醉。</li>
	<li>将脑组织收集至含有冰冷的、添加了10 mM 4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙磺酸（HEPES）的Hank's平衡盐溶液（HBSS）的60 mm培养皿中。</li>
	<li>解剖两侧大脑皮层并去除脑膜。使用无菌刀片将组织切碎。</li>
	<li>将组织转移至含有木瓜蛋白酶/脱氧核糖核酸酶I消化缓冲液的15 mL锥形管中，37 °C孵育20分钟，每5分钟轻轻摇动一次。 
	注意：处理4只小鼠的皮层时，将9 mL含7.5 U/mL木瓜蛋白酶的HBSS溶液在37 °C下激活至少30分钟，经0.22 µm注射器滤器过滤后，加入脱氧核糖核酸酶I至终浓度为0.1 mg/mL。</li>
	<li>吸弃上清液，加入5 mL完全DMEM以灭活酶活性。使用5 mL玻璃血清移液管和火焰抛光的巴斯德移液管，轻轻吹打以解离组织。</li>
	<li>将细胞悬液通过40 µm细胞筛过滤，并在250 × g条件下离心细胞 g 4 °C下孵育5分钟。吸除培养基，将细胞接种于10 mL完全DMEM培养基中，置于75 cm²培养瓶内2 培养瓶。铺板后4小时，将上清液更换为15 mL新鲜DMEM培养基。</li>
	<li>14 天后 体外将培养瓶转移至摇床，在320 rpm条件下振荡6小时，以分离小胶质细胞和少突胶质细胞。</li>
	<li>使用5 mL细胞解离酶对剩余的星形胶质细胞进行胰蛋白酶消化处理（材料表) ，37 °C 下孵育 10 分钟。加入 5 mL 完全 DMEM 以终止酶反应，250 × g 4 °C下离心5分钟。</li>
	<li>用完全DMEM重悬细胞。接种5 × 104 24孔板中12 mm #1.5 盖玻片上的细胞</li>
</ol>
6. 星形胶质细胞对sEVs的摄取
<ol>
	<li>当星形胶质细胞达到80-90%融合度时，将培养基更换为无外泌体的DMEM培养基。</li>
	<li>向细胞中加入1 µg未标记或已标记的小细胞外囊泡（sEVs）、等体积的染料对照或PBS。在sEV处理后1小时和24小时分别取细胞进行染色。</li>
</ol>
7. 免疫荧光
<ol>
	<li>用 PBS 清洗细胞 3 次，并在室温下用含 4% 多聚甲醛（PFA）的 PB 固定 10 分钟。</li>
	<li>用 PB 洗涤固定后的细胞，每次 5 分钟，共 3 次；然后用含 0.1% Triton X-100 的 PB 透化处理 10–15 分钟，再用 PB 洗涤 3 次，每次 5 分钟。</li>
	<li>用含 5% 正常山羊血清（NGS）的 PB 在室温下封闭细胞 1 小时。</li>
	<li>加入一抗：Neuro-2a 细胞使用微管相关蛋白 2（MAP2A，1:500），原代星形胶质细胞使用胶质纤维酸性蛋白（GFAP，1:500），溶于新鲜配制的含 5% NGS 的 PB 中，4 °C 轻柔振荡孵育过夜。</li>
	<li>用 PB 洗涤 3 次，每次 10 分钟；然后加入荧光标记的二抗（山羊抗小鼠 IgG1，Alexa Fluor 594；或山羊抗小鼠 IgG H&amp;L，Alexa Fluor 488），溶于含 5% NGS 的 PB 中，在室温下于摇床上孵育 2 小时。</li>
	<li>用 PB 洗涤 3 次，每次 10 分钟；然后加入 1 µg/mL 的核染料 4',6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI），室温孵育 10 分钟；再次用 PB 洗涤细胞 3 次。</li>
	<li>将盖玻片用抗荧光淬灭封片剂封固于 #1 载玻片上，置于暗处过夜干燥，随后将制备好的玻片存放在 4 °C，待共聚焦显微镜成像时使用。</li>
</ol>
8. 体内 sEVs的摄取
<ol>
	<li>将5 µg未标记或标记的sEVs重悬于10 µL PBS中，或等体积（10 µL）染料对照液（按第3节制备），对C57BL/6小鼠进行鞘内注射。</li>
	<li>sEVs注射后6小时和18小时，通过腹腔注射每公斤体重100 mg的氯胺酮和每公斤体重10 mg的赛拉嗪，对小鼠进行深度麻醉。</li>
	<li>用0.9%生理盐水对小鼠进行心脏灌流，以清除血液，随后灌注新配制的冰冻4% PFA/PB溶液。</li>
	<li>取出脊髓组织，在4% PFA/PB溶液中4 °C固定24小时。随后将组织置于含30%蔗糖的PB溶液中4 °C下进行冷冻保护处理，持续24小时或直至组织沉底。处理完成后将组织于4 °C保存，直至进行免疫组织化学分析。</li>
</ol>
9. 免疫组织化学
<ol>
	<li>将L4-L5脊髓组织包埋于O.C.T. 化合物中，置于干冰上冷冻至完全固化。</li>
	<li>使用冷冻切片机将组织切成30 µm厚的横截面（脊髓为横切面），并将切片收集至含有PB的24孔板中。用含0.3% Triton的PB洗涤切片，每次5分钟，共洗3次。</li>
	<li>用含5% NGS的0.3% Triton/PB溶液在室温下封闭非特异性结合位点，封闭2小时。</li>
	<li>在含5% NGS的0.3% Triton/PB溶液中稀释一抗：Anti-MAP2A（1:500）、GFAP（1:1,000）、用于小胶质细胞的Iba1（1:2,000），然后将切片置于4 °C摇床上孵育过夜。</li>
	<li>用0.3% Triton/PB洗涤切片3次，每次5分钟；然后加入二抗（驴抗兔IgG Alexa Fluor 488，1:500，或羊抗鼠IgG Alexa Fluor 488，1:500）溶于5% NGS/PB中，在室温下孵育2小时。</li>
	<li>用PB洗涤切片3次，每次5分钟；然后在室温下用1 µg/mL的DAPI孵育切片10分钟。再次用PB洗涤切片3次，每次5分钟。</li>
	<li>在体视显微镜下，用细画笔将切片转移至洁净的粘附载玻片（材料表）上进行封片。</li>
	<li>用封片剂润湿盖玻片，于室温避光条件下固化过夜。</li>
	<li>使用相应的激光在共聚焦显微镜下成像。</li>
</ol>

<ol><li>Mulcahy, L. A., Pink, R. C., Carter, D. R. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Routes+and+mechanisms+of+extracellular+vesicle+uptake%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Extracellular+Vesicles%22%5BJournal%5D)">Routes and mechanisms of extracellular vesicle uptake.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 3 (1), 24641(2014).</li>
<li>Betzer, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advances+in+imaging+strategies+for+in+vivo+tracking+of+exosomes%5BTitle%5D)+AND+%22Wiley+Interdisciplinary+Reviews.+Nanomedicine+and+Nanobiotechnology%22%5BJournal%5D)">Advances in imaging strategies for in vivo tracking of exosomes.</a> Wiley Interdisciplinary Reviews. Nanomedicine and Nanobiotechnology. 12 (2), 1594(2020).</li>
<li>Dehghani, M., Gaborski, T. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescent+labeling+of+extracellular+vesicles%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Enzymology%22%5BJournal%5D)">Fluorescent labeling of extracellular vesicles.</a> Methods in Enzymology. 645, 15-42 (2020).</li>
<li>González, M. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Covalently+labeled+fluorescent+exosomes+for+in+vitro+and+in+vivo+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Biomedicines%22%5BJournal%5D)">Covalently labeled fluorescent exosomes for in vitro and in vivo applications.</a> Biomedicines. 9 (1), 81(2021).</li>
<li>Chuo, S. T. -Y., Chien, J. C. -Y., Lai, C. P. -K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+extracellular+vesicles%3A+current+and+emerging+methods%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomedical+Science%22%5BJournal%5D)">Imaging extracellular vesicles: current and emerging methods.</a> Journal of Biomedical Science. 25 (1), 91(2018).</li>
<li>vander Vlist, E. J., Nolte-'tHoen, E. N. M., Stoorvogel, W., Arkesteijn, G. J. A., Wauben, M. H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescent+labeling+of+nano-sized+vesicles+released+by+cells+and+subsequent+quantitative+and+qualitative+analysis+by+high-resolution+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Fluorescent labeling of nano-sized vesicles released by cells and subsequent quantitative and qualitative analysis by high-resolution flow cytometry.</a> Nature Protocols. 7 (7), 1311-1326 (2012).</li>
<li>Hoshino, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumour+exosome+integrins+determine+organotropic+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Tumour exosome integrins determine organotropic metastasis.</a> Nature. 527 (7578), 329-335 (2015).</li>
<li>Heinrich, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Confocal+laser+scanning+microscopy+using+dialkylcarbocyanine+dyes+for+cell+tracing+in+hard+and+soft+biomaterials%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomedical+Materials+Research.+Part+B%2C+Applied+Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Confocal laser scanning microscopy using dialkylcarbocyanine dyes for cell tracing in hard and soft biomaterials.</a> Journal of Biomedical Materials Research. Part B, Applied Biomaterials. 81 (1), 153-161 (2007).</li>
<li>Haney, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exosomes+as+drug+delivery+vehicles+for+Parkinson%27s+disease+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Controlled+Release%22%5BJournal%5D)">Exosomes as drug delivery vehicles for Parkinson's disease therapy.</a> Journal of Controlled Release. 207, 18-30 (2015).</li>
<li>Grange, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biodistribution+of+mesenchymal+stem+cell-derived+extracellular+vesicles+in+a+model+of+acute+kidney+injury+monitored+by+optical+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Molecular+Medicine%22%5BJournal%5D)">Biodistribution of mesenchymal stem cell-derived extracellular vesicles in a model of acute kidney injury monitored by optical imaging.</a> International Journal of Molecular Medicine. 33 (5), 1055-1063 (2014).</li>
<li>Wiklander, O. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+vesicle+in+vivo+biodistribution+is+determined+by+cell+source%2C+route+of+administration+and+targeting%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Extracellular+Vesicles%22%5BJournal%5D)">Extracellular vesicle in vivo biodistribution is determined by cell source, route of administration and targeting.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 4, 26316(2015).</li>
<li>Lai, C. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualization+and+tracking+of+tumour+extracellular+vesicle+delivery+and+RNA+translation+using+multiplexed+reporters%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Visualization and tracking of tumour extracellular vesicle delivery and RNA translation using multiplexed reporters.</a> Nature Communications. 6 (1), 7029(2015).</li>
<li>Deddens, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circulating+extracellular+vesicles+contain+miRNAs+and+are+released+as+early+biomarkers+for+cardiac+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cardiovascular+Translational+Research%22%5BJournal%5D)">Circulating extracellular vesicles contain miRNAs and are released as early biomarkers for cardiac injury.</a> Journal of Cardiovascular Translational Research. 9 (4), 291-301 (2016).</li>
<li>Montecalvo, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanism+of+transfer+of+functional+microRNAs+between+mouse+dendritic+cells+via+exosomes%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Mechanism of transfer of functional microRNAs between mouse dendritic cells via exosomes.</a> Blood. 119 (3), 756-766 (2012).</li>
<li>Escrevente, C., Keller, S., Altevogt, P., Costa, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interaction+and+uptake+of+exosomes+by+ovarian+cancer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Cancer%22%5BJournal%5D)">Interaction and uptake of exosomes by ovarian cancer cells.</a> BMC Cancer. 11, 108(2011).</li>
<li>Cho, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+exosomes+and+ferritin+protein+nanocages+for+the+delivery+of+membrane+protein+therapeutics%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Controlled+Release%22%5BJournal%5D)">Comparison of exosomes and ferritin protein nanocages for the delivery of membrane protein therapeutics.</a> Journal of Controlled Release. 279, 326-335 (2018).</li>
<li>Mantel, P. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Malaria-infected+erythrocyte-derived+microvesicles+mediate+cellular+communication+within+the+parasite+population+and+with+the+host+immune+system%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Host+%26+Microbe%22%5BJournal%5D)">Malaria-infected erythrocyte-derived microvesicles mediate cellular communication within the parasite population and with the host immune system.</a> Cell Host & Microbe. 13 (5), 521-534 (2013).</li>
<li>Porro, C., Trotta, T., Panaro, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microvesicles+in+the+brain%3A+Biomarker%2C+messenger+or+mediator%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroimmunology%22%5BJournal%5D)">Microvesicles in the brain: Biomarker, messenger or mediator.</a> Journal of Neuroimmunology. 288, 70-78 (2015).</li>
<li>De Toro, J., Herschlik, L., Waldner, C., Mongini, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Emerging+roles+of+exosomes+in+normal+and+pathological+conditions%3A+new+insights+for+diagnosis+and+therapeutic+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Emerging roles of exosomes in normal and pathological conditions: new insights for diagnosis and therapeutic applications.</a> Frontiers in Immunology. 6, 203(2015).</li>
<li>Matsumoto, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transmission+of+alpha-synuclein-containing+erythrocyte-derived+extracellular+vesicles+across+the+blood-brain+barrier+via+adsorptive+mediated+transcytosis%3A+another+mechanism+for+initiation+and+progression+of+Parkinson%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Neuropathologica+Communications%22%5BJournal%5D)">Transmission of alpha-synuclein-containing erythrocyte-derived extracellular vesicles across the blood-brain barrier via adsorptive mediated transcytosis: another mechanism for initiation and progression of Parkinson's disease.</a> Acta Neuropathologica Communications. 5 (1), 71(2017).</li>
<li>Matsumoto, J., Stewart, T., Banks, W. A., Zhang, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+transport+mechanism+of+extracellular+vesicles+at+the+blood-brain+barrier%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Pharmaceutical+Design%22%5BJournal%5D)">The transport mechanism of extracellular vesicles at the blood-brain barrier.</a> Current Pharmaceutical Design. 23 (40), 6206-6214 (2017).</li>
<li>Shaimardanova, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+vesicles+in+the+diagnosis+and+treatment+of+central+nervous+system+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Neural+Regeneration+Research%22%5BJournal%5D)">Extracellular vesicles in the diagnosis and treatment of central nervous system diseases.</a> Neural Regeneration Research. 15 (4), 586-596 (2020).</li>
<li>Théry, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Minimal+information+for+studies+of+extracellular+vesicles+2018+%28MISEV2018%29%3A+a+position+statement+of+the+International+Society+for+Extracellular+Vesicles+and+update+of+the+MISEV2014+guidelines%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Extracellular+Vesicles%22%5BJournal%5D)">Minimal information for studies of extracellular vesicles 2018 (MISEV2018): a position statement of the International Society for Extracellular Vesicles and update of the MISEV2014 guidelines.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 7 (1), 1535750(2018).</li>
<li>Hoen, E. N. M. N. -t, et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+and+qualitative+flow+cytometric+analysis+of+nanosized+cell-derived+membrane+vesicles%5BTitle%5D)+AND+%22Nanomedicine%3A+Nanotechnology%2C+Biology+and+Medicine%22%5BJournal%5D)">Quantitative and qualitative flow cytometric analysis of nanosized cell-derived membrane vesicles.</a> Nanomedicine: Nanotechnology, Biology and Medicine. 8 (5), 712-720 (2012).</li>
<li>Gangadaran, P., Hong, C. M., Ahn, B. -C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+update+on+in+vivo+imaging+of+extracellular+vesicles+as+drug+delivery+vehicles%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">An update on in vivo imaging of extracellular vesicles as drug delivery vehicles.</a> Frontiers in Pharmacology. 9, 169(2018).</li>
<li>Teare, G. F., Horan, P. K., Slezak, S. E., Smith, C., Hay, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+tracking+of+lymphocytes+in+vivo%3A+the+migration+of+PKH-labeled+lymphocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+Immunology%22%5BJournal%5D)">Long-term tracking of lymphocytes in vivo: the migration of PKH-labeled lymphocytes.</a> Cellular Immunology. 134 (1), 157-170 (1991).</li>
<li>Kuffler, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+survival+and+sprouting+in+culture+by+motoneurons+isolated+from+the+spinal+cord+of+adult+frogs%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Comparative+Neurology%22%5BJournal%5D)">Long-term survival and sprouting in culture by motoneurons isolated from the spinal cord of adult frogs.</a> Journal of Comparative Neurology. 302 (4), 729-738 (1990).</li>
<li>Takov, K., Yellon, D. M., Davidson, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Confounding+factors+in+vesicle+uptake+studies+using+fluorescent+lipophilic+membrane+dyes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Extracellular+Vesicles%22%5BJournal%5D)">Confounding factors in vesicle uptake studies using fluorescent lipophilic membrane dyes.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 6 (1), 1388731(2017).</li>
<li>Pužar Dominkuš, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PKH26+labeling+of+extracellular+vesicles%3A+Characterization+and+cellular+internalization+of+contaminating+PKH26+nanoparticles%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+Biophysica+Acta.+Biomembranes%22%5BJournal%5D)">PKH26 labeling of extracellular vesicles: Characterization and cellular internalization of contaminating PKH26 nanoparticles.</a> Biochimica et Biophysica Acta. Biomembranes. 1860 (6), 1350-1361 (2018).</li>
<li>Dehghani, M., Gulvin, S. M., Flax, J., Gaborski, T. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systematic+evaluation+of+PKH+labelling+on+extracellular+vesicle+size+by+nanoparticle+tracking+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Systematic evaluation of PKH labelling on extracellular vesicle size by nanoparticle tracking analysis.</a> Scientific Reports. 10 (1), 9533(2020).</li>
<li>Shimomura, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+lipophilic+fluorescent+dyes+for+labeling+extracellular+vesicles%3A+characterization+and+monitoring+of+cellular+uptake%5BTitle%5D)+AND+%22Bioconjugate+Chemistry%22%5BJournal%5D)">New lipophilic fluorescent dyes for labeling extracellular vesicles: characterization and monitoring of cellular uptake.</a> Bioconjugate Chemistry. 32 (4), 680-684 (2021).</li>
<li>Yuan, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macrophage+exosomes+as+natural+nanocarriers+for+protein+delivery+to+inflamed+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Macrophage exosomes as natural nanocarriers for protein delivery to inflamed brain.</a> Biomaterials. 142, 1-12 (2017).</li>
<li>Polanco, J. C., Li, C., Durisic, N., Sullivan, R., Götz, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exosomes+taken+up+by+neurons+hijack+the+endosomal+pathway+to+spread+to+interconnected+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Neuropathologica+Communications%22%5BJournal%5D)">Exosomes taken up by neurons hijack the endosomal pathway to spread to interconnected neurons.</a> Acta Neuropathologica Communications. 6 (1), 10(2018).</li>
<li>Jurgielewicz, B. J., Yao, Y., Stice, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kinetics+and+specificity+of+HEK293T+extracellular+vesicle+uptake+using+imaging+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Nanoscale+Research+Letters%22%5BJournal%5D)">Kinetics and specificity of HEK293T extracellular vesicle uptake using imaging flow cytometry.</a> Nanoscale Research Letters. 15 (1), 170(2020).</li>
</ol>

作者声明无利益冲突。

在本方案中，我们展示了使用PKH染料对sEVs进行标记，并可视化其在脊髓中的摄取过程。PKH脂溶性荧光染料广泛用于通过流式细胞术和荧光显微镜对细胞进行标记3,5,6,12,24,25由于PKH染料具有相对较长的半衰期和较低的细胞毒性，可广泛用于多种 体内 和 体外 细胞追踪研究26,27尽管优异的膜保留性和生化稳定性具有优势，但荧光探针可能与伴随sEVs纯化的脂蛋白污染物发生嵌插，从而影响对sEV内化及功能研究结果的解读。因此，sEVs的纯化与标记是本方案中的关键步骤，因为染料若持续存在于污染物...

小细胞外囊泡（sEVs）是纳米级的膜源性囊泡，大小范围为50-150 nm。它们起源于多泡体（MVBs），当MVBs与细胞质膜融合时被释放到细胞外。sEVs含有miRNA、mRNA、蛋白质和生物活性脂质，这些分子以细胞间通讯的形式在细胞之间传递。sEVs可通过多种内吞途径被受体细胞摄取，而受体细胞对sEVs的捕获是由EVs表面分子与靶细胞表面分子之间的识别所介导的1。
小细胞外囊泡（sEVs）因其能够触发受体细胞的分子和表型变化、作为治疗剂的应用价值，以及作为货物分子或药理学试剂载体的潜力而受到广泛关注。由于其体积微小，对sEVs进行成像和追踪具有挑战性，尤其是在体内研究和临床环境中。因此，已开发出多种方法用于标记和成像sEVs，以辅助其在体外和体内2的生物分布与追踪。
研究sEV生物分布及其与靶细胞相互作用的最常用技术是用荧光染料分子对其进行标记3,4,5,6,7。最初，EVs使用常用于细胞成像的细胞膜染料进行标记。这些荧光染料通常可标记sEV上的脂质双分子层或目标蛋白。多种亲脂性染料在掺入细胞质后可产生强烈的荧光信号，包括DiR（1,1′-dioctadecyl-3,3,3′,3′-tetramethylindotricarbocyanine iodide）、DiL（1,1′-dioctadecyl-3,3,3′,3′-tetramethyl indocarbocyanine perchlorate）和DiD（1,1′-dioctadecyl-3,3,3′,3′-tetramethyl indocarbocyanine 4-chlorobenzenesulfonate salt）8,9,10,11。
其他疏水性染料（如PKH67和PKH26）具有高度荧光的极性头部基团和长链脂肪族烃尾部，可轻易插入任何脂质结构中，从而实现染料的长期滞留和稳定的荧光信号12。PKH染料也可用于标记细胞外囊泡（EVs），从而支持在活体（in vivo）条件下研究EV的特性13。此外，多种其他染料已被用于通过荧光显微镜和流式细胞术观察外泌体，包括脂质标记染料14以及细胞通透性染料，如羧基荧光素二乙酸盐琥珀酰亚胺酯（CFDA-SE）15,16和钙黄绿素乙酰氧基甲酯（AM酯）17。
关于小细胞外囊泡（sEV）介导中枢神经系统内不同细胞间相互作用的研究，为神经炎症性和神经退行性疾病的发病机制提供了重要见解18。例如，神经元来源的sEV可传播β-淀粉样肽和磷酸化tau蛋白，在阿尔茨海默病的发病过程中发挥促进作用19。此外，红细胞来源的细胞外囊泡（EV）含有大量α-突触核蛋白，能够穿越血脑屏障，参与帕金森病的病理过程20。sEV具有穿越生理屏障的能力21，并可将其携带的生物分子传递至靶细胞，因此可作为将治疗药物递送至中枢神经系统的便捷工具22。
在脊髓中可视化多种中枢神经系统细胞对sEV的摄取，将有助于开展机制研究，并评估来自不同细胞来源的外源性sEV治疗效果。本文描述了标记巨噬细胞来源sEV并成像其摄取过程的方法 体外 和 体内 通过神经元、小胶质细胞和星形胶质细胞在腰段脊髓中定性确认sEV的递送情况，以实现可视化验证。

<table><tbody><tr><td>Amicon Ultra 0.5 mL 离心过滤器</td><td>MilliporeSigma</td><td>Z677094</td><td></td></tr><tr><td>抗 Alix 抗体</td><td>Abcam</td><td>ab186429</td><td>1:1000</td></tr><tr><td>抗 Calnexin 抗体</td><td>Abcam</td><td>Ab10286</td><td>1:1000</td></tr><tr><td>抗 CD81 抗体</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-166029</td><td>1:1000</td></tr><tr><td>抗 GAPDH 单克隆抗体 (14C10)</td><td>Cell Signaling Technology</td><td>2118</td><td>1:1000</td></tr><tr><td>抗胶质纤维酸性蛋白抗体</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>MAB360</td><td>免疫荧光实验中 1:500；免疫组化实验中 1:1000</td></tr><tr><td>抗 Iba1 抗体</td><td>Wako</td><td>019-19741</td><td>1:2000</td></tr><tr><td>抗 MAP2A 抗体</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>MAB378</td><td>1:500</td></tr><tr><td>牛血清白蛋白 (BSA)</td><td>VWR</td><td>0332</td><td></td></tr><tr><td>细胞筛网，40 &amp;mu;m</td><td>VWR</td><td>15-1040-1</td><td></td></tr><tr><td>离心管</td><td>Thermo Scientific</td><td>3118-0050</td><td>12,000 x g</td></tr><tr><td>盖玻片，12 mm，#1.5</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>72230-01</td><td></td></tr><tr><td>盖玻片，18 mm，#1.5</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>72222-01</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D9542-1MG</td><td>1 &amp;micro;g/mL</td></tr><tr><td>DC 蛋白检测试剂盒</td><td>Bio-Rad</td><td>500-0116</td><td></td></tr><tr><td>脱氧核糖核酸酶 I (DNAse I)</td><td>MilliporeSigma</td><td>D4513-1VL</td><td></td></tr><tr><td>驴抗兔 IgG H&amp;L (HRP)</td><td>Abcam</td><td>ab16284</td><td>1:10000</td></tr><tr><td>驴抗兔 IgG H&amp;L，Alexa Fluor 488</td><td>Invitrogen</td><td>A-21206</td><td>1:500</td></tr><tr><td>双面磨砂显微镜载玻片，#1</td><td>Thermo Scientific</td><td>12-552-5</td><td></td></tr><tr><td>不含钙和镁的 DPBS</td><td>Corning</td><td>21-031-CV</td><td></td></tr><tr><td>杜尔贝科改良伊格尔培养基 (DMEM)</td><td>Corning</td><td>10-013-CV</td><td></td></tr><tr><td>无外泌体胎牛血清</td><td>Gibco</td><td>A27208-01</td><td></td></tr><tr><td>胎牛血清 (FBS)</td><td>Corning</td><td>35-011-CV</td><td></td></tr><tr><td>FluorChem M 成像系统</td><td>ProteinSimple</td><td></td><td></td></tr><tr><td>FV3000 共聚焦显微镜</td><td>Olympus</td><td></td><td></td></tr><tr><td>羊抗小鼠 IgG H&amp;L (HRP)</td><td>Abcam</td><td>ab6789</td><td>1:10000</td></tr><tr><td>羊抗小鼠 IgG H&amp;L，Alexa Fluor 488</td><td>Invitrogen</td><td>A-11001</td><td>1:500</td></tr><tr><td>羊抗小鼠 IgG1，Alexa Fluor 594</td><td>Invitrogen</td><td>A-21125</td><td>1:500</td></tr><tr><td>汉克平衡盐溶液 (HBSS)</td><td>VWR</td><td>02-0121</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Gibco</td><td>15630080</td><td></td></tr><tr><td>HRP 底物</td><td>Thermo Scientific</td><td>34094</td><td></td></tr><tr><td>Intercept 封闭缓冲液，TBS</td><td>LI-COR Biosciences</td><td>927-60001</td><td></td></tr><tr><td>Laemmli SDS 样品缓冲液</td><td>Alfa Aesar</td><td>AAJ61337AC</td><td></td></tr><tr><td>显微盖玻片，#1</td><td>VWR</td><td>48404-454</td><td></td></tr><tr><td>Microm HM550</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>NanoSight NS300 系统</td><td>Malvern Panalytical</td><td></td><td></td></tr><tr><td>NanoSight NTA 3.2 软件</td><td>Malvern Panalytical</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Neuro-2a 细胞系</td><td>ATCC</td><td>CCL-131</td><td></td></tr><tr><td>正常山羊血清</td><td>Vector Laboratories</td><td>S-1000</td><td></td></tr><tr><td>O.C.T. 包埋剂</td><td>Sakura Finetek</td><td>4583</td><td></td></tr><tr><td>木瓜蛋白酶</td><td>Worthington Biochemical Corporation</td><td>NC9597281</td><td></td></tr><tr><td>多聚甲醛</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>19210</td><td></td></tr><tr><td>青霉素-链霉素</td><td>Gibco</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>PKH26</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>MINI26-1KT</td><td></td></tr><tr><td>PKH67</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>MINI67-1KT</td><td></td></tr><tr><td>蛋白酶抑制剂混合物</td><td>Thermo Scientific</td><td>1862209</td><td></td></tr><tr><td>PVDF 转膜膜</td><td>MDI</td><td>SVFX8302XXXX101</td><td></td></tr><tr><td>RAW 267.4 细胞系</td><td>ATCC</td><td>TIB-71</td><td></td></tr><tr><td>RIPA 裂解缓冲液</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R0278</td><td></td></tr><tr><td>氯化钠</td><td>AMRESCO</td><td>0241-2.5KG</td><td></td></tr><tr><td>Superfrost Plus Gold 载玻片</td><td>Thermo Scientific</td><td>15-188-48</td><td>粘附载玻片</td></tr><tr><td>T-75 培养瓶</td><td>Corning</td><td>431464U</td><td></td></tr><tr><td>Tecnai 12 数字透射电子显微镜</td><td>FEI Company</td><td></td><td></td></tr><tr><td>透射电镜铜网</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>FSF300-cu</td><td></td></tr><tr><td>Tris-甘氨酸蛋白凝胶，12%</td><td>Invitrogen</td><td>XP00120BOX</td><td></td></tr><tr><td>Tris-甘氨酸 SDS 电泳缓冲液</td><td>Invitrogen</td><td>LC26755</td><td></td></tr><tr><td>Tris-甘氨酸转膜缓冲液</td><td>Invitrogen</td><td>LC3675</td><td></td></tr><tr><td>TrypLE Express</td><td>Gibco</td><td>12605028</td><td>细胞解离酶</td></tr><tr><td>吐温 X-100</td><td>Acros Organics</td><td>327371000</td><td></td></tr><tr><td>胰蛋白酶，0.25%</td><td>Corning</td><td>25-053-CL</td><td></td></tr><tr><td>吐温 20</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P1379</td><td></td></tr><tr><td>超速离心管</td><td>Beckman</td><td>344058</td><td>110,000 x g</td></tr></tbody></table>

荧光标记小型细胞外囊泡的摄取 体外 以及在脊髓中

Uptake of Fluorescent Labeled Small Extracellular Vesicles In Vitro and in Spinal Cord

小型细胞外囊泡（sEVs）是所有细胞分泌的、存在于体液中的50–150 nm囊泡。sEVs可将RNA、蛋白质和脂质等生物分子从供体细胞传递至受体细胞，因此在细胞间信号传导中发挥关键作用。在中枢神经系统（CNS）中，sEVs可介导包括神经免疫相互作用在内的细胞间信号交流。通过追踪标记的sEVs在受体细胞中的摄取情况，可研究sEVs的功能 体外 和 体内本文描述了使用PKH膜染料对RAW 264.7巨噬细胞条件培养基中的sEVs进行标记的方法，并展示了Neuro-2a细胞和原代星形胶质细胞在多个时间点对不同浓度标记sEVs的摄取情况 体外还展示了通过共聚焦显微镜观察到的经鞘内递送的sEVs在小鼠脊髓神经元、星形胶质细胞和小胶质细胞中的摄取情况。代表性结果表明不同细胞对sEVs的摄取具有时间依赖性差异，这有助于确认sEVs成功递送至脊髓。

通过离心法从RAW 264.7条件培养基中分离出sEVs后，采用NTA检测纯化sEVs的浓度和粒径分布。RAW 264.7来源的sEVs平均粒径为140 nm，峰值粒径为121.8 nm，表明光散射测量中大多数可检测颗粒的粒径位于外泌体或sEVs典型的50–150 nm范围内（图1A）。根据2018年细胞外囊泡研究最低信息标准（MISEV2018）23的建议，我们分析了一组应存在于或排除于不同EV群体中的蛋白质。对sEVs、细胞裂解液和去外泌体培养基进行的Western blot结果显示，sEV来源的蛋白样品中含有sEV标志物蛋白Alix、CD81和GAPDH。细胞裂解组分中富含内质网驻留蛋白calnexin，而该蛋白在sEVs中未被检测到。因此，calnexin可作为细胞污染的阴性标志物（图1B）。
接下来，我们对sEV的摄取进行了剂量反应和时间过程实验 体外. Neuro-2a 细胞与单次处理孵...

我们描述了一种使用PKH染料标记巨噬细胞来源的小细胞外囊泡并观察其摄取的实验方案 体外 鞘内给药后在脊髓中的分布。

小型细胞外囊泡（sEVs）是所有细胞分泌并存在于体液中的50–150 nm囊泡。sEVs可转移RNA等生物分子，……

通过可视化观察小细胞外囊泡（sEVs）被脊髓中不同细胞的摄取情况，可以确认sEVs递送是否成功。这有助于在啮齿类动物模型中开展针对鞘内给予的、来源于不同来源的sEVs的作用机制及治疗效果研究。本方案可用于观察sEVs在正常脊髓组织中被细胞摄取的过程，并有助于评估sEVs及其携带分子在脊髓相关疾病、疼痛和炎症中的作用。本实验步骤将由我以及 Dr. Seena Ajit 实验室的两名研究生 Xuan Luo 和 Zhucheng Lin 共同演示。首先，将 18 毫米的盖玻片放入 12 孔板中，然后在每个孔中接种 Neuro-2a 细胞，每孔加入 1 毫升含 10% FBS 和 1% 青霉素-链霉素的完全 DMEM 培养基。当细胞融合度达到 80% 至 90% 时，将各孔中的培养基更换为无外泌体的 DMEM 培养基，并在每孔中分别加入 1、5 或 10 微克标记的 sEVs。分别在1小时、4小时和24小时进行。按照等体积染料对照，对剩余孔进行剂量和时间依赖性摄取实验。将新生幼鼠脑组织置于含有冰冷的Hanks平衡盐溶液（添加10 mmol/L HEPES）的60毫米培养皿中，分离两侧大脑皮层并去除脑膜。然后用灭菌刀片将组织切碎。将组织转移至含有Pepane或脱氧核糖核酸酶I消化缓冲液的15毫升锥形管中，在37摄氏度下孵育20分钟，每5分钟轻轻摇动一次试管。吸除上清液后，向管中加入5毫升完全DMEM培养基。为终止酶活性，请小心操作，使用5毫升玻璃血清移液管和火焰抛光的巴斯德移液管充分吹打以解离组织。将细胞悬液通过40微米细胞筛，然后在4摄氏度下以250 × g离心5分钟，吸去上清液，并将细胞重悬于10毫升完全DMEM培养基中，接种至75平方厘米培养瓶。贴壁4小时后，更换上清液和培养基为15毫升新鲜DMEM培养基。体外培养14天后，为分离小胶质细胞和少突胶质细胞，将培养瓶置于320 RPM的摇床中振荡6小时。在37摄氏度下使用5毫升细胞解离酶处理10分钟。为了消化剩余的星形胶质细胞，加入5毫升完全DMEM以终止酶活性，然后在4摄氏度下以250 × g离心5分钟收集细胞。用完全DMEM重悬细胞，并将细胞接种至24孔板中直径为12毫米的1.5号盖玻片上。用 PBS 洗涤细胞 3 次，然后在室温下用 PBS 中 4% 多聚甲醛（PFA）固定 10 分钟。用 PBS 洗涤固定后的细胞 3 次，每次 5 分钟，并用 PBS 中 0.1% Triton X-100 透化处理 10 至 15 分钟。然后再次用 PBS 重复洗涤。使用 PBS 中含 5% 正常山羊血清（NGS）的溶液在室温下封闭细胞 1 小时；将神经-2a 细胞与微管相关蛋白 2（map two-way）抗体、原代星形胶质细胞与胶质纤维酸性蛋白（GFAP）抗体按 1:500 的比例溶于新鲜的含 5% NGS 的 PBS 中，在 4 摄氏度下避光轻摇孵育过夜。用 PBS 洗涤细胞 3 次后，加入荧光素标记的二抗，溶于含 5% NGS 的 PBS 中，在室温下避光于摇床孵育 2 小时。用 PBS 重复洗涤，并在室温下用每毫升 1 微克的 DAPI 孵育细胞 10 分钟。再次用 PBS 洗涤细胞 3 次。使用抗荧光淬灭封片剂将盖玻片封于 1 号载玻片上，置于暗处过夜干燥，并将制备好的玻片在 4 摄氏度保存，直至在共聚焦显微镜下成像。解剖脊髓，并在4%多聚甲醛（PFA）的PBS溶液中4摄氏度固定24小时。随后在4摄氏度下用30%蔗糖的PBS溶液保护组织24小时，或直至组织沉底，然后将组织在4摄氏度保存至进行免疫组织化学实验。将L4-L5节段脊髓包埋于OCT包埋剂中，然后置于干冰上冷冻至完全固化。使用冷冻切片机将组织切成30微米厚的切片，并将切片收集至含有PBS的24孔板中。用含0.3%Triton的PBS溶液清洗切片，每次5分钟，共清洗3次；在室温下用含5%MGS的0.3%Triton PBS溶液封闭非特异性结合位点，封闭2小时。将切片置于摇床上，于4摄氏度孵育过夜。用含0.3%Triton的PBS溶液清洗切片，每次5分钟，共清洗3次。然后加入适当浓度的二抗。根据文稿所述，在室温下孵育两小时，仅使用PBS洗涤切片，并在室温下用1微克/毫升的DAPI孵育10分钟。随后在光学显微镜下重复PBS洗涤步骤，用细毛笔将切片转移至透明粘附载玻片上封片。 用封片剂将盖玻片润湿后，在室温避光条件下过夜固化，随后使用共聚焦显微镜及相应的激光器采集图像。RA 2 6 4 0.7 来源的sEVs的平均粒径为140纳米，峰值粒径为121.8纳米，大多数可检测到的颗粒粒径位于外泌体或sEVs典型的50至150纳米范围内。对sEVs、细胞裂解液及外泌体耗竭培养基进行的Western blot分析表明，来源于sEVs的蛋白样品中含有sEV标志物蛋白Alix、CD81和GAPDH。细胞裂解液中富含内质网，其驻留蛋白Calnexin因此可作为细胞污染的阴性标志物，因为Calnexin在小细胞外囊泡（sEVs）中不存在。观察到sEVs的摄取在1小时即发生；对于1、5和10微克的sEVs，在孵育后4小时可检测到荧光信号；而对于4、5和10微克的sEVs，在孵育后4小时亦可检测到荧光。检测了原代星形胶质细胞对PKH26标记的sEVs的摄取情况，发现原代皮层星形胶质细胞对sEVs的摄取在24小时达到最大荧光信号；而在神经元、星形胶质细胞和小胶质细胞中，PKH26标记的sEVs在注射后6小时摄取量最大，并观察到最强荧光信号。通过设置对照组、未标记的小细胞外囊泡（sEVs）以及染料对照，可以消除因游离染料非特异性标记而产生的假阳性信号。可通过检测生物分子货物向受体细胞和组织的转移情况，以及分析生物分子或靶基因表达水平的变化，来确认sEVs的摄取。此外，还可进行行为学研究，以探讨sEV递送的功能性影响。

uptake-fluorescent-labeled-small-extracellular-vesicles-vitro-spinal

Research

科研

JoVE Journal

Neuroscience

神经科学

吸收荧光标记的小细胞外囊泡 在体外 和脊髓

我们介绍一种简单且低成本的技术，利用聚乙烯吸液移液管将高浓度的荧光染料和钙敏感染料引入神经元或任何神经纤维束中。...

逆行性荧光染料标记神经、传导束和脊神经根

在本视频中，我们展示了一种用于可视化并定量细胞摄取细胞外囊泡（EVs）的实验方法。该方法利用共聚焦显微镜进行三维荧光成像，能够区分被细胞内化的EVs与黏附在细胞表面的EVs。...

细胞外囊泡摄取实验：利用三维荧光成像技术可视化与定量细胞摄取细胞外囊泡的方法

本视频展示了如何用特定的荧光蛋白标记神经元囊泡，以观察其运动。首先，将编码荧光蛋白的质粒与转染试剂孵育，然后导入神经元培养物中。随后，采集并分析神经元的图像，以追踪囊泡的运动。...

使用荧光成像技术观察神经元中囊泡的运动性

一种用于小鼠脊髓成像的新型ex...

双光子成像技术观察小鼠脊髓中的细胞动态

通过将突触小泡蛋白与pHluorin融合后的光学显微镜检测以及突触小泡摄取的电子显微镜观察，可检测突触小泡的内吞作用。...

在培养的海马神经元中测量突触囊泡内吞作用

在这项工作中，我们描述了研究细胞外囊泡（EVs）释放作用的实验方案 恶性疟原虫...

疟疾感染期间细胞外囊泡功能的评估

本文介绍了一种用于标记血小板裂解物来源的细胞外囊泡的实验方案，以监测其在骨关节炎模型——软骨组织外植体中的迁移和摄取情况。...

用于监测软骨组织外泌体迁移与摄取的标记方法

描述了两种相关方法，用于可视化突触传递所需的亚细胞事件。这些方案通过活细胞成像技术，实现对突触前钙离子内流和突触囊泡膜融合动态过程的实时监测。 体外...

肌萎缩侧索硬化症模型中突触功能的实时荧光检测

细胞外囊泡（EVs）在细胞生物学和细胞间通讯中发挥重要作用。目前亟需实用的检测方法来可视化并定量分析细胞对EVs的摄取。本实验方案提出利用三维荧光成像技术进行EVs摄取检测。 通过 共聚焦显微镜，继以基于纳米过滤的微流控装置分离细胞外囊泡。...

细胞外囊泡摄取实验 通过 共聚焦显微镜成像分析

本视频演示了一种从E13大鼠背侧脊髓分离并培养联合神经元的方法。离体培养的联合神经元可用于研究轴突生长与导向的细胞和分子机制。...

从胚胎脊髓中分离和培养联合神经元

了解使用PKH染料标记巨噬细胞来源的小细胞外囊泡并在体外和脊髓内追踪其摄取的方法。该技术有助于研究sEVs在脊髓疼痛和炎症中的治疗潜力。

荧光标记小型细胞外囊泡的摄取体外以及在脊髓中

探索更多视频

荧光标记小型细胞外囊泡的摄取 体外 以及在脊髓中

探索更多视频

荧光标记小型细胞外囊泡的摄取体外以及在脊髓中