细菌中的RIBO-seq:NGS测序样本收集和库准备协议
August 7th, 2021
在这里，我们描述了细菌中RIBO-seq样品收集和制备的阶段。根据这些准则对图书馆进行排序，可以获得足够的数据，以便进行全面的生物信息分析。我们目前的协议很简单，使用标准的实验室设备，从裂解到获得库需要七天时间。
核糖体分析技术，也称为RIBO-seq，是目前研究体内蛋白质合成过程的最有效工具。这种方法的优点是它能够通过精确绘制核糖体的位置和数量来监控翻译。RIBO-seq 是基于这样一个事实，即核糖体通过与 mRNA 分子结合，保护核糖体消化后抄本的埋藏片段。
获得的片段称为核糖体脚印，可以按其来源的脚本进行测序和映射，从而确定核糖体的确切位置。同时，对 RIBO-seq 进行高吞吐量总 mRNA 测序，以提供参考点，并能够在数据分析期间比较来自 RIBO-seq 和 RNA-seq 的数据。在细胞收获之前，您可以选择在细菌培养中加入氯霉素，最终浓度为每毫升100微克，以抑制转化。
用抗生素孵育培养一分钟。如果收获时间比平时长，这一步骤很重要，因为翻译抑制允许延长样品采集时间。用预热过滤系统收集样品。
您可以引入摇动以模拟生长条件。当所有介质都通过膜时，停止过滤，但不允许滤镜完全干燥。使用预热消毒的铲子快速刮掉过滤盘上的细胞，收集细菌颗粒。
立即将整个勺子与收获的细胞放在充满液氮的 50 毫升管中。收获的颗粒应完全覆盖在液氮中。让颗粒彻底冻结，然后使用先前冷却的铲子排出冷冻细胞。
合上盖子，确保被刺穿。这一点很重要，因为液氮会导致封闭的容器因蒸发时的压力变化而爆炸。准备GMPP，DNA拭子，和新鲜的埃彭多夫管专用于利萨斯。
如有必要，加入氯霉素，准备裂解缓冲器。将每个样品的 500 微升裂解缓冲器分配到单独的 Eppendorf 管中，并将它们放在冰上。用实验室消毒剂和70%乙醇净化砂浆和虫害。
通过向砂浆中注入液氮来冷却砂浆和虫害。将冷冻细菌颗粒转移到预冷砂浆中，磨成粉末。加入大约一卷氧化铝，然后继续研磨。
在需要时浇注液氮，使砂浆、虫害和细胞保持冷却，不让砂浆的内容解冻。在使用之前，将 GMPPNP 和 DNA 拭子添加到裂解缓冲液中。将溶液转移到迫击炮中，继续研磨。
磨碎时让莱萨慢慢解冻。当莱萨斯完全解冻时，将混合物转移到预冷的埃彭多夫管中，然后返回冰层。离心解体在2万G下，在4摄氏度下5分钟。
将超自然人转移到新鲜、预冷的埃彭多夫管中，并把它们放在冰上。用纳米滴测量每个稀释样品中的RNA浓度。将每个裂解水分成两部分，0.5 至 1 毫克的 RNA 用于 RIBO-seq，其余部分用于 RNA-seq。
在 RNA 的一毫克中，在 Tris pH 8 中加入 3.8 微升 MNase，然后用裂解缓冲器充值至 500 微升的总体积。在25摄氏度下孵化，每分钟300发子弹，45分钟。孵化完成后，使用市售的 RNA 清理套件清洁样品。
用8个摩尔尿素准备15%多丙烯酰胺TBE凝胶，并将其放置在带有TBE缓冲器的罐中。在200伏特的恒定电压下至少预运行10分钟。将样品与 TBE-尿素样品缓冲区混合。
在95摄氏度下一分钟，并立即把它们放在冰上。使用注射器将 TBE 缓冲器注入凝胶井，洗净尿素。加载样品，在样品之间留出一口井空间，以分离每个样品并防止交叉污染。
使用 29 个核苷酸长寡头，以及 26 和 32 个核苷酸长寡头作为标记。以180伏的恒定电压运行电泳。为夜间孵化准备无菌缓冲器。
电泳完成后，用 SYBR 金染色凝胶。用无菌针头或剃须刀片将凝胶碎片在 26 到 32 个核苷酸之间，并将凝胶碎片放在单独的 Eppendorf 管中。在样品之间更换针头或剃须刀刀片。
在每个 Eppendorf 中加入 200 微升隔夜孵化缓冲器，并在 10 摄氏度（每分钟 1000 发）的夜间孵化样品中孵化。第二天，用RNA清理包清洁样品，并在18微升无核糖水中清除它们。获得的核糖体足迹已准备好供图书馆准备。
使用市售套件为RNA-seq样品执行核糖核接下来，用RNA清理套件清洁样品。进行碱性水解:准备碱性水解缓冲器，将一个体积的缓冲器添加到样品的一个体积中，在95摄氏度下孵育25分钟。
在每个样品中加入5微升3摩尔醋酸钠pH 5.5，以阻止反应。用RNA清洁套件清洁样品，并在18微升无核糖水中清除样本。获得的随机碎片RNA已准备好准备库。
在每个样品中加入10微升10倍反应缓冲器和5微升T4多核苷酸激酶。在37摄氏度下孵化一个半小时。在此之后，加入三微升一毫升ATP，在37摄氏度下孵育一小时。
接下来，用RNA清理套件清洁样品。根据此处提供的协议，使用市售工具包进行图书馆准备。使用 6% 聚丙烯酰胺凝胶执行 PAGE。
用 SYBR 黄金染色凝胶。含有库的凝胶片段。对于RNA-seq样品，库在135至180核苷酸之间，对于RIBO-seq，在135至170核苷酸之间。
使用无菌针头或剃须刀刀片，将切口的凝胶碎片放在单独的埃彭多夫管中。请记住在样品之间更换针头或剃须刀刀片。在每个切除的凝胶碎片中加入 100 微升无核糖水。
并在10摄氏度，每分钟450发子弹，一夜之间孵育它们。第二天，用DNA清理包清洗样品。获得库准备了高灵敏度、DNA片上电泳和下一代测序的质量和数量控制。
由此产生的 cDNA 库提出了下一代测序所需的适当数量和质量，通过高灵敏度DNA片上电泳验证。与代表 RNA-seq 库的频段和峰值相比，代表 RIBO-seq 库的波段和峰值更窄、定义更好。根据片上电泳，库具有预期的镜头。
RIBO-seq 库中存在的接近 200 个碱基对的额外峰值可能表示冬眠核糖体，而不是完全消化的核糖体足迹，或人工制品（例如 rRNA），并且在生物信息分析过程中丢弃，当从测序中获得的数据被修剪并过滤 rRNA tRNA 时。图书馆制备中产生的 cDNA 平均数量为 32 毫微克，为下一代测序提供了足够的材料。经过片上电泳的质量控制后，库被拉到 Illumina 的下一个 Seq 500 平台上进行单基和 50 碱基对测序。
修剪适配器和劣质序列导致 RNA-seq 样本每个样本读取 2500 万到 4700 万读数，RIBO-seq 样本每个样本读数为 2500 万到 5000 万读数。获得的数据是与 FastQC 一起进行质量控制检查的。RNA-seq 和 RIBO-seq 样品的质量都非常好。
根据所述协议编制的库映射为RNA-seq样本的每个样本产生了240万至960万张唯一映射读数，为RIBO-seq样本生成了230万至1040万张唯一映射读数。RIBO-seq 数据表现出三倍的周期性和高大狭窄的峰值，与核糖体足迹的启动和特征相对应，这在 RNA-seq 数据中未观察到。此外，显示编码序列中核糖体足迹和 mRNA 片段平均覆盖范围的图谱图显示了 RIBO-seq 数据集中映射到 CDS 的读数比例较高，如预期的那样。
与根据标准 RIBO-seq 程序进行的同一实验的结果相比，映射的核糖体脚印的可视化显示非常相似的模式，该实验包括蔗糖梯度超中心化的单体恢复。我们的协议已经用于研究各种生长条件下的翻译规则，但可用于研究翻译的其他方面，如翻译启动站点的检测和新型蛋白质编码基因。根据我们的指南对图书馆进行排序，可以获得足够的数据，以便进行全面的生物信息分析。
我们在这里展示的协议是快速，简单，经济高效，可以用标准的实验室设备执行。
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概述
本文详细介绍了细菌中RIBO-seq的样本采集和准备阶段。该协议简单明了，使用标准实验室设备，并在七天内产生足够的数据，以进行全面的生物信息学分析。
关键研究组成部分
科学领域
- 神经科学
- 生物学
- 基因组学
背景
- RIBO-seq是一种用于研究体内蛋白质合成的强大技术。
- 该方法允许精确映射mRNA上的核糖体位置。
- 核糖体足迹是通过核糖核酸酶消化mRNA产生的。
- 高通量mRNA测序与RIBO-seq一起进行以进行比较分析。
研究目的
- 提供细菌中RIBO-seq样本准备的详细协议。
- 促进核糖体数据的全面生物信息学分析。
- 增进对细菌细胞翻译过程的理解。
使用的方法
- 从细菌培养中收集样本。
- 准备RIBO-seq的文库。
- 测序核糖体足迹。
- 与总mRNA测序数据进行比较。
主要结果
- 该协议产生足够的数据进行分析。
- RIBO-seq有效地映射mRNA上的核糖体位置。
- RIBO-seq的数据可以与RNA-seq结果进行比较。
- 该方法高效且可重复。
结论
- 所呈现的协议简化了RIBO-seq的准备。
- 它可以在七天内从裂解到文库获取完成。
- 该技术增强了对细菌中蛋白质合成的研究。
常见问题
Executive Industry Relevance
RIBO-seq enables precise mapping of ribosome positions on mRNA, providing direct insight into translational dynamics in bacterial systems. This capability supports target validation by revealing condition-specific translation patterns that may correlate with gene essentiality or pathway activity. The method’s compatibility with standard laboratory equipment and streamlined workflow reduces barriers to adoption in early discovery pipelines focused on mechanistic de-risking.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by mapping ribosome occupancy to assess translational control under varying growth conditions.
- Operational Value: Supports biological de-risking through quantitative, genome-wide measurement of translational activity without requiring specialized infrastructure.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates ribosome footprint data suitable for preparing standardized inputs in downstream screening workflows.
- Operational Value: Utilizes polyacrylamide gel electrophoresis and commercial small RNA kits, enabling assay reproducibility and scalability across sample sets.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Provides disease-relevant system insights by linking translational profiles to bacterial physiology under stress or nutrient conditions.
- Operational Value: Facilitates continuity from discovery to preclinical validation by delivering comparable RIBO-seq and RNA-seq data for integrated analysis.
Pipeline & Workflow Integration
RIBO-seq fits within the discovery continuum by informing target confidence prior to lead identification, particularly in antimicrobial or metabolic pathway projects.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification through precise ribosome mapping that reflects translational efficiency and initiation events.
- Screening: Enables assay readiness by producing quantifiable ribosomal footprint libraries compatible with next-generation sequencing platforms.
- Analytics: Delivers dependent variable measurements (e.g., footprint density, periodicity) that allow comparison of translational states across conditions.
- Translational Research: Connects to preclinical continuity via paired RIBO-seq and RNA-seq data, supporting biomarker alignment and mechanism-of-action de-risking.
- Enterprise Reuse: Represents a reusable capability for studying translation regulation across multiple bacterial strains or growth conditions.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Enhances predictive confidence by reducing ambiguity in transcriptional vs. translational regulation.
- Operational Value: Delivers standardization and reproducibility through defined sample collection, lysis, and footprint excision steps.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by providing mechanistic insight into target engagement and pathway modulation.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of targets based on translational essentiality under relevant physiological conditions.
Implementation Considerations
- Requires expertise in bacterial culture handling, RNA integrity maintenance, and nuclease digestion optimization.
- Depends on access to liquid nitrogen for sample preservation, mortar and pestle for mechanical lysis, and electrophoresis equipment for footprint separation.
- Necessitates cross-team standardization of harvesting timing, chloramphenicol pretreatment, and gel excision procedures to minimize variability.
- Involves adaptation considerations when applying the protocol to different bacterial species with varying cell wall structures or growth rates.
- Includes practical limitations such as the need for rapid processing to prevent ribosome runoff and the dependence on RNA quality for downstream library yield.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:00
Introduciton
0:54
Cell Harvesting and Lysis
4:13
MNase Digestion and Size Selection of Samples for RIBO-seq
6:17
rRNA Depletion and Alkaline Fragmentation of Samples for RNA-seq
7:07
Library Preparation and Size Selection of cDNA Libraries
8:49
Results: Quality of cDNA Libraries and Reads
11:31
Conclusion
