Name: 细菌中的RIBO-seq:NGS测序样本收集和库准备协议 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-08-07T14:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 5 s
Description: 学习细菌RIBO-seq样本收集与文库制备的完整流程，利用标准实验设备在七天内完成裂解到文库获取。该方法可精确定位核糖体在mRNA上的位置，为蛋白质合成研究提供高通量测序数据支持。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

ALS 要感谢欧洲分子生物学组织（EMBO）启动资助项目 IG 3914 以及在波兰科学基金会“第一团队”计划内实施的 POIR.04.04.00-00-3E9C/17-00 项目提供的财政支持，该计划由欧洲区域发展基金资助的欧洲联盟共同资助。

1. 样本收集
<ol>
	<li>准备细菌培养物。建议每个样本使用 100 mL 培养体积。</li>
	<li>准备样品采集所需的设备和试剂：每个样品准备两把刮勺、无菌 0.45 &#181;m 混合纤维素酯膜（MCE）滤膜，50 mL 无菌离心管，液氮，70%（体积/体积）乙醇中的 50 mg/mL 氯霉素（可选）。在 50 mL 离心管盖上打孔，以允许液氮蒸发，防止密闭管爆炸。用实验室洗涤剂和 70% 乙醇对刮勺进行去污处理。</li>
	<li>将过滤装置和其中一把刮勺预热至细菌培养物的生长温度。 
	注意：我们推荐使用全玻璃过滤装置，包括漏斗、烧结底座、磨口烧瓶和47 mm &#216; 弹簧夹</li>
	<li>样品收获前，将氯霉素加入细菌培养物中，使其终浓度为 100 &#181;g/mL，孵育1分钟（可选）。</li>
	<li>将液氮倒入50 mL无菌离心管中，并将第二把刮勺放入管内冷却。 
	警告！液氮蒸发时产生的压力变化可能导致密闭容器爆炸。为防止此类情况发生，必须在50 mL离心管的管盖上预先打几个孔，以允许液氮蒸发。</li>
	<li>通过过滤收集细胞。当培养基完全滤过膜后停止过滤，但不要让滤膜完全干燥。</li>
	<li>使用预热的刮勺快速将细胞从滤膜上刮下，收集细菌沉淀物。立即将带有收获细胞的整个刮勺放入装有液氮的50 mL离心管中。收集的沉淀物应完全浸没在液氮中。</li>
	<li>让沉淀充分冷冻，使用预先冷却的第二把刮勺撬下冷冻的细胞。盖上已穿孔的管盖，将试管转移至 -80&#176;C. 停止点 
	&#8203;注意：每次样品采集后需对刮勺进行消毒。</li>
</ol>
2. 细胞裂解
<ol>
	<li>准备 0.1 M GMP-PNP（溶于 10 mM Tris pH 8）、DNase I 以及 1.5 mL 离心管用于裂解液，置于冰上。将离心机预冷至 4 °C。</li>
	<li>配制裂解缓冲液（20 mM TRIS pH 7.6，10 mM MgAcet，150 mM KAcet，0.4% TRITON X-100，6 mM β-巯基乙醇，5 mM CaCl2，可选添加 1 mM 氯霉素）。按每份样品 500 µL 将裂解缓冲液分装至 1.5 mL 离心管中，并置于冰上。</li>
	<li>用实验室洗涤剂和 70% 乙醇对研钵和研杵进行去污处理，并晾干。将液氮倒入研钵中，对研钵和研杵进行预冷。</li>
	<li>将冷冻的菌体沉淀转移至预冷的研钵中，研磨成粉末。用刮刀加入约等体积的氧化铝，继续研磨。根据需要向研钵中倒入液氮，保持研钵、研杵和细胞处于低温状态，防止内容物融化。</li>
	<li>在使用裂解缓冲液前，向每份裂解缓冲液中加入 GMP-PNP 和 DNase I，使其终浓度分别为 2 mM 和 100 U/mL。将该溶液转移至含有细胞和氧化铝的研钵中，继续研磨。在研磨过程中让裂解液缓慢融化，随后将混合物转移至预冷的 1.5 mL 离心管中，并立即置于冰上。</li>
	<li>在 4 °C 下以 20 000 x g 离心 5 分钟，收集上清液，转移至新的预冷 1.5 mL 离心管中，并置于冰上保存。</li>
	<li>使用 NanoDrop 测定各样品的 RNA 浓度。样品和裂解缓冲液均用无核酸酶水稀释 10 倍作为空白对照。 
	注意：氯霉素在 260 nm 处有显著吸收。</li>
	<li>将每份裂解液分为两部分：一部分用于 RIBO-seq（含 0.5 - 1 mg RNA），另一部分用于 RNA-seq（剩余部分）。</li>
	<li>根据试剂盒说明书，使用市售 RNA 纯化试剂盒对 RNA-seq 样品进行纯化处理。 
	&#8203;建议：推荐使用 Zymo RNA Clean &amp;#38; Concentrate -25 试剂盒（参见材料表）。我们还建议在样品与结合缓冲液的混合物中加入 4.5 倍体积的乙醇（相对于样品体积），以提高对短 RNA 片段（包括核糖体足迹和断裂的 mRNA）的纯化效率。</li>
	<li>将用于 RNA-seq 的样品在 -80 °C 保存。RNA-seq 的后续操作从第 5 步继续进行。</li>
</ol>
3. RIBO-seq 样品的 MNase 消化
<ol>
	<li>向 1 mg RNA 中加入 3.8 µL 浓度为 187.5 U/µL 的 MNase（溶于 10 mM Tris pH 8），再用裂解缓冲液补至总体积为 500 µL。</li>
	<li>在 25 °C、300 RPM 条件下于恒温混匀仪中孵育 45 分钟。</li>
	<li>使用市售的 RNA 纯化试剂盒对样品进行纯化（同步骤 2.9）。</li>
	<li>将用于 RIBO-seq 的样品储存于 -80 °C（停止点），或继续进行片段大小选择。</li>
</ol>
4. 聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）及RIBO-seq样品的尺寸筛选
<ol>
	<li>配制含8 M尿素的15%聚丙烯酰胺-TBE凝胶，并将其放入装有TBE缓冲液的电泳槽中。以200 V恒定电压预电泳至少10分钟。</li>
	<li>将样品与TBE-尿素上样缓冲液混合，在95 °C下变性1分钟，立即置于冰上。</li>
	<li>使用注射器向凝胶加样孔中注入TBE缓冲液以洗去尿素。加样时每个样品之间留出一个加样孔的间隔，以实现样品分离并防止交叉污染。使用29 nt寡核苷酸以及26 nt和32 nt寡核苷酸的混合物作为分子量标记。以180 V恒定电压进行电泳。</li>
	<li>配制用于过夜孵育的无菌缓冲液（5 mM EDTA，10 mM NaOAc pH 5）。</li>
	<li>电泳结束后，将凝胶浸入SYBR Gold染色液中染色约2–3分钟，然后用无核酸酶水冲洗凝胶。</li>
	<li>使用无菌针头或&#160;刀片切下26至32 nt之间的凝胶条带，将凝胶碎片分别放入各样品对应的1.5 mL离心管中。每处理一个样品后需更换针头或刀片。</li>
	<li>向每个反应管中加入200 µL过夜孵育缓冲液。</li>
	<li>在恒温混匀仪中以10 °C、1000 RPM转速孵育过夜。</li>
	<li>次日，按步骤2.9的方法对样品进行纯化。用80 µL无核酸酶水洗脱核糖体保护片段。</li>
	<li>将样品储存于-80 °C。暂停点。RIBO-seq实验将从步骤7继续进行。</li>
</ol>
5. 通过rRNA耗竭法从RNA-seq样品中纯化细菌mRNA
<ol>
	<li>使用细菌mRNA纯化试剂盒（例如Invitrogen MICROBExpress）从样品中去除rRNA。按照制造商的说明书操作。</li>
	<li>参照步骤2.9清洗样品。用50 µL无核酸酶水洗脱mRNA。</li>
	<li>将用于RNA-seq的样品在-80 °C保存（停止点），或继续进行碱性片段化。</li>
</ol>
6. RNA-seq 样品的碱性片段化
<ol>
	<li>配制碱性水解缓冲液（混合 220 µL 的 0.1 M NaHCO3、30 µL 的 0.1 M Na2CO3 和 1 µL 的 0.5 M EDTA）。取 1 体积（50 µL）碱性缓冲液与 1 体积（50 µL）样品混合，于 95 °C 孵育 25 分钟。</li>
	<li>加入 5 µL 的 3 M NaOAc（pH 5.5）以终止反应。</li>
	<li>按照步骤 2.9 的方法纯化样品，并用 80 µL 无核酸酶水洗脱样品。</li>
	<li>可选暂停点：可将 RNA-seq 样品储存于 -80 °C。但我们建议直接进入步骤 7，以避免不必要的冻融过程。</li>
</ol>
7. RNA-seq与RIBO-seq样品的去磷酸化与磷酸化处理
<ol>
	<li>向每个样品中加入 10 µL 10x PNK 反应缓冲液和 5 µL T4 PNK。在 37 °C 下孵育 1.5 小时，以去磷酸化 3' 末端。</li>
	<li>加入 3 µL 1 mM ATP，并在 37 °C 下孵育 1 小时，以磷酸化 5' 末端。</li>
	<li>按照步骤 2.9 的方法纯化样品，用 30 µL 无核酸酶水中洗脱。</li>
	<li>将样品储存在 -80 °C。暂停点。</li>
</ol>
8. 使用 NEBNext Multiplex Small RNA 文库构建试剂盒（Illumina）进行文库制备
<ol>
	<li>在 6 µL 无核酸酶的水中加入 100-1000 ng 的输入 RNA（获得的 mRNA 片段和核糖体足迹片段），再加入 1 µL 的 3' SR 接头。按照制造商的方案进行孵育。</li>
	<li>加入 10 µL 的 3' 连接反应缓冲液（2X）和 3 µL 的 3' 连接酶混合物，在 37 °C 下孵育 2.5 小时，而不是按照制造商方案中指定的 25 °C 下孵育 1 小时。</li>
	<li>按照制造商的方案进行逆转录引物的杂交，但采用修改后的程序：75 °C 下 5 分钟，37 °C 下 30 分钟，然后保持在 4 °C。</li>
	<li>连接 5' SR 接头。遵循制造商的方案，但进行一处修改：在 37 °C 下孵育 2.5 小时，而不是在 25 °C 下孵育 1 小时。</li>
	<li>按照制造商的方案进行逆转录反应。</li>
	<li>可能的暂停点：将含有合成 cDNA 的样品在 70 °C 下孵育 15 分钟以灭活逆转录酶，然后储存在 -80 °C。但我们建议直接进入下一步操作，以避免样品不必要的反复冻融。</li>
	<li>将每个 cDNA 文库的一半保存在 -80 °C 作为备份。</li>
	<li>按照制造商的方案进行 PCR 扩增。使用反应体系的一半量。将获得的文库储存在 -80 °C。此为暂停点。</li>
</ol>
9. 使用聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）对cDNA文库进行片段大小筛选
<ol>
	<li>配制6%聚丙烯酰胺-TBE凝胶，并将其放入含有TBE缓冲液的电泳槽中。以200 V恒定电压预电泳至少10分钟。</li>
	<li>将样品与上样染料（蓝色，6×）混合后上样至凝胶。使用Quick-Load pBR322 DNA-MspI消化产物作为DNA标记物。初始阶段以120 V恒定电压进行电泳，使DNA进入凝胶，随后将电压调整为180 V。</li>
	<li>电泳结束后，将凝胶置于SYBR Gold染色液中染色约2–3分钟，然后用无核酸酶水冲洗凝胶。</li>
	<li>切取含有文库的凝胶片段。对于RNA-seq样品，切取135–180 nt范围的条带；对于RIBO-seq样品，切取135–170 nt范围的条带。使用无菌针头或刀片进行切胶，并将切下的凝胶片段分别放入1.5 mL离心管中。注意在处理不同样品之间更换针头或刀片。 
	注意：Illumina平台使用的NEBNext多重小RNA文库构建试剂盒中的接头和条形码总长度为119 nt，因此确定了切胶的下限位置。</li>
	<li>向每份切下的凝胶片段中加入100 µL无核酸酶水。</li>
	<li>将凝胶片段置于恒温混匀仪中，在10 °C、450 RPM条件下过夜孵育。</li>
	<li>按照生产商说明书，使用商业化DNA纯化试剂盒对cDNA文库进行纯化和浓缩。 
	注意：我们推荐使用Zymo DNA Clean &amp;#38; Concentrate -5试剂盒（见材料表）。</li>
	<li>将纯化后的cDNA文库储存于-80 °C。此为暂停点。</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

核糖体谱分析（ribosome profiling）的关键技术难点在于需要快速抑制翻译过程，以捕获特定生理状态下mRNA上核糖体的瞬时分布。为实现这一目标，通常采用翻译抑制剂、快速收集细胞以及液氮速冻的方法。使用抗生素是可选步骤，因为它们可能引入人为假象。氯霉素（chloramphenicol, CAM）是细菌RIBO-seq中常用的一种药物，用于阻滞正在延伸的核糖体。然而，它不能阻止翻译起始，导致在翻译起始位点下游约六个密码子处出现核糖体堆积14。此外，其抑制肽基转移酶反应的能力可能依赖于核糖体P位和A位底物的性质。据推测，当新生肽链的倒数第二个氨基酸为甘氨酸（Gly）、丙氨酸（Ala）、丝氨酸（Ser）、半胱氨酸（Cys）或苏氨酸（Thr）时，CAM对核糖体的阻滞作用更强17,38,50。这一点在实验设计和生物信息学分析中尤其值得考虑，特别是在研究核糖体暂停（ribosomal pausing）时<s...

核糖体谱分析技术（RIBO-seq）由加州大学旧金山分校 Jonathan Weissman 实验室开发1。与其他用于研究翻译水平基因表达的方法相比，RIBO-seq 聚焦于每个与 mRNA 结合的核糖体，提供其在转录本上的位置以及核糖体相对数量的信息。该技术能够 in vivo 监测蛋白质合成过程，并可实现单密码子分辨率和高精确度，从而测量单个 mRNA 上以及细胞整个转录组中核糖体的密度。RIBO-seq 技术的基础在于：在翻译过程中，核糖体结合 mRNA 分子，从而保护其内部的转录片段免受核糖核酸酶的降解。加入核糖核酸酶后，未受保护的 mRNA 被消化，而被核糖体包裹的片段——通常长约 ~28–30 nt——则保持完整。这些片段被称为核糖体足迹（RF），可被分离、测序并比对至其来源的转录本，从而精确定位核糖体的位置。事实上，利用核糖体保护 mRNA 片段的特性自 20 世纪 60 年代起已被用于研究核糖体结合位点和翻译起始位点（TIS）2,3,4。然而，随着深度测序技术的进步，RIBO-seq 已成为翻译过程监测的金标准5，通过核糖体占据情况，可提供全基因组范围内的蛋白质合成信息6。核糖体谱分析填补了转录组与蛋白质组定量之间的技术空白6。
为了进行核糖体谱分析，我们需要获取在研究条件下生长的生物体的细胞裂解液。在细胞收集和裂解过程中若破坏这些条件，可能导致数据不可靠。为避免此问题，通常使用翻译抑制剂、快速收获以及液氮中瞬时冷冻的方法。细胞可通过机械匀浆器（如混合研磨仪7,8）或珠击破碎仪9进行低温研磨裂解，也可通过移液管反复吹打10或针头穿刺实现裂解11。裂解缓冲液可在细胞粉碎前或粉碎后立即加入。在本方案中，我们使用液氮预冷研钵和研杵，并采用氧化铝作为更温和的细菌细胞壁破碎方式，以避免超声处理等方法常导致的RNA剪切。粉碎后，我们将冰冻的裂解缓冲液加入已冷却的研钵内容物中。选择合适的裂解缓冲液对于获得最佳核糖体足迹分辨率至关重要。由于离子强度会影响核糖体足迹（RF）的大小以及读码框的精确性，目前建议使用低离子强度且缓冲能力较弱的裂解缓冲液，即使已有研究表明缓冲液组成可能不影响mRNA上的核糖体占据率11,12。裂解缓冲液的重要组分包括镁离子，其存在可防止核糖体亚基解离，并抑制细菌核糖体的自发构象变化11,13。钙离子也发挥重要作用，是细菌核糖体谱分析中所使用的微球菌核酸酶（MNase）活性所必需的14。在裂解过程中加入氯霉素以及鸟苷5′-[β,γ-亚氨基]三磷酸（GMP-PNP）——一种不可水解的GTP类似物——可有效抑制翻译过程15。
获得裂解液后，通过离心澄清，并将其分为两份，分别用于RIBO-seq和高通量总mRNA测序（RNA-seq），因为这两项实验是同时进行的（图1）。RNA-seq提供了一个参考基准，使得在数据分析过程中能够对RIBO-seq和RNA-seq的数据进行比较。所研究的翻译组通过将核糖体足迹数据归一化至mRNA丰度来确定16。此外，RNA-seq数据还有助于识别克隆或测序过程中产生的假象17。
<img alt="核糖体谱分析示意图：核酸消化、mRNA纯化、片段化过程。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62544/62544fig01.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="图1"> 
图1。RIBO-seq和RNA-seq的mRNA样品制备示意图。 在RIBO-seq文库构建中，RNA经MNase消化（A），随后进行大小筛选，获得约28-30 nt长度的核糖体保护片段（RF）（B）；在RNA-seq中，RNA被分离（C），去除rRNA（D），所得mRNA被随机打断为不同长度的片段（E）。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62544/62544fig01large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
RIBO-seq 和 RNA-seq 样本制备流程的初始步骤略有不同（图1）。在核糖体图谱分析中，需要使用特定的内切核酸酶对裂解液进行消化，以降解未被核糖体保护的 mRNA 分子。在标准方案中，通常通过蔗糖垫超速离心或蔗糖梯度超速离心来回收获得的单体核糖体8,14。本文表明，在细菌中分离 RIBO-seq 所需的核糖体复合物（RF）时，该步骤并非必需，真核细胞中同样如此18，只需从聚丙烯酰胺凝胶中对适当长度的 mRNA 片段进行大小选择即可。
对于RNA测序，首先通过去除总RNA中的rRNA来获得mRNA——rRNA分子与生物素标记的寡核苷酸探针杂交，这些探针会结合到链霉亲和素包被的磁珠上。随后使用磁铁将rRNA-寡核苷酸-磁珠复合物从样品中移除，从而获得rRNA耗竭的样品19,20。纯化的mRNA分子随后通过碱性水解随机片段化。所获得的mRNA片段以及核糖体足迹片段均被转化为cDNA文库，并准备进行深度测序（图2）。该过程包括碱性水解（针对mRNA）和酶消化（针对RF）后所需的末端修复：先进行3'端去磷酸化，再进行5'端磷酸化。接下来是接头连接以及逆转录，以生成两端含有适用于Illumina平台下一代测序（NGS）所需序列的cDNA插入片段。文库构建的最后阶段是PCR反应，在此过程中对构建体进行扩增，并添加样本特异性的条形码标签，以便实现多重检测，并在同一通道中对多个样本进行测序。测序前，通过高灵敏度DNA芯片电泳评估文库的质量和数量。符合参数要求的cDNA文库可被混合后进行测序。测序可在不同的Illumina平台上进行，例如MiSeq、NextSeq或HighSeq，具体选择取决于文库数量、所需的读长和测序深度。测序完成后，进行生物信息学分析。
<img alt="RNA测序流程，mRNA分离、磷酸化、连接、转录、PCR示意图。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62544/62544fig02.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="图2"> 
图2．文库构建。 文库构建包括末端修复、接头连接、逆转录以及带有条形码的扩增。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62544/62544fig02large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
核糖体谱分析是一种通用方法，可根据科学问题轻松进行修改和调整。该方法最初应用于酵母1，随后很快被用于细菌细胞21，以及包括小鼠10、斑马鱼22、果蝇23和拟南芥Arabidopsis thaliana24在内的真核模式生物。该技术也被用于研究不同类型的核糖体：细胞质核糖体、线粒体核糖体25,26和叶绿体核糖体27,28。在真核生物中，RIBO-seq 通常经过改进和优化，以研究翻译过程的特定方面，包括翻译起始10,11,29,30,31,32、延伸1,10,11,31,33、核糖体停滞33和构象变化33。大多数改进涉及使用不同的翻译抑制剂。然而，在细菌中，由于缺乏具有特定作用机制的抑制剂，类似研究难以开展34。在细菌中最常用的翻译抑制剂是氯霉素（CAM），其结合于肽基转移酶中心（PTC），阻止氨基酰-tRNA 在 A 位点的正确就位，从而抑制肽键形成，导致延伸中的核糖体停滞35。其他用于细菌的翻译抑制剂包括四环素（TET）36、瑞他帕林（RET）34和 Onc11237，这些抑制剂已被用于研究翻译起始位点。四环素通过直接占据核糖体 A 位点上 tRNA 反密码子茎环的位置，阻止 tRNA 的递送，最初被用于验证与 CAM 处理所得结果的一致性，因为两者均为抑制翻译延伸的抗生素38。研究表明，TET 能够检测主要翻译起始位点（TIS），但无法揭示内部翻译起始位点36。RET 结合于细菌核糖体的 PTC 区域，通过干扰 A 位点上的延伸型氨基酰-tRNA，阻止第一个肽键的形成，从而使核糖体停滞于主要及内部翻译起始位点34。Onc112 是一种富含脯氨酸的抗菌肽，结合于核糖体出口通道，阻断氨基酰-tRNA 在核糖体 A 位点的结合，从而阻止起始复合物进入延伸阶段37。
核糖体图谱技术提供的主要信息是核糖体在mRNA上的密度及其定位。该技术已成功用于研究不同生长条件下翻译水平上的差异基因表达1,6，测定翻译效率1,38,39，以及检测翻译调控事件，例如核糖体暂停10。RIBO-seq还可揭示已注释的非编码RNA、假基因以及未注释的小开放阅读框（ORF）的翻译，从而鉴定出新的和/或极短的蛋白质编码基因10,12,22,30,37。在这些情况下，RIBO-seq可用于精细调整和改进基因组注释。凭借其对翻译ORF的高灵敏度和定量特性，核糖体图谱可作为蛋白质组测定的替代方法，或辅助蛋白质组学研究31,34,39。通过定位翻译起始位点（TIS），核糖体图谱能够揭示已知蛋白质的N端延伸和截短异构体10,32。RIBO-seq还被用于研究蛋白质的共翻译折叠过程14,21,24。该方法可测定延伸速率1,10,39或单个密码子的解码速度6，有助于建立翻译过程的定量模型17。核糖体图谱技术还能够提供关于细菌中核糖体暂停7,15,17、移码40、终止密码子通读21、终止/循环缺陷41,42以及真核生物中核糖体构象变化33的机制性见解。RIBO-seq还被用于研究特定反式作用因子对翻译的影响，例如真核生物中的miRNA6和RNA结合蛋白16,43。然而，必须认识到，RIBO-seq的实验设计及其所达到的分辨率决定了从测序数据中可提取信息的多少12。

<table><tbody><tr><td>10X TBE（粉末）</td><td>Invitrogen</td><td>AM9864</td><td></td></tr><tr><td>2-巯基乙醇，99%，纯品</td><td>Acros Organics</td><td>125472500</td><td></td></tr><tr><td>腺苷5'-三磷酸（ATP）</td><td>New England Biolabs</td><td>P0756S</td><td></td></tr><tr><td>氧化铝，经煅烧，纯度为 p.a.</td><td>Chempur</td><td>114560600</td><td></td></tr><tr><td>二水合氯化钙</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C3881-500G</td><td></td></tr><tr><td>氯霉素</td><td>MP Biomedicals</td><td>190321</td><td></td></tr><tr><td>DNA 纯化 &amp;amp; 浓缩仪 -5</td><td>Zymo Research</td><td>D4004</td><td></td></tr><tr><td>重组DNase I，无RNase</td><td>罗氏</td><td>4716728001</td><td></td></tr><tr><td>EDTA 二钠盐</td><td>Fisher Scientific</td><td>E/P140/48</td><td></td></tr><tr><td>乙醇 Absolut 99.8%&amp;nbsp; Pure-P.A.-基础</td><td>POCH Avantor Performance Materials Poland S.A</td><td>BA6480111</td><td></td></tr><tr><td>过滤装置</td><td>VWR 系列</td><td>511-0265</td><td>全玻璃过滤装置，含漏斗、烧结底座、盖子，47 毫米 &amp;Oslash; 弹簧夹和磨口烧瓶</td></tr><tr><td>凝胶 40 (19:1)</td><td>罗蒂电泳</td><td>3030.1</td><td></td></tr><tr><td>6× 蓝色上样缓冲液</td><td>New England Biolabs</td><td>E6138G</td><td></td></tr><tr><td>鸟苷-5′&amp;prime;-[&amp;beta;,&amp;gamma;-亚氨基]三磷酸三钠盐水合物</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G0635-25MG</td><td></td></tr><tr><td>labZAP</td><td>A&amp;生物技术</td><td>040-500</td><td></td></tr><tr><td>四水合乙酸镁</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M5661-250G</td><td></td></tr><tr><td>MCE 膜滤器</td><td>Alfatec Technology</td><td>M47MCE45GWS</td><td>孔径：0.45 μm</td></tr><tr><td>MICROBExpress 细菌 mRNA 纯化</td><td>Invitrogen</td><td>AM1905</td><td></td></tr><tr><td>Illumina多重小RNA文库制备试剂盒</td><td>New England Biolabs</td><td>E7300S</td><td></td></tr><tr><td>无核酸酶水</td><td>Ambion</td><td>AM9937</td><td></td></tr><tr><td>无水醋酸钾 P.A. 纯品</td><td>POCH Avantor Performance Materials Poland S.A</td><td>744330113</td><td></td></tr><tr><td>快速上样 pBR322 DNA-MspI 消化产物</td><td>New England Biolabs</td><td>E7323A</td><td></td></tr><tr><td>RNA 纯化 &amp;amp; 浓缩仪 -25</td><td>Zymo Research</td><td>R1018</td><td></td></tr><tr><td>乙酸钠</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S2889-250G</td><td></td></tr><tr><td>碳酸钠</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>223530-500G</td><td></td></tr><tr><td>碳酸氢钠 纯 p.a.</td><td>POCH Avantor Performance Materials Poland S.A</td><td>810530115</td><td></td></tr><tr><td>SYBR Gold 核酸凝胶染料</td><td>Life Technologies</td><td>S11494</td><td></td></tr><tr><td>T4 多核苷酸激酶</td><td>新英格兰生物实验室</td><td>M0201L</td><td></td></tr><tr><td>T4 多核苷酸激酶反应缓冲液</td><td>New England Biolabs</td><td>B0201S</td><td></td></tr><tr><td>TBE-尿素上样缓冲液（2x）</td><td>Invitrogen</td><td>LC6876</td><td></td></tr><tr><td>Tris(hydroxymethyl)aminomethane，超纯，99.9%</td><td>AlfaAesar</td><td>J65594</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100，98%</td><td>Acros Organics</td><td>327371000</td><td></td></tr><tr><td>尿素 G.R.</td><td>lach:ner</td><td>40096-AP0</td><td></td></tr></tbody></table>

细菌中的ribo-seq：用于高通量测序的样品收集与文库构建方案

RIBO-seq in Bacteria: a Sample Collection and Library Preparation Protocol for NGS Sequencing

核糖体谱分析技术（RIBO-seq）目前是研究蛋白质合成过程最有效的工具 体内与其它方法相比，该方法的优势在于能够通过精确定位核糖体在mRNA转录本上的位置和数量，来监测翻译过程。
本文描述了细菌中RIBO-seq方法的样本采集与制备的连续步骤，重点介绍了与实验设计和实施相关的细节。
由于RIBO-seq依赖于完整的核糖体及其相关的mRNA，关键步骤是快速抑制翻译并充分裂解细胞。因此，我们建议通过滤膜收集细胞，并用液氮速冻，可选择性地预先用氯霉素处理以阻断细菌中的翻译过程。对于细胞裂解，我们推荐在氧化铝存在下，使用研钵和研杵研磨冷冻细胞，以机械方式破坏细胞壁。本方案中无需使用蔗糖垫或蔗糖梯度超速离心来纯化单核糖体。取而代之的是，采用聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）分离mRNA，随后切取核糖体保护片段（28–30 nt条带），该方法可获得满意结果。这大大简化了实验流程，同时减少了所需时间和设备要求。在文库构建方面，我们推荐使用New England Biolabs公司提供的商用小型RNA建库试剂盒（适用于Illumina测序），并遵循生产商的说明书进行一定程度的优化。
所获得的cDNA文库具有适用于下一代测序（NGS）所需的数量和质量。按照本方案制备的文库测序后，每个样本可获得200万至1000万条唯一比对的读长，足以满足全面的生物信息学分析需求。本文所介绍的方案快速且相对简便，可使用常规实验室设备完成。

此处展示的典型结果来自一项研究，该研究旨在探究野生型 Bacillus subtilis 细胞在孢子形成过程中的翻译调控。将过夜培养的菌液用丰富培养基稀释至 OD600 为 0.1，总体积为 100 mL，并在 37 °C 下剧烈振荡培养，直至 OD600 达到 0.5–0.6。随后将丰富培养基更换为最小培养基以诱导孢子形成过程，并继续培养最多四小时。从 T0（即诱导孢子形成开始）起，每隔一小时收集一次细胞，共获得五个时间点的样本。在每次收集前一分钟，按照上述方案用氯霉素处理培养物。通过预热的玻璃过滤装置，使用 0.45 µm 混合纤维素酯膜（MCE 滤膜）过滤收集细胞，并立即在液氮中快速冷冻。
裂解液中获得的核糖核酸量取决于生长条件、培养体积和菌液密度。按照本方案，100 mL细菌培养物（Bacillus subtilis）平均可获得1-4 mg RNA。上述实验所获得裂解液的示例见表1。
<table border="1" fo:keep-together....

本文描述了细菌RIBO-seq中样本采集与制备的各个步骤。按照本指南构建文库并进行测序，可获得足够数据用于全面的生物信息学分析。我们所介绍的实验方案简便，仅需使用常规实验室设备，从裂解到获得文库共需七天。

细菌中的RIBO-seq：用于高通量测序的样品收集与文库构建方案

核糖体谱分析技术（RIBO-seq）目前是研究体内蛋白质合成过程最有效的工具。该技术的优势在于……

核糖体谱分析技术，也称为RIBO-seq，目前是研究体内蛋白质合成过程最有效的工具。该方法的优势在于能够通过精确定位核糖体的位置和数量来监测翻译过程。RIBO-seq基于以下原理：核糖体结合到mRNA分子上后，在核酸酶消化过程中可保护其覆盖的转录本片段不被降解。所获得的片段称为核糖体印迹（ribosomal footprints），可进行测序并比对至其来源的转录本，从而确定核糖体的精确位置。在进行RIBO-seq的同时，还需进行高通量的总mRNA测序，以提供参考基准，并在数据分析过程中实现RIBO-seq与RNA-seq数据的比较。在收集细胞前，可选择性地向细菌培养物中添加氯霉素，使其终浓度为每毫升100微克，以抑制翻译过程。将培养物与抗生素孵育一分钟。如果收获时间长于常规时间，此步骤非常重要，因为抑制翻译过程可以延长样品收集时间。使用预热的过滤系统收集样品。可通过引入振荡以模拟生长条件。当所有培养基都通过滤膜后，停止过滤，但不要让滤膜完全干燥。使用预先温育并消毒的刮勺，快速将细胞从滤膜上刮下，收集细菌沉淀物。立即将带有收获细胞的整个刮勺放入装有液氮的50毫升离心管中。收获的细胞沉淀应完全浸没在液氮中。待沉淀彻底冻结后，使用预先冷却的刮勺将冻结的细胞刮下。盖上盖子，并确保其已穿孔。这一点非常重要，因为液氮在蒸发时会因压力变化导致密闭容器爆炸。准备好GMPP、DNA拭子以及专用于溶菌酶的全新Eppendorf管。根据需要，在裂解缓冲液中加入氯霉素。将500 µL裂解缓冲液分别加入各离心管中，每管对应一个样本，并置于冰上。使用实验室消毒剂和70%乙醇对研钵和研杵进行去污染处理。通过将液氮倒入研钵中来冷却研钵和研杵。将冻存的细菌沉淀转移至预冷的研钵中，研磨成粉末。加入约等体积的氧化铝并继续研磨。根据需要倒入液氮，保持研钵、研杵和细胞处于低温状态，防止研钵内物质解冻。使用前立即向裂解缓冲液分装液中加入GMPPNP和DNA拭子。将溶液转移至研钵中，继续研磨。 在研磨的同时让溶菌酶缓慢融化。当溶菌酶完全融化后，将混合物转移至预冷的Eppendorf管中，并放回冰上。在4°C条件下，以20,000 × g离心溶菌酶五分钟。将上清液转移至新的预冷的Eppendorf管中，并置于冰上。使用NanoDrop测定每个稀释样品的RNA浓度。将每份裂解物分为两部分，其中0.5至1毫克RNA用于RIBO-seq，其余部分用于RNA-seq。向1毫克RNA中加入3.8微升Tris pH 8缓冲液中的MNase，并用裂解缓冲液补至总体积为500微升。在25摄氏度、300转/分钟条件下孵育45分钟。孵育结束后，使用 commercially available RNA纯化试剂盒对样品进行纯化。配制含8摩尔尿素的15%聚丙烯酰胺TBE凝胶，并将其置于含有TBE缓冲液的电泳槽中。以200伏恒定电压预电泳至少10分钟。将样品与TBE-尿素上样缓冲液混合。在 95 摄氏度下变性 1 分钟，然后立即置于冰上。使用注射器将 TBE 缓冲液注入凝胶孔中以洗去尿素。上样时，每个样品之间至少留出一个孔的空间，以分离各样品并防止交叉污染。使用长度为29个核苷酸的寡核苷酸，以及长度为26和32个核苷酸的寡核苷酸混合物作为标记物。以180伏恒定电压进行电泳。配制无菌缓冲液用于过夜孵育。电泳结束后，用SYBR Gold染色凝胶。使用无菌针头或剃刀片切取长度在26至32个核苷酸之间的凝胶条带，并将凝胶片段分别放入不同的Eppendorf管中。在处理不同样品之间应更换针头或剃刀片。向每个离心管中加入200微升过夜孵育缓冲液，在10摄氏度、1000转/分钟的条件下过夜孵育样品。第二天，使用RNA纯化试剂盒清洗样品，并用18微升无核酸酶水洗脱。所得核糖体足迹产物即可用于文库构建。使用市售试剂盒对用于RNA测序的样品进行核糖体RNA耗竭。接着，使用RNA纯化试剂盒对样品进行纯化。进行碱性水解操作如下：配制碱性水解缓冲液，将一倍体积的缓冲液加入一倍体积的样品中，在95 °C下孵育25分钟。向每个样品中加入5微升3摩尔的乙酸钠（pH 5.5），以终止反应。使用RNA纯化试剂盒对样品进行纯化，并用18微升无核酸酶的水洗脱。所得的随机片段化RNA即可用于文库构建。每个样品中加入10 µL的10×反应缓冲液和5 µL的T4多核苷酸激酶。37 °C孵育1.5小时。孵育结束后，向每个样品中加入3 µL的1 mM ATP，并在37 °C继续孵育1小时。接下来，使用RNA纯化试剂盒对样品进行纯化。根据此处提供的方案，使用 commercially-available 试剂盒进行文库构建。使用6%聚丙烯酰胺凝胶进行PAGE电泳。用SYBR Gold染色凝胶。切下含有文库的凝胶片段。对于RNA-seq样本，文库大小为135至180个核苷酸；对于RIBO-seq样本，文库大小为135至170个核苷酸。使用无菌的针头或剃刀将切下的凝胶片段放入不同的Eppendorf管中。注意在处理不同样品之间更换针头或剃刀。向每个切下的凝胶片段中加入100 µL无核酸酶的水。在10°C、450转/分钟条件下过夜孵育。第二天，使用DNA纯化试剂盒对样品进行清洗。所获得的文库可直接用于高灵敏度的DNA芯片电泳进行质控和定量，并随后进行下一代测序。通过高灵敏度的芯片上DNA电泳验证，所获得的cDNA文库具有适用于下一代测序的适当数量和质量。与RNA-seq文库相比，代表RIBO-seq文库的条带和峰形更窄且更清晰。根据芯片上电泳结果，这些文库具有预期的片段分布特征。RIBO-seq文库中靠近200个碱基对位置出现的额外峰可能代表休眠的核糖体、未完全消化的核糖体足迹或人为假象（例如rRNA），在生物信息学分析过程中，当对测序获得的数据进行修剪并过滤rRNA和tRNA时，这些峰可被舍弃。文库构建过程中生成的cDNA平均产量为32纳克，足以满足下一代测序所需的材料量。通过芯片电泳进行质量控制后，文库被用于在Illumina NextSeq 500平台上进行单端50碱基对的测序。去除接头序列和低质量序列后，RNA-seq 样本每个样本获得 2500 万至 4700 万条读段，RIBO-seq 样本每个样本获得 2500 万至 5000 万条读段。所获得的数据使用 FastQC 进行了质量控制检查，RNA-seq 和 RIBO-seq 样本均表现出非常好的质量。根据所述方案制备的文库经测序后，RNA-seq 样本每个样品获得 240 万至 960 万条唯一比对的读段，RIBO-seq 样本每个样品获得 230 万至 1040 万条唯一比对的读段。RIBO-seq 数据表现出三联体周期性以及高而窄的峰，对应于起始核糖体，符合核糖体足迹的特征，而该特征在 RNA-seq 数据中未观察到。此外，核糖体足迹和 mRNA 片段在编码序列上平均覆盖度分布图显示，与预期一致，RIBO-seq 数据集中比对到编码区（CDS）的读段比例更高。映射的核糖体足迹可视化结果显示，其模式与按照标准RIBO-seq流程（包括通过蔗糖梯度超速离心回收单体核糖体）进行的相同实验所获得的结果非常相似。我们的方案已用于在多种生长条件下研究翻译调控，也可应用于翻译其他方面的研究，例如翻译起始位点的检测以及新蛋白质编码基因的发现。按照本指南制备文库并进行测序，可获得足够数据用于全面的生物信息学分析。我们在此介绍的方案快速、简便且成本低廉，可使用标准实验室设备完成。

ribo-seq-bacteria-sample-collection-library-preparation-protocol-for

Research

科研

JoVE Journal

Biochemistry

生物化学

细菌中的RIBO-seq:NGS测序样本收集和库准备协议

开发了一种核糖体RNA（rRNA）去除方案，用于富集蚊虫肠道元转录组RNA测序中的信使RNA（mRNA）。该方案利用来自蚊虫及其肠道微生物的样本特异性rRNA探针，通过扣除法去除rRNA。该方案的实施效果可实现约90-99%的rRNA去除率。...

蚊虫肠道宏基因组RNA-seq中核糖体RNA的去除

表征微生物群落一直是环境微生物学中的长期目标。新一代测序技术如今能够以极低的成本和工作量，以前所未有的深度对微生物群落进行表征。本文详细介绍了我们使用台式测序仪对细菌16S核糖体RNA基因进行测序的方法。...

16S核糖体RNA基因扩增子的高通量测序

本文描述了一种用于纯化下一代测序DNA片段的自动化凝胶大小选择方法。Ranger技术可完全自动化整个琼脂糖凝胶上样、电泳分析及目标DNA片段回收过程，从而实现高通量、高质量的下一代测序文库制备。...

利用自动化凝胶片段筛选提高环境水样制备的下一代测序文库质量

我们介绍一种高效、稳定且经济的从拭子中提取核酸的方法，用于通过16S...

高效的核酸提取与16S rRNA基因测序用于细菌群落特征分析

转录后调控在控制蛋白质丰度中起着重要作用。本文中，我们描述了一种用于定量分析芽殖酵母 Saccharomyces cerevisiae...

通过核糖体图谱分析对芽殖酵母进行全基因组翻译定量分析

Gel-seq 使研究人员能够利用一种简单的水凝胶装置，从 100 至 1000 个细胞起始，以可忽略的额外成本同时制备 DNA-seq 和 RNA-seq...

Gel-seq：一种利用水凝胶基质同时进行DNA和RNA测序文库构建的方法

我们提供了一种偏倚低于标准方法且对2'-O-甲基化RNA具有更高灵敏度的详细小RNA文库构建方案。该方案可使用自制试剂以降低成本，也可使用现成试剂盒以提高操作便利性。...

改进小RNA测序：减少偏差并更好检测2'-O-甲基化RNA

本方案详细介绍了尿液细菌培养、测序及从头杂合基因组组装的综合方法。该方法提供了一种可重复的操作流程，用于生成完整的环状基因组序列，有助于研究参与尿路定植、致病机制以及抗菌药物耐药性传播的染色体和染色体外遗传元件。...

杂交 从头 基因组组装结合短读长与长读长测序技术用于构建尿液细菌的完整基因组

本方案提供了一套易于遵循的工作流程，用于对目标生物样本进行多聚腺苷酸化RNA纯化、亚硫酸氢盐转化以及文库制备，且可使用标准化设备完成。...

mRNA 富集及亚硫酸氢盐处理mRNA文库构建用于高通量测序

我们描述了一种利用紫外光介导的光交联和质谱技术在活细胞中鉴定RNA结合蛋白并绘制其RNA结合区域的实验方案。...

基于质谱的RNA结合区域鉴定的样品制备

学习细菌RIBO-seq样本收集与文库制备的完整流程，利用标准实验设备在七天内完成裂解到文库获取。该方法可精确定位核糖体在mRNA上的位置，为蛋白质合成研究提供高通量测序数据支持。

细菌中的RIBO-seq：用于高通量测序的样品收集与文库构建方案

探索更多视频