在麻醉及清醒非人灵长类动物脑内进行光遗传学AAV载体注射

许多基因治疗和神经科学研究涉及将 AAV 载体注射到非人灵长类动物的大脑中。为了确保这些研究的成功，注射技术必须可靠。我们的注射技术快速且准确。

该方法适用于麻醉或清醒动物的注射操作。我们自制的套管易于操作且成本低廉。本次实验操作将由本实验室的工程技师 Kevin Mai 演示。

首先，使用圆盘磨床将30号13毫米皮下注射针头的尖端磨钝。然后，根据目标脑区的深度，截取一段适当长度的不锈钢管。使用圆盘磨床将切下的管子一端磨成斜面，另一端则打磨光滑。

使用铰刀去除管内毛刺。接着，根据待加载的载体溶液体积，截取适当长度的聚四氟乙烯（PTFE）管。通过插入钝化的皮下注射针头，将管子两端扩口。

将钝化的皮下注射针插入聚四氟乙烯（PTFE）管的一端约五毫米处。然后将不锈钢管的无斜面端插入另一端约五毫米。通过注射针头接头注入过滤水，以测试套管是否通畅。

确认水从斜面不锈钢管尖端平稳流出，且两个接头处均无漏水现象。测试导管后，将其放入 autoclave 袋中，并通过高压灭菌进行消毒。使用 P-20 移液器将载体溶液轻柔转移至已灭菌的 PCR 管中，避免产生气泡。

接下来，将套管针斜面朝下固定在垂直方向的立体定位仪支架上。然后将一个1毫升的鲁尔锁式注射器连接到套管针的皮下注射针座上。将斜面尖端浸入载体溶液中。

然后，使用1毫升注射器施加轻柔的负压，同时目视追踪溶液与空气之间的弯月面，将溶液吸入套管中。待病毒载体溶液完全吸入后，持续施加轻柔负压，直至溶液到达针头连接处。随后取下1毫升注射器，沿皮下注射针头连接处的内壁缓慢注入有色矿物油，注意避免产生气泡。

将皮下注射针头的接头连接至三通鲁尔锁止旋塞的两个开放端口之一，然后关闭该端口。用一个1毫升注射器吸入空气，并将其连接至另外两个端口中的任意一个。

最后，关闭三通阀上剩余的端口，将注射器连接至套管。安装注射器会将空气压入三通阀，将这部分空气引导至未占用的端口，可防止其将载体溶液推回套管内。缓慢将注射器中的空气推入套管中。

当钝针尖端的聚四氟乙烯管中出现有色油时，检查溶液与有色油之间是否存在气泡。持续施加正压，直至斜面导管尖端可见一滴载体溶液。然后关闭旋塞，防止载体因重力作用从导管中流出。

将病毒载体溶液加载后，将套管固定到立体定位仪操作臂上。然后，由非无菌区助手递送泵管，将止流阀与电动气泵连接。通过无菌袖套的管壁抓握鲁尔锁接头。

放下套管的管套边缘，使其在重力作用下沿管子自然下垂。然后安装旋塞阀，并用胶带将管套紧密缠绕固定在鲁尔锁接头上。接着，通过将气泵调至低压进行测试，再开启气泵并逐渐增加压力，直至油液推动载体溶液通过套管，且在套管尖端可见一滴载体溶液为止。

用胶带将塑料尺固定在聚四氟乙烯（PTFE）管上，以测量注射过程中弯月面的移动。然后，使用立体定位仪将套管向下推进，直至尖端到达表面，并记录深度。继续将套管推进至该路径中需要注射的最深部位。

接触时表面会出现凹陷。为尽量减少因组织受压导致的定位偏差，需将套管向下推进，并超过最深注射位点500微米，然后缓慢回撤。

其他替代方法包括缓慢插入套管，或快速插入后在底部停留1至5分钟。一旦套管到达最深的注射位置，使用电动空气泵在10至30秒内注入0.5 µL的载体溶液。通过观察PTFE管中彩色油与载体溶液之间的弯月面移动来确认注射流速。

等待一分钟后，将套管回撤至同一轨迹上的下一个注射位点。最后一次注射完成后，将套管留置原位10分钟，以防止载体外流。随后回撤套管，并将其丢弃于生物危害锐器容器中。

在左侧上丘注射携带通道视紫红质II转基因的AAV载体，随后以40毫瓦的持续蓝光刺激，产生了一系列连续的动作电位。在40毫瓦条件下，1毫秒的光脉冲无法诱发动作电位，但在160毫瓦时则能可靠地诱发动作电位。由视觉引导的扫视触发的上丘光刺激，逐渐降低了扫视增益。

这种变化的缓慢性与光遗传学诱导的可塑性一致。在脑桥被盖网状核注射 AAV 后，向眼动小脑蚓部递送黄光激光可抑制苔藓纤维活性，而苔藓纤维是小脑的输入通路。这种抑制降低了浦肯野细胞的活性，而浦肯野细胞是小脑的输出神经元。

在光遗传学抑制过程中，放电频率降低并转变为簇状放电模式，表明浦肯野细胞接收到的被抑制的苔藓纤维输入通过驱动第二次簇状放电影响扫视减速阶段。通道视紫红质仅在眼动小叶的浦肯野细胞中表达。施加短脉冲光刺激可增加单个浦肯野细胞的简单峰电位活动。

单次1.5毫秒的光脉冲常引发多个简单峰电位。在扫视期间定时进行光遗传学诱导的简单峰电位激活，可增加扫视幅度，从而证实了浦肯野细胞对眼动爆发发生器的去抑制作用。导管中的气泡会破坏油向量弯月面，使注射体积的测定复杂化，并妨碍流速的精细控制。

由于这些原因，加载无气泡的载体溶液对此操作至关重要。注射后六到八周，可进行光遗传学操控，并对脑组织进行组织学分析。该技术使研究人员能够在少量动物体内测试多种载体，从而促进新载体的开发与验证。

当前一个备受关注的研究领域是开发能够靶向特定神经元类型的载体。