Name: 使用渗透压力调节聚酯聚合物的形状 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-04-21T15:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 1 s
Description: 了解如何利用渗透压力调节聚酯聚合物囊泡的形状，制备 elongated polymersomes 以增强药物递送效果。该方法可同时输送疏水性和亲水性药物，并有望穿越血脑屏障。

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本项目部分由美国国立卫生研究院项目（项目编号：5P20GM103499-19）通过学生自主研究项目计划资助。本研究还部分得到了克莱姆森大学创意探究计划的支持。我们同时感谢Nicholas L'Amoreaux和Aon Ali，他们最初参与了本实验方案的建立，并发表了本文引用的第一篇相关论文14。

1. 使用溶剂注入法形成球形聚合物囊泡
<ol>
	<li>在有机溶剂中溶解聚酯 
	注意：每次仅应将一种聚酯溶解于其相应的有机溶剂中，以形成聚合物囊泡（polymersomes）。
	<ol>
		<li>将聚乙二醇-聚乳酸（PEG-PLA）或聚乙二醇-嵌段-聚（乳酸-共-乙醇酸）（PEG-PLGA）溶解于二甲基亚砜（DMSO）中，浓度为1.5%（质量分数）。具体操作：将0.015 g选定的聚酯溶解于1 mL DMSO中（15 mg/mL）。聚合物完全溶解可能需要最多15分钟的涡旋振荡。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>在聚酯于有机溶剂中溶解的同时，根据图1设置溶剂注射装置。
	<ol>
		<li>将搅拌台置于垂直注射泵正下方。在搅拌台上放置一个5 mL玻璃小瓶，内含1 mL II型去离子水和一个微型搅拌子。</li>
		<li>调节注射泵的高度，使针头尖端完全浸入II型去离子水中。</li>
		<li>将注射泵的输注速率设定为5 µL/min。 
		注意：若使用小体积注射泵，可将带针筒的适配器安装在铁环架上；若使用大体积注射泵，则可将其垂直放置于实验室升降台（lab jack）上以调节高度。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>通过将有机溶剂与聚酯溶液（步骤1.1.1）吸入一支27 G、针长½"的针头中，进行溶剂注射。
	<ol>
		<li>将针头装入注射泵，并确保其完全固定。调节推块使其接触针筒活塞末端。</li>
		<li>启动搅拌台，使水以100 rpm转速旋转，随后启动注射泵。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>当注射泵将有机溶剂和聚合物完全注入搅拌中的水中后，移开搅拌子并盖上玻璃小瓶盖。</li>
	<li>通过动态光散射（DLS）对聚合物囊泡进行表征。
	<ol>
		<li>取1 mL含有少量有机溶剂和聚合物的水样，置于1 mL比色皿中。</li>
		<li>根据表1中的设置，将1 mL比色皿放入DLS系统中并开始测量。读取并记录聚合物囊泡的强度加权直径及多分散性指数（PDI）。 
		注意：由于有机溶剂含量极低，塑料比色皿在此情况下即可满足要求；但若存在任何疑虑，也可使用玻璃比色皿。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>利用透射电子显微镜（TEM）和扫描电子显微镜（SEM）确认球形聚合物囊泡的形成。
	<ol>
		<li>根据可用设备优化TEM和SEM的操作方案。代表性结果在TEM中于120 kV、SEM中于5.0 kV条件下获得。</li>
		<li>若通过电子显微镜无法观察到聚合物囊泡，可使用醋酸铀酰作为背景染色。 
		&#8203;注意：有关聚酯基聚合物囊泡形貌调控的TEM和SEM成像细节，参见文献14；软纳米颗粒电子显微镜技术的详细信息参见文献16。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 透析去除有机溶剂
<ol>
	<li>根据制造商提供的方案清洗一个分子截留量为 300 kDa 的透析膜。</li>
	<li>将 1 mL 聚合物囊泡溶液加入透析装置的储液室中。</li>
	<li>将透析装置置于盛有 150 mL Ⅱ级去离子水的 250 mL 烧杯中，并将烧杯放在搅拌台上，调节搅拌速度，使透析装置缓慢移动，持续搅拌过夜。 
	注意：若透析过程中产生涡流，则需降低搅拌速度。</li>
	<li>透析完成后，从透析装置中取出 1 mL 聚合物囊泡溶液，并按照步骤 1.5 对聚合物囊泡溶液进行表征。 
	注意：收集该信息有助于评估形貌调控实验是否成功，因为若聚合物囊泡发生拉长，其多分散系数（PDI）应有所增加。</li>
</ol>
3. 盐浓度梯度透析
<ol>
	<li>根据最终期望的聚合物囊泡特性，配制150 mL所需盐缓冲液，其中氯化钠浓度可选择50 mM、100 mM或200 mM。通常情况下，盐浓度越高，聚合物囊泡的伸长程度越大。</li>
	<li>取已透析并表征过的聚合物囊泡溶液，重新放入透析装置中。将装有样品的透析装置置于150 mL相应盐溶液中，轻轻搅拌18小时。 
	&#8203;注意：形态调控后的聚合物囊泡可在等渗溶液中储存，并在长达7天内保持其形态稳定。</li>
</ol>
4. 形状调控的聚合物囊泡表征
<ol>
	<li>形态调控完成后，通过动态光散射（DLS）、透射电子显微镜（TEM）和扫描电子显微镜（SEM）对聚合物囊泡进行表征。若在电子显微镜下无法观察到聚合物囊泡，可使用醋酸铀酰进行背景染色。</li>
	<li>按照步骤1.5所述进行DLS测量，特别注意与球形聚合物囊泡相比的多分散系数（PDI）测量结果，因为PDI的变化表明聚合物囊泡的形态发生了有效改变。</li>
	<li>确保成像时使用适当的对照，尤其是未经形态调控的聚合物囊泡，以验证该方法的成功实施。</li>
</ol>

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<li>Zhou, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mesoporous+silica+nanoparticles+for+drug+and+gene+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Pharmaceutica+Sinica+B%22%5BJournal%5D)">Mesoporous silica nanoparticles for drug and gene delivery.</a> Acta Pharmaceutica Sinica B. 8 (2), 165-177 (2018).</li>
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<li>Wong, C. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Faceted+polymersomes%3A+A+sphere-to-polyhedron+shape+transformation%5BTitle%5D)+AND+%22Chemical+Science%22%5BJournal%5D)">Faceted polymersomes: A sphere-to-polyhedron shape transformation.</a> Chemical Science. 10 (9), 2725-2731 (2019).</li>
<li>Chidanguro, T., Ghimire, E., Simon, Y. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Shape-transformation+of+polymersomes+from+glassy+and+crosslinkable+ABA+triblock+copolymers%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Materials+Chemistry+B%22%5BJournal%5D)">Shape-transformation of polymersomes from glassy and crosslinkable ABA triblock copolymers.</a> Journal of Materials Chemistry B. 8 (38), 8914-8924 (2020).</li>
<li>Van Oers, M. C. M., Rutjes, F. P. J. T., Van Hest, J. C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tubular+polymersomes%3A+A+cross-linker-induced+shape+transformation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Chemical+Society%22%5BJournal%5D)">Tubular polymersomes: A cross-linker-induced shape transformation.</a> Journal of the American Chemical Society. 135 (44), 16308-16311 (2013).</li>
<li>Che, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pathway+dependent+shape-transformation+of+azide-decorated+polymersomes%5BTitle%5D)+AND+%22Chemical+Communications%22%5BJournal%5D)">Pathway dependent shape-transformation of azide-decorated polymersomes.</a> Chemical Communications. 56 (14), 2127-2130 (2020).</li>
<li>Haryadi, B. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nonspherical+nanoparticle+shape+stability+is+affected+by+complex+manufacturing+aspects%3A+Its+implications+for+drug+delivery+and+targeting%5BTitle%5D)+AND+%22Advanced+Healthcare+Materials%22%5BJournal%5D)">Nonspherical nanoparticle shape stability is affected by complex manufacturing aspects: Its implications for drug delivery and targeting.</a> Advanced Healthcare Materials. 8 (18), 11-13 (2019).</li>
<li>Katterman, C., Pierce, C., Larsen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combining+nanoparticle+shape+modulation+and+polymersome+technology+in+drug+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Applied+Bio+Materials%22%5BJournal%5D)">Combining nanoparticle shape modulation and polymersome technology in drug delivery.</a> ACS Applied Bio Materials. , (2021).</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

自组装体系 notoriously 难以控制。其最终性质，包括尺寸、形状和结构，取决于所选两亲性分子的疏水性质以及选定的溶剂环境。两亲性嵌段共聚物倾向于形成球形结构，这可以最小化吉布斯自由能并达到热力学平衡23，从而形成聚合物体（polymersomes）。由于其处于热力学平衡状态，聚合物体在拉长或改变形状方面具有显著挑战性，因此相较于固体纳米颗粒，相关研究较少。溶剂驱动法已与基于聚乙二醇-嵌段-聚苯乙烯（PEG-b-polystyrene, PS）的聚合物体进行了广泛联合研究12,13,24,25,26,27。然而，由于每种嵌段共聚物在采用基于溶剂的方法时都需要重新优化实验方案，该方法尚未被广泛应...

形状调控是一种相对较新且高效的纳米颗粒介导药物递送优化方法。形态的改变不仅增加了颗粒的表面积，从而提高其载药能力，而且在增强稳定性、延长循环时间、提高生物利用度、实现分子靶向以及控制释放等方面均具有广泛优势1。本方法所关注的纳米颗粒——聚合物囊泡（polymersomes）在热力学上倾向于自组装成球形结构，但这种形态在细胞摄取方面已被证明不切实际，且更容易被免疫系统识别为异物。若能将结构拉长为长椭球形或棒状，则可使药物载体模拟天然细胞，逃避免疫系统中巨噬细胞的清除，从而更有效地递送至目标部位2,3,4,5,6,7。在进行形状调控的同时，聚合物囊泡所具备的诸多显著优势仍得以保留，包括对载荷的膜包被保护作用、膜对外界刺激的响应性，以及对亲水性和疏水性药物的双重包封能力8,9,10，这些特性使其成为极具潜力的药物递送载体。
调控聚合物囊泡形状的方法有多种，每种方法都有其相应的优缺点。然而，大多数方法可归为两类：溶剂驱动和盐驱动的渗透压变化11。这两种方法的目的都是克服聚合物囊泡在形成球形平衡结构后所存在的弯曲能。通过引入渗透压梯度，即使存在较强的弯曲能，聚合物囊泡仍可被迫使弯曲成伸长的结构11,12。
基于溶剂的方法借鉴了 Kim 和 van Hest13 的研究，探索了形变过程。他们将聚合物囊泡置于有机溶剂与水的混合体系中进行增塑，使有机溶剂滞留在囊泡膜内并驱除囊泡核心中的水。最终，颗粒内部体积显著降低，导致其发生伸长。尽管该方法已展现出一定潜力，但其实用性有限。该方法需要针对参与调控的不同聚合物骨架使用特定的溶剂，因此难以广泛适用于诱导形变。相比之下，基于盐的方法具有一致性，且采用一种通用的驱动机制，可对多种基于嵌段共聚物的聚合物囊泡施加渗透压，从而诱导形变。
本项目采用 L'Amoreaux 等人提出的基于盐溶液的方法14。该方案包含两轮透析：第一轮旨在通过去除在制备过程中可能被困在双分子层中的有机溶剂，来纯化并稳定聚乙二醇-嵌段-聚乳酸（PEG-PLA）聚合物囊泡；第二轮则促进囊泡的形态转变。第二次透析步骤引入50 mM NaCl溶液，形成渗透压梯度，从而驱动形态变化。Salva 等人的研究支持该方法，指出溶液中的高渗应力会导致囊泡收缩15。该方法基于先前发表的一项研究14，该研究考察了两种不同的聚酯类聚合物囊泡以及50–200 mM NaCl范围内的不同盐浓度梯度。由于聚酯具有良好的生物相容性和可生物降解性，因此被选用。盐浓度梯度对形态的影响取决于嵌段共聚物主链的疏水性，可诱导形成长椭球形、棒状及口杯状结构。本研究选择这种由盐驱动的方法，因其易于重复且具备较高的实验灵活性。

<table><tbody><tr><td>15*45 毫升螺口小瓶，带盖</td><td>Fisherbrand</td><td>9609104000</td><td></td></tr><tr><td>二甲基亚砜</td><td>Fisher Chemical</td><td>D128-1</td><td></td></tr><tr><td>二甲基亚砜</td><td>BDH</td><td>BDH1115-1LP</td><td></td></tr><tr><td>Isoremp 搅拌器、加热板及加热搅拌板</td><td>Fisher scientific</td><td>CIC00008110V19</td><td></td></tr><tr><td>LEGATO 130 注射泵</td><td>kd Scientific</td><td>788130</td><td></td></tr><tr><td>PEG(1000)-b-PLA(5000)，双嵌段聚合物</td><td>Polysciences Inc</td><td>24381-1</td><td>重复实验时请注意分子量</td></tr><tr><td>聚乙二醇(2000)甲醚-嵌段-聚乳酸-共-乙醇酸(4500)</td><td>Sigma aldrich</td><td>764825-1G</td><td>重复实验时请注意分子量</td></tr><tr><td>一次性注射器/BD PrecisionGlide 针头组合，无菌，BD 医疗</td><td>BD medical</td><td>BD305620</td><td>结核菌素</td></tr><tr><td>氯化钠</td><td>BDH</td><td>BDH9286</td><td></td></tr><tr><td>Zetasizer Nano ZS</td><td>Malvern</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

利用渗透压调控聚酯基聚合物体的形状

Modulating Shape of Polyester Based Polymersomes using Osmotic Pressure

聚合物囊泡是由两亲性嵌段共聚物形成的具有膜结构的双层囊泡，可包载疏水性和亲水性药物，用于药物递送。尽管前景广阔，但由于其球形结构不易被细胞摄取，限制了聚合物囊泡的应用，这一点已被固体纳米颗粒研究人员证实。本文介绍一种基于盐的方法，用于提高以聚乙二醇（PEG）为基础的球形聚合物囊泡的长径比。该方法通过在形成后的透析过程中添加氯化钠，实现对聚合物囊泡的拉长，并最终调控其形状。根据所用嵌段共聚物的疏水性以及目标形态，可按照本方法调整盐浓度。拉长的纳米颗粒有望更有效地靶向大直径血管（如静脉）中的内皮细胞，这些部位可观察到边缘化现象。该方案通过将拉长技术与聚合物囊泡的双负载、长循环优势相结合，拓展了治疗性纳米颗粒的应用范围。

表2展示了按照步骤1操作时预期得到的结果。请注意，在聚合物囊泡的制备过程中，DMSO被用作PEG-PLA和PEG-PLGA的溶剂。虽然可以使用其他与水混溶的溶剂来溶解共聚物，但偏离本方案所用溶剂可能会改变实验结果。预期多分散系数（PDI）应小于0.2，表明形成了单分散的聚合物囊泡17。需注意的是，疏水性增加会导致聚合物囊泡直径和PDI的偏差增大。如果在执行本方案时，所获得的聚合物囊泡直径与本表中报告的数值存在显著差异，则最常见的原因是纳米颗粒浓度过低，表现为该样品的计数率较低。
图2 展示了在未添加盐梯度前，非形状调控型聚合物囊泡的形态。此处展示的是按照实验步骤1处理后，基于PEG-PLA的聚合物囊泡的代表性结果。无论使用何种嵌段共聚物，透射电子显微镜（TEM）图像均应显示整体呈球形结构，并具有较厚的外圈线条，提示存在膜结构。在无NaCl条件下，PEG-PLA聚合物囊泡在扫描电子显微镜（SEM）中呈现球形结构，其表面粗糙，反映出PEG形成的刷...

聚合物囊泡是自组装形成的聚合物囊泡，通常呈球形，以最小化吉布斯自由能。在药物递送应用中，更长的结构更为有利。本实验方案建立了利用盐诱导渗透压、减小囊泡内部体积，从而制备具有较高长径比的棒状聚合物囊泡的方法。

聚合物囊泡是由两亲性嵌段共聚物形成的具有膜结构的双层囊泡，可包封疏水性和亲水性载荷……

纳米粒子的形状会影响细胞摄取，但目前针对改变聚合物囊泡形状的研究还很有限。本实验方案展示了如何拉长聚合物囊泡以增强其在药物递送中的应用。该技术提供了一种简便的方法，可制备多种不同形状的聚合物囊泡，在药物递送、伪细胞构建或其他尚未探索的领域具有潜在应用价值。长条形的聚合物囊泡可同时递送疏水性和亲水性药物，并更易进入细胞。该技术有望帮助药物穿越血脑屏障，解决一项重大医学难题。首先，将0.015克选定的聚酯溶于1毫升DMSO中，涡旋振荡15分钟使其溶解，并组装溶剂注射装置。将起始板直接放置在垂直注射泵下方，然后在搅拌板上的微型搅拌子上放置一个五毫升玻璃烧杯，内含一毫升二级去离子水。调节注射泵的高度，使针头尖端完全浸入二级去离子水中，并将注射泵的输注速率设置为每分钟五微升。通过将有机溶剂和聚酯溶液吸入27号针头中，进行溶剂注射操作。将针头插入注射泵，并确保其固定牢固。调整推块使其接触注射器活塞的末端。启动搅拌台，使水以每分钟100转的速度旋转，然后启动注射泵。当注射泵将有机溶剂和聚合物完全注入水中后，取出搅拌子并盖紧玻璃小瓶。若需通过动态光散射（DLS）对聚合物囊泡进行表征，向1 mL比色皿中加入含少量有机溶剂和聚合物的1 mL水溶液。将比色皿放入DLS系统中并设置运行参数，进行DLS检测。读取聚合物囊泡的强度加权直径和多分散性指数（PDI）。按照制造商提供的方案清洗300千道尔顿透析膜后，将1毫升聚合物囊泡溶液加入透析装置的储液室中。将透析装置置于盛有150毫升二级去离子水的250毫升烧杯中，并将烧杯放在搅拌台上进行搅拌。将搅拌器调至适当速度，使透析装置内的液体轻柔流动，并持续搅拌过夜。透析完成后，从透析装置中取出一毫升聚合囊泡溶液。根据最终所需的聚合囊泡特性，配制150毫升含50、100或200毫摩尔浓度氯化钠的所需盐缓冲液，并将透析装置中的样品置于150毫升盐溶液中继续搅拌18小时。形态调控后，进行动态光散射（DLS）测量。应特别关注与球形聚合物囊泡相比的多分散系数（PDI）变化，因为PDI的变化提示聚合物囊泡发生了有效的形态改变。成像时应设置适当的对照，尤其是未进行形态调控的聚合物囊泡，以确保该方法的成功。基于PEG-PLA的聚合物囊泡的透射电镜观察显示，其整体呈球形结构，外周有较厚的线条，提示存在膜结构。聚合物囊泡表现为物理结构，扫描电镜下可见其外层具有类似刷状的PEG层。在水中透析一小时后，总体平均直径保持不变，但溶剂的去除导致聚合物囊泡直径减小。当使用较高初始浓度的有机溶剂时，预期会导致更大的直径减小。在制备PEG-PLA聚合物囊泡时，PDI可能出现轻微变化，这可能表明其形状发生改变。在透析PEG-PLGA聚合物囊泡时（其相对于盐而言比PEG-PLA聚合物囊泡略具疏水性），PDI的增加更为一致，所有探索过的盐浓度梯度均导致PDI升高，这与囊泡发生伸长的变化相符。无论聚酯的疏水性如何，使用50毫摩尔的盐浓度梯度诱导形变时，均应观察到类似的结果。与此同时，100和200毫摩尔的氯化钠盐浓度梯度则表现出明确的趋势，即随着聚酯疏水性的增加，ΔPDI也随之增大。经50毫摩尔氯化钠透析后的PEG-PLA聚合物囊泡的透射电子显微镜（TEM）图像显示，其形态为口形体和细长棒状结构。当盐浓度增加至100毫摩尔时，观察到棒状结构的形成数量增加，而口形红细胞样结构（stomatocytes）的数量减少。使用200毫摩尔的聚合物囊泡进行透析，则更稳定地形成具有适中长宽比的类球形延长结构（prolates）。本实验方案中最具挑战性的部分是稳定地制备聚合物囊泡。因此，练习该操作步骤非常重要。

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