Name: 用于质谱分析的最佳切割温度化合物中嵌入的人组织制备 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-04-27T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 9 s
Description: 学习从OCT包埋的人冷冻组织中去除OCT化合物的方法，利用液相色谱-电喷雾电离串联质谱技术准确定量鞘脂类分子。该方案支持生物样本库样本的回顾性脂质组学研究。

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本研究项目得到了弗吉尼亚联邦大学马西癌症中心组织与数据获取及分析核心实验室以及弗吉尼亚联邦大学脂质组学与代谢组学核心实验室的服务与支持，这些核心实验室部分由美国国立卫生研究院国家癌症研究所癌症中心支持基金P30CA016059资助。本研究工作得到了美国国立卫生研究院基金R21CA232234（Santiago Lima）的支持。

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<li>Ogretmen, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sphingolipid+metabolism+in+cancer+signalling+and+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews.+Cancer%22%5BJournal%5D)">Sphingolipid metabolism in cancer signalling and therapy.</a> Nature Reviews. Cancer. 18 (1), 33-50 (2018).</li>
<li>Hannun, Y. A., Obeid, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sphingolipids+and+their+metabolism+in+physiology+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Sphingolipids and their metabolism in physiology and disease.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 19 (3), 175-191 (2018).</li>
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<li>Lima, S., Milstien, S., Spiegel, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sphingosine+and+Sphingosine+Kinase+1+involvement+in+endocytic+membrane+Trafficking%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Sphingosine and Sphingosine Kinase 1 involvement in endocytic membrane Trafficking.</a> The Journal of Biological Chemistry. 292 (8), 3074-3088 (2017).</li>
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<li>Young, M. M., Wang, H. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sphingolipids+as+regulators+of+autophagy+and+endocytic+trafficking%5BTitle%5D)+AND+%22Advances+in+Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Sphingolipids as regulators of autophagy and endocytic trafficking.</a> Advances in Cancer Research. 140, 27-60 (2018).</li>
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<li>Morad, S. A. F., Cabot, M. C. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aMorad%2C+SAF+%22Advances+in+Cancer+Research%22">Advances in Cancer Research</a>. Chalfant, C. E., Fisher, P. B. 140, Academic Press. 235-263 (2018).</li>
<li>Rohrbach, T. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+method+for+sphingolipid+analysis+of+tissues+embedded+in+optimal+cutting+temperature+compound%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Lipid+Research%22%5BJournal%5D)">A simple method for sphingolipid analysis of tissues embedded in optimal cutting temperature compound.</a> Journal of Lipid Research. 61 (6), 953-967 (2020).</li>
<li>Weston, L. A., Hummon, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+LC-MS%2FMS+analysis+of+optimal+cutting+temperature+%28OCT%29+compound+removal+for+the+study+of+mammalian+proteomes%5BTitle%5D)+AND+%22Analyst%22%5BJournal%5D)">Comparative LC-MS/MS analysis of optimal cutting temperature (OCT) compound removal for the study of mammalian proteomes.</a> Analyst. 138 (21), 6380-6384 (2013).</li>
<li>Holfeld, A., Valdés, A., Malmström, P. -U., Segersten, U., Lind, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Parallel+proteomic+workflow+for+mass+spectrometric+analysis+of+tissue+samples+preserved+by+different+methods%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Parallel proteomic workflow for mass spectrometric analysis of tissue samples preserved by different methods.</a> Analytical Chemistry. 90 (9), 5841-5849 (2018).</li>
<li>Zhang, W., Sakashita, S., Taylor, P., Tsao, M. S., Moran, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comprehensive+proteome+analysis+of+fresh+frozen+and+optimal+cutting+temperature+%28OCT%29+embedded+primary+non-small+cell+lung+carcinoma+by+LC-MS%2FMS%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Comprehensive proteome analysis of fresh frozen and optimal cutting temperature (OCT) embedded primary non-small cell lung carcinoma by LC-MS/MS.</a> Methods. 81, 50-55 (2015).</li>
<li>Shah, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue+proteomics+using+chemical+immobilization+and+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Tissue proteomics using chemical immobilization and mass spectrometry.</a> Analytical Biochemistry. 469, 27-33 (2015).</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

OCT 是生物样本库中常用的长期冷冻保存试剂。然而，当组织通过多种质谱平台进行分析时，OCT 可能导致离子抑制12,13,14,15，或在样本经液相色谱-电喷雾电离串联质谱（LC-ESI-MS/MS）分析时引起信号丢失11。冷冻保存组织中的 OCT 还可能干扰组织归一化方法（如称重）以及蛋白质定量检测（如 Bradford 法和 BCA 法）11。本文中，我们提供了一种详细的去除人组织中 OCT 并随后进行质谱分析的实验方案。该方案可稍作修改，用于除肺组织以外的其他组织来源，或用于小鼠组织，正如我们先前所述11。此外，也可采用其他质谱数据归一化策略，包括我们此前描述的方法11，以及其他经过验证的...

鞘脂是一类具有生物活性的代谢物，以其在人体代谢和疾病中的作用而著称1，2。它们调控多种复杂的细胞过程，如细胞迁移、细胞存活与死亡、细胞运动、囊泡运输、细胞侵袭与转移、血管生成以及细胞因子的产生1，2，3，4，5，6，7，8，9。鞘脂代谢调控的异常可促进癌症的发生与发展，决定癌症的侵袭程度以及癌症对治疗的反应性和耐药性的形成3，10。因此，由于鞘脂在疾病病因学中具有广泛影响，能够精确定量疾病特异性鞘脂变化的分析方法显得尤为重要。质谱法（MS）是分析鞘脂变化最准确且可靠的手段。
可用于鞘脂类物质变化分析的人体样本，可前瞻性地从手术室获取，或回顾性地从组织生物样本库中获得。手术获取的新鲜组织具有优势，因其可直接用于质谱（MS）或其他分析方法检测。然而，前瞻性获取组织样本在行政管理、技术操作和后勤方面存在诸多障碍，且收集到足够数量的样本以达到统计学效力往往具有挑战性。从生物样本库获取组织的优势在于，可回顾性地大量获取样本，且样本库通常会确认组织学和病理学特征，采用标准操作程序对组织进行低温冷冻保存和存储，并可提供可用于相关性分析的临床病理数据。然而，为了保存分子和结构特征，生物样本库可能会使用最佳切割温度（OCT）包埋介质对组织进行冷冻保存，而我们已证实该介质会干扰数据归一化实验以及通过液相色谱-电喷雾电离串联质谱法（LC-ESI-MS/MS）对鞘脂类物质的定量分析11。此外，已有研究表明，OCT 包埋介质中的主要成分聚乙烯醇和聚乙二醇，在其他质谱分析平台中会导致离子抑制效应12,13,14,15。因此，在进行质谱法鞘脂组学分析前，必须将组织中的 OCT 包埋介质完全去除。
在先前的报告中，我们已验证了一种从人源样本中去除OCT包埋剂以进行液相色谱-电喷雾电离串联质谱（LC-ESI-MS/MS）分析的方案11，以及用于组织称重以实现数据归一化的方法11。本文中，我们详细描述鞘脂组学OCT包埋剂去除方案（sOCTrP）的操作步骤，并展示来自人肺腺癌肿瘤及其癌旁正常未受累组织的代表性数据。

<table><tbody><tr><td>1 mL 聚丙烯移液器吸头</td><td>NA</td><td>NA</td><td>用于取样标本</td></tr><tr><td>1.5 mL 聚丙烯离心管</td><td>NA</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>10 mL 锥形瓶</td><td>VWR</td><td>89091-116</td><td>用于试管和组织称重</td></tr><tr><td>AB Sciex Analyst 1.6.2</td><td>Sciex</td><td>NA</td><td>用于分析和整合质谱数据的软件</td></tr><tr><td>甲酸铵</td><td>菲舍尔科学</td><td>A11550</td><td>用于液相色谱流动相</td></tr><tr><td>分析天平</td><td>NA</td><td>NA</td><td>精度达 0.1 mg 的天平</td></tr><tr><td>瓶口分液器</td><td>赛多利斯</td><td>LH-723071</td><td>用于分装溶剂</td></tr><tr><td>C12-神经酰胺 (d18:1/C12:0)；N-(十二烷酰基)-鞘氨-4-烯</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>LM2212</td><td>内标物</td></tr><tr><td>C12-葡萄糖基神经酰胺 (d18:1/12:0)；N-(十二烷酰基)-1-&amp;beta;-葡萄糖基-鞘氨-4-烯</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>LM2511</td><td>内标物</td></tr><tr><td>C12-乳糖基神经酰胺 (d18:1/12:0)；N-(十二烷酰基)-1-&amp;szlig;-乳糖基-鞘氨-4-烯</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>LM2512</td><td>内标物</td></tr><tr><td>C12-鞘磷脂&amp;nbsp; (d18:1/C12:0)，N-(十二烷酰基)-鞘氨-4-烯-1-磷酸胆碱</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>LM2312</td><td>内标物</td></tr><tr><td>CHLOROFORM OMNISOLV 4L</td><td>VWR</td><td>EM-CX1054-1</td><td></td></tr><tr><td>ClickSeal 生物安全盖</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>75007309</td><td>用于防止离心过程中产生生物危害性气溶胶</td></tr><tr><td>Conflikt</td><td>Decon Labs</td><td>4101</td><td>去污剂</td></tr><tr><td>CTO-20A/20AC 柱温箱</td><td>岛津</td><td>NA</td><td>用于液相色谱</td></tr><tr><td>d17:1-鞘氨醇；&amp;nbsp; (2S,3R,4E)-2-氨基十七碳-4-烯-1,3-二醇</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>LM2000</td><td>内标物</td></tr><tr><td>d17:1-鞘氨醇-1-磷酸；十七碳鞘氨-4-烯-1-磷酸</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>LM2144</td><td>内标物</td></tr><tr><td>DGU20A5R 脱气装置</td><td>岛津</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>一次性培养管 13x100 mm</td><td>VWR</td><td>53283-800</td><td>13x100 mm 螺口管</td></tr><tr><td>加热水浴锅</td><td>NA</td><td>NA</td><td>用于过夜脂质提取</td></tr><tr><td>匀浆器 150</td><td>菲舍尔科学</td><td>15-340-167</td><td>用于组织匀浆</td></tr><tr><td>匀浆器塑料一次性探头</td><td>菲舍尔科学</td><td>15-340-177</td><td>用于匀浆</td></tr><tr><td>Kimwipes 纸巾</td><td>Kimtech</td><td>34120</td><td>实验室级纸巾，用于制作灯芯</td></tr><tr><td>甲醇 LC-MS 级 4L</td><td>VWR</td><td>EM-MX0486-1</td><td></td></tr><tr><td>Nexera LC-30 AD 二元泵系统</td><td>岛津</td><td>NA</td><td>用于液相色谱-质谱联用</td></tr><tr><td>永久性记号笔</td><td>VWR</td><td>52877-310</td><td></td></tr><tr><td>酚醛螺纹盖，Kimble Chase（一次性培养管用盖）</td><td>VWR</td><td>89001-502</td><td>13x100 mm 螺口管盖</td></tr><tr><td>磷酸盐缓冲液</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>10010023</td><td>用于清洗后从管中取出标本</td></tr><tr><td>重复移液器</td><td>艾本德</td><td>4987000118</td><td>用于分装液相色谱-质谱内标物</td></tr><tr><td>螺口盖，蓝色，红色聚四氟乙烯/白色硅胶</td><td>VWR</td><td>89239-020</td><td>自动进样瓶盖</td></tr><tr><td>带 ID 标签的螺纹玻璃小瓶</td><td>VWR</td><td>46610-724</td><td>自动进样瓶</td></tr><tr><td>SIL-30AC 自动进样器</td><td>岛津</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>SpeedVac 浓缩仪</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>SPD2030P1220</td><td>用于干燥溶剂</td></tr><tr><td>Supelco 2.1 (内径) x 50 mm Ascentis Express C18 色谱柱</td><td>西格玛奥德里奇</td><td>581300-U</td><td>用于液相色谱-质谱联用</td></tr><tr><td>Triple Quad 5500+ 液相色谱-串联质谱系统</td><td>Sciex</td><td>NA</td><td>用于液相色谱-电喷雾电离-串联质谱</td></tr><tr><td>超声水浴锅</td><td>Branson</td><td>Model 2800</td><td>用于匀浆以及提取和干燥脂质的重悬</td></tr><tr><td>涡旋振荡器</td><td>NA</td><td>NA</td><td>用于 sOCTrP 和重悬干燥脂质</td></tr><tr><td>VWR 一次性硼硅酸盐玻璃培养管</td><td>VWR</td><td>47729572</td><td>13x100 mm 玻璃培养管</td></tr><tr><td>Water Hipersolve Chromanorm LC-MS</td><td>VWR</td><td>BDH83645.400</td><td></td></tr></tbody></table>

用于质谱分析的包埋于最佳切割温度化合物中的人体组织制备

Preparation of Human Tissues Embedded in Optimal Cutting Temperature Compound for Mass Spectrometry Analysis

鞘脂是一类在人体代谢和疾病中具有明确作用的细胞组分。质谱技术可用于检测鞘脂在疾病状态下是否发生改变，并探讨其是否可作为临床干预的靶点。然而，开展具有充分统计效能的前瞻性研究，直接从手术室获取组织样本，往往耗时较长，且在技术、后勤和管理方面均面临挑战。相比之下，回顾性研究可利用生物样本库中已有的大量冷冻保存的人体组织标本。从生物样本库获取组织的其他优势还包括能够获得与标本相关的组织学、病理学信息，以及在某些情况下可获取临床病理变量，这些信息均可用于与脂质组学数据进行相关性分析。然而，由于冷冻保存过程中常用的包埋介质——最佳切割温度化合物（OCT）与质谱分析存在兼容性问题，这构成了脂质分析的技术障碍。但我们先前已证明，通过反复洗涤和离心的步骤，可轻松去除生物样本库人源标本中的OCT，且不改变其鞘脂含量。我们还曾证实，用OCT包埋并冷冻保存的人体组织中的鞘脂在长达16年内保持稳定。在本报告中，我们详细阐述了对OCT包埋的人体组织标本进行鞘脂分析的步骤与工作流程，包括组织洗涤、称重以用于数据归一化、脂质提取、液相色谱-电喷雾电离串联质谱（LC-ESI-MS/MS）分析前的样品制备、质谱数据整合、数据归一化以及数据分析。

在本方案中，我们详细描述了一种从冷冻保存的人体组织中去除OCT并称重组织以进行LC-ESI-MS/MS分析的方法。材料表列出了本实验所需的材料。图1展示了一项典型实验的结果，其中10个人肺腺癌肿瘤组织和10个相应的正常邻近组织经洗涤去除OCT后，通过LC-ESI-MS/MS进行分析。重要的是，正如我们先前研究所示11，与正常的未受累邻近组织相比，肺腺癌肿瘤组织中多种不同碳链长度的神经酰胺（图1A）和单己糖基神经酰胺（图1B）显著升高。
为评估OCT对第4节所述脂质提取步骤的影响，进行了对照实验：取200 mg小鼠肝脏（C57BL6；雄性；14-16周龄），重悬于2 mL磷酸盐缓冲液中，充分匀浆至细碎状态。将所得细碎肝匀浆液使用探头式超声仪在冰上进行充分超声处理（60%功率，每次超声1分钟，冰上静置1分钟，重复三轮；采用微尖头...

鞘脂是一类具有生物活性的代谢物，在人类疾病中具有明确的作用。通过质谱技术对组织中的鞘脂变化进行表征，有助于揭示其在疾病发病机制中的作用，或发现潜在的治疗靶点。然而，生物样本库中用于冷冻保存组织的OCT包埋剂会干扰质谱分析。本文阐述了利用液相色谱-电喷雾电离-串联质谱法（LC-ESI-MS/MS）分析嵌入OCT中的人体组织内鞘脂的实验方法。

鞘脂类是具有明确代谢功能和疾病关联的细胞组分。质谱法可用于确定……

OCT 是一种与质谱分析不兼容的冷冻保存剂。通过本方案，研究人员可从组织中去除 OCT，并利用串联液相色谱-质谱法对鞘脂类进行定量分析。组织干燥芯吸材料的制备、组织洗涤和组织称重步骤将由弗吉尼亚联邦大学的 April Boyd 演示，脂质提取步骤将由弗吉尼亚联邦大学代谢组学与脂质组学核心实验室主任 Jeremy Allegood 博士演示。首先，将手术剪浸入甲醇中五分钟进行清洁，随后用洁净的实验级纸巾擦拭。佩戴无粉手套，将实验级纸巾的一端捻成细长的灯芯状，长度为30至40毫米。然后使用经甲醇清洁过的手术剪，在灯芯较粗的一端将其剪下，并放入洁净的纸板盒中。接下来，使用经甲醇清洗过的剪刀，将1毫升移液器吸头的尖端剪去4至5毫米，并将吸头放回吸头架中。为洗去组织中的OCT包埋剂，向每管含人肺组织的样本中加入10毫升冰冻的超纯去离子水，并盖紧管盖。将各管置于室温下孵育10分钟。剧烈涡旋振荡每个试管，直至附着在管壁或组织沉淀物上的所有组织完全重悬。然后将试管置于预冷的摆桶式离心机中，在4°C条件下以4,000至5,000 ×g离心10分钟。离心结束后，将试管置于冰上并打开管盖。小心吸去洗涤液，使约0.5毫升上清液保留在管中，然后盖上管盖。待所有管中上清液去除后，以相同方式再洗涤组织两次。完成三次OCT去除洗涤后，使用预先准备的短截移液吸头向管中加入500微升冰浴PBS。使用同一枪头，轻轻重悬沉淀，并将所有重悬的组织转移至预先标记并称重的1.5毫升离心管中。将离心管置于冰上，直至所有组织样本均完成转移。将离心管放入预冷的离心机中离心，使组织沉淀，然后小心吸除尽可能多的PBS，注意不要扰动沉淀，再将离心管放回冰上。使用先前制备的组织干燥吸水条，轻轻去除残留的洗涤液，然后关闭管盖并将离心管置于冰上。称重时，依次将离心管放入已校准并归零的分析天平中，并关闭天平室门。待重量稳定后，将数值记录至电子表格中。称重后，将离心管放回冰上，并加入 300 µL 冰冷的 PBS。使用截短的移液枪头，小心地将全部组织转移至已预先标记的螺口玻璃管中的 2 mL 冰冷甲醇中。在进行脂质提取前，将组织和质谱用内标脂质标准品置于室温下平衡 20 分钟，随后涡旋振荡，并将内标溶液浸入超声水浴中，直至脂质标准品完全溶解。使用多通道移液器，向每根试管中加入 250 皮摩尔的内标质谱标准品，并轻轻盖上管盖。为促进均质化，将甲醇体积调整至 2 毫升，然后使用匀浆器在试管壁上轻轻施加压力并以圆周运动方式研磨组织。当观察不到团块时，重新盖上试管管盖。将试管以45度角浸入超声水浴中，持续5到10秒。然后在通风橱内，向每支试管中加入氯仿和甲醇，使甲醇、氯仿与水的比例达到2:1:0.1。密封试管，并将其置于实验台面上直至当天结束。当晚离开前，将盖紧的试管放入48摄氏度水浴中过夜孵育。次日，通过离心沉淀溶剂和可溶性残渣。然后在通风橱中，小心地将上清液倾入预先标记的、倾斜30至45度角的13乘100毫米硼硅酸盐玻璃试管中，以利于倾倒。将所有试管中的上清液倾倒后，使用真空浓缩仪，在40摄氏度下加热一小时（最大真空度）以蒸发全部溶剂，然后向每支试管中加入500微升甲醇。为重新溶解干燥的脂质提取物，先将试管涡旋振荡5至10秒，随后将试管以45度角浸入超声水浴中，并旋转超声处理2分钟。再次涡旋振荡试管5秒，并再次浸入超声水浴中继续超声处理1分钟。通过离心去除不溶性残渣，然后将上清液倾入预先标记的自动进样小瓶中，小瓶应倾斜30至45度角，以方便倾倒。在将小瓶于-80摄氏度保存前，需 tightly 封盖。在去除OCT包埋剂后，采用液相色谱-电喷雾电离串联质谱分析证实，与正常邻近未受累组织相比，人肺腺癌肿瘤中不同链长的神经酰胺和单己糖基-神经酰胺种类显著升高。鞘脂类标准品的洗脱顺序如下：d17:1-鞘氨醇、d17:1-鞘氨醇-1-磷酸、C12-乳糖基神经酰胺、C12-单己糖基神经酰胺、C12-鞘磷脂和C12-神经酰胺。对于这些鞘脂类物质中的每一种，在采用文中所述梯度和仪器设置条件下，碳链长度每增加两个碳原子，保留时间大约正向增加0.15分钟。然而，对于C24和C26等较长碳链的脂质，其保留时间的变化可能更大。此外，脂肪酸中的双键通常会导致保留时间减少约0.15分钟。因此，C18:1 神经酰胺的保留时间将与 C16 神经酰胺相似。该实验方案不仅限于使用新鲜采集的组织，还可扩展质谱分析的组织来源，包括在生物样本库中低温保存的组织样本。

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