用于质谱分析的包埋于最佳切割温度化合物中的人体组织制备

OCT 是一种与质谱分析不兼容的冷冻保存剂。通过本方案，研究人员可从组织中去除 OCT，并利用串联液相色谱-质谱法对鞘脂类进行定量分析。组织干燥芯吸材料的制备、组织洗涤和组织称重步骤将由弗吉尼亚联邦大学的 April Boyd 演示，脂质提取步骤将由弗吉尼亚联邦大学代谢组学与脂质组学核心实验室主任 Jeremy Allegood 博士演示。

首先，将手术剪浸入甲醇中五分钟进行清洁，随后用洁净的实验级纸巾擦拭。佩戴无粉手套，将实验级纸巾的一端捻成细长的灯芯状，长度为30至40毫米。然后使用经甲醇清洁过的手术剪，在灯芯较粗的一端将其剪下，并放入洁净的纸板盒中。

接下来，使用经甲醇清洗过的剪刀，将1毫升移液器吸头的尖端剪去4至5毫米，并将吸头放回吸头架中。为洗去组织中的OCT包埋剂，向每管含人肺组织的样本中加入10毫升冰冻的超纯去离子水，并盖紧管盖。将各管置于室温下孵育10分钟。

剧烈涡旋振荡每个试管，直至附着在管壁或组织沉淀物上的所有组织完全重悬。然后将试管置于预冷的摆桶式离心机中，在4°C条件下以4,000至5,000 ×g离心10分钟。离心结束后，将试管置于冰上并打开管盖。

小心吸去洗涤液，使约0.5毫升上清液保留在管中，然后盖上管盖。待所有管中上清液去除后，以相同方式再洗涤组织两次。完成三次OCT去除洗涤后，使用预先准备的短截移液吸头向管中加入500微升冰浴PBS。

使用同一枪头，轻轻重悬沉淀，并将所有重悬的组织转移至预先标记并称重的1.5毫升离心管中。将离心管置于冰上，直至所有组织样本均完成转移。将离心管放入预冷的离心机中离心，使组织沉淀，然后小心吸除尽可能多的PBS，注意不要扰动沉淀，再将离心管放回冰上。

使用先前制备的组织干燥吸水条，轻轻去除残留的洗涤液，然后关闭管盖并将离心管置于冰上。称重时，依次将离心管放入已校准并归零的分析天平中，并关闭天平室门。待重量稳定后，将数值记录至电子表格中。

称重后，将离心管放回冰上，并加入 300 µL 冰冷的 PBS。使用截短的移液枪头，小心地将全部组织转移至已预先标记的螺口玻璃管中的 2 mL 冰冷甲醇中。在进行脂质提取前，将组织和质谱用内标脂质标准品置于室温下平衡 20 分钟，随后涡旋振荡，并将内标溶液浸入超声水浴中，直至脂质标准品完全溶解。

使用多通道移液器，向每根试管中加入 250 皮摩尔的内标质谱标准品，并轻轻盖上管盖。为促进均质化，将甲醇体积调整至 2 毫升，然后使用匀浆器在试管壁上轻轻施加压力并以圆周运动方式研磨组织。当观察不到团块时，重新盖上试管管盖。

将试管以45度角浸入超声水浴中，持续5到10秒。然后在通风橱内，向每支试管中加入氯仿和甲醇，使甲醇、氯仿与水的比例达到2:1:0.1。密封试管，并将其置于实验台面上直至当天结束。

当晚离开前，将盖紧的试管放入48摄氏度水浴中过夜孵育。次日，通过离心沉淀溶剂和可溶性残渣。然后在通风橱中，小心地将上清液倾入预先标记的、倾斜30至45度角的13乘100毫米硼硅酸盐玻璃试管中，以利于倾倒。

将所有试管中的上清液倾倒后，使用真空浓缩仪，在40摄氏度下加热一小时（最大真空度）以蒸发全部溶剂，然后向每支试管中加入500微升甲醇。为重新溶解干燥的脂质提取物，先将试管涡旋振荡5至10秒，随后将试管以45度角浸入超声水浴中，并旋转超声处理2分钟。再次涡旋振荡试管5秒，并再次浸入超声水浴中继续超声处理1分钟。

通过离心去除不溶性残渣，然后将上清液倾入预先标记的自动进样小瓶中，小瓶应倾斜30至45度角，以方便倾倒。在将小瓶于-80摄氏度保存前，需 tightly 封盖。在去除OCT包埋剂后，采用液相色谱-电喷雾电离串联质谱分析证实，与正常邻近未受累组织相比，人肺腺癌肿瘤中不同链长的神经酰胺和单己糖基-神经酰胺种类显著升高。

鞘脂类标准品的洗脱顺序如下：d17:1-鞘氨醇、d17:1-鞘氨醇-1-磷酸、C12-乳糖基神经酰胺、C12-单己糖基神经酰胺、C12-鞘磷脂和C12-神经酰胺。对于这些鞘脂类物质中的每一种，在采用文中所述梯度和仪器设置条件下，碳链长度每增加两个碳原子，保留时间大约正向增加0.15分钟。然而，对于C24和C26等较长碳链的脂质，其保留时间的变化可能更大。

此外，脂肪酸中的双键通常会导致保留时间减少约0.15分钟。因此，C18:1 神经酰胺的保留时间将与 C16 神经酰胺相似。该实验方案不仅限于使用新鲜采集的组织，还可扩展质谱分析的组织来源，包括在生物样本库中低温保存的组织样本。