利用BrdU-DNA标记联合细胞周期区分成像评估全基因组DNA双链断裂末端切除

本方案可实现细胞内DNA损伤后DNA及其末端切除的定量分析。该技术的主要优势在于能够标记细胞周期，将细胞限制在S期和G2期，从而确保溴脱氧尿苷信号来源于DNA末端切除过程。本实验操作将由首席研究员Jean-Yves Masson和博士后研究员Sofiane Y. Mersaoui进行演示。

在无菌培养罩内操作，根据所需条件数量，向六孔板的每个孔中放入单个盖玻片。每孔接种约150,000个HeLa细胞，用于转染或药物处理。在第三天，经终浓度为10 µM的BrdU过夜孵育后，使用X射线对培养板进行照射，总剂量为5 Gy。

照射后，将培养板放回37摄氏度、含5%二氧化碳的湿化培养箱中孵育3小时。进行预提取时，吸去培养基，并用PBS小心洗涤细胞两次。去除PBS后，加入2毫升预提取缓冲液A，将细胞在冰上于4摄氏度孵育10分钟。

孵育10分钟后，吸去缓冲液A，加入2毫升细胞骨架剥离缓冲液B，再次进行孵育。然后小心吸去缓冲液B，用PBS洗涤细胞。吸去PBS后，在通风橱中加入2毫升4%多聚甲醛固定细胞。

去除多聚甲醛并用 PBS 洗涤后，将盖玻片浸入 100% 冷甲醇中，在 -20 摄氏度孵育 5 分钟，随后用 PBS 洗涤盖玻片两次。为进行透化处理，将细胞与含有 0.5% Triton X-100 的 2 毫升 PBS 在室温下孵育。15 分钟后，用 2 毫升 PBS 洗涤盖玻片三次。

进行免疫染色时，向每个孔中加入两毫升封闭缓冲液。孵育一小时后，向每张盖玻片加入100微升一抗溶液。使用镊子将方形封口膜覆盖在盖玻片上，并小心地铺放封口膜，避免产生气泡。

然后用铝箔将培养板包好，置于湿盒中，4摄氏度下与一抗孵育过夜。次日，移除封口膜小方块，用2毫升PBS洗涤盖玻片三次。洗涤后，向每张盖玻片上加入100微升二抗溶液，并如图所示用封口膜小方块覆盖盖玻片。

将二抗在室温下孵育一小时，并用铝箔包裹以避光。随后用两毫升 1× PBS 将盖玻片洗涤三次。进行细胞核染色时，向每张盖玻片加入两毫升 DAPI 溶液，然后用 PBS 洗涤盖玻片。

在载玻片上加入10至20微升的免疫荧光专用封片剂。使用针头或精细镊子从孔底轻轻提起盖玻片。用纸巾轻触其一侧边缘，小心吸去多余液体，然后将盖玻片封固于载玻片上。

进行图像采集和分析时，将这些文件导入 CellProfiler，并使用斑点计数流程进行分析。根据文本稿件中描述的设置识别主要对象以确定焦点，并测量其强度。此处展示了辐照后 5-溴-2-脱氧尿苷焦点形成和增殖细胞核抗原染色的代表性图像。

生成的单链DNA轨迹表现为明显的焦点。所鉴定的焦点随后被定量，并表示为细胞核内溴脱氧尿苷染色的总整合强度。共染色显示了非同源末端连接导致的短程切除与同源重组的长程切除之间的区别，其中使用抗PCNA抗体来鉴定处于S期的细胞。

PCNA 在细胞核中显著表达，在细胞周期的 S 期达到最高表达水平，染色强度较强。随后将结果以散点图形式绘出，以区分 PCNA 阳性和 PCNA 阴性的细胞核。由于无论在何种条件下 BrdU 信号均较低，因此将 PCNA 阴性结果从数据集中剔除，以便进行基于 BrdU 强度的分析。

PCNA 阴性细胞核中的 BrdU 斑点总强度基线值为 900 个任意单位，而在 PCNA 阳性细胞核中，该值达到 1,800 AU。在 siRNA 对照条件下，PCNA 阳性细胞核中每个细胞核的 BrdU 斑点总强度约为 1,500 AU。在使用 siRNA 有效敲低 PARP-1 后，BrdU 斑点的强度显著增加至约 1,900 AU。

该技术可为同源重组的初始阶段提供关键见解，从而有助于确定某种蛋白质是否参与修复通路的第一步。预提取缓冲液的孵育时间必须严格控制。过度暴露于这些缓冲液将导致细胞过度脱落和背景信号增强。