使用BrdU-DNA标记结合细胞周期鉴别成像评估全球DNA双链末端切除术

该协议允许在纤维素中对DNA进行定量，并在DNA损伤后进行切除。该技术的主要优点是细胞周期标记，将细胞限制在S和G2相，确保溴脱氧尿苷信号来自DNA和切除。演示该程序的将是首席研究员Jean-Yves Masson和博士后研究员Sofiane Y.Mersaoui。

在无菌培养罩下工作，在六孔板的每个孔中放置一个盖玻片，以达到所需的条件。平板约150， 000个HeLa细胞用于转染或药物治疗。在第三天，在用BrdU以10微摩尔的终浓度孵育过夜后，用总剂量为5灰度的X射线照射照射板。

照射后，将板返回在37摄氏度下在5%氧化碳加湿的培养箱中孵育三小时。对于预提取，吸出培养基并用PBS仔细洗涤细胞两次。除去PBS后，加入两毫升预提取缓冲液A，并将细胞在冰上以4摄氏度孵育10分钟。

10分钟后，吸出缓冲液A，加入2毫升细胞骨架剥离缓冲液B，并重复孵育。然后小心地吸出缓冲液B并用PBS洗涤细胞。吸入PBS后，通过在化学罩下添加两毫升4%的多聚甲醛来固定细胞。

除去多聚甲醛并用PBS洗涤后，用100%冷甲醇盖住盖玻片，在零下20摄氏度下孵育五分钟，并用PBS洗涤盖玻片两次。为了透化，在室温下用两毫升含有0.5%Tritan X-100的PBS孵育细胞。15分钟后，用两毫升PBS清洗盖玻片三次。

对于免疫染色，向每个孔中加入两毫升封闭缓冲液。孵育一小时后，向每个盖玻片中加入100微升一抗溶液。使用镊子用方形的石蜡片覆盖盖玻片，并小心地放置胶片，以免产生气泡。

然后将板覆盖在铝箔中，并将一抗在加湿室中以4摄氏度孵育过夜。第二天，取出石膏板方块，用两毫升PBS清洗盖玻片三次。洗涤后，在每个盖玻片上加入100微升二抗溶液，并用一块正方形的副膜覆盖盖玻片，如图所示。

将二抗在室温下孵育一小时，并使用箔保护板免受光照。然后用两毫升1X PBS洗涤盖玻片三次。对于核染色，在每个盖玻片中加入两毫升DAPI溶液，并用PBS清洗盖玻片。

在显微镜载玻片上加入10至20微升IF特异性安装介质。使用针或细镊子从井底抬起盖玻片。通过轻轻拍打纸巾上的一个边缘，小心地吸走多余的液体，并将盖玻片安装在显微镜载玻片上。

对于图像采集和分析，请将这些文件导入CellProfiler并使用斑点计数管道对其进行分析。使用文本手稿中描述的设置确定主要对象以识别焦点并测量强度。这里显示了照射后5-溴-2-prime-脱氧尿苷病灶形成和增殖细胞核抗原染色的代表性图像。

生成的单链DNA轨迹被可视化为不同的病灶。然后将鉴定的病灶量化并表达为细胞核中溴脱氧尿苷染色的总综合强度。共染色显示，由于非同源末端连接而导致的短程切除与使用抗PCNA抗体鉴定通过S期的细胞的同源重组的长距离切除之间存在差异。

PCNA在细胞核中突出，在细胞周期的S期达到最大表达，染色相当强烈。然后将值中的结果绘制为散点图，以区分PCNA阳性和PCNA阴性核。PCNA阴性结果从数据集中删除，以便进行基于BrdU强度的分析，因为无论条件如何，BrdU信号都很低。

PCNA阴性核具有900个任意单位的BrdU病灶的基础综合强度，该值在PCNA阳性核中达到1， 800 AU。在siRNA控制条件下，PCNA阳性细胞核中每个细胞核的BrdU病灶的综合强度约为1， 500 AU。在使用siRNA有效敲低PARP-1后，观察到BrdU病灶的强度显着增加至约1， 900 AU。

该技术可以为同源重组的第一阶段提供关键见解，从而有助于确定蛋白质是否参与修复途径的第一步。必须严格保持预提取缓冲液的孵育时间。过度暴露于这些缓冲液会导致过度的细胞脱离和增加的背景信号。