Name: 使用BrdU-DNA标记结合细胞周期鉴别成像评估全球DNA双链末端切除术 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-04-28T15:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 44 s
Description: 学习使用BrdU-DNA标记结合细胞周期鉴别成像技术，在HeLa细胞中定量评估DNA双链末端切除术。该方法可区分同源重组与非同源末端连接修复通路，为研究PARP抑制剂耐药机制提供关键工具。

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我们感谢Marie-Christine Caron提供的出色技术指导。本研究获得了加拿大卫生研究院J.Y.M.（CIHR FDN-388879）的资助。J.-Y.M. 担任加拿大DNA修复与癌症治疗研究一等首席科学家。J.O'S 是魁北克健康科学基金会（FRQS）博士生研究员，S.Y.M. 是魁北克健康科学基金会（FRQS）博士后研究员。

1. 细胞培养、处理及盖玻片制备
注意：除照射外，所有细胞接种、转染和处理均应在无菌细胞培养罩内进行。
<ol>
	<li>第1天
	<ol>
		<li>在6孔板中，根据所需条件数量，每孔放置一个盖玻片。按需接种约150,000个HeLa细胞用于转染或药物处理。 
		注意：若进行转染，建议在接种时进行反向转染，或在接种数小时后进行正向转染以允许细胞贴壁。反向转染是指在加入细胞前先将转染混合物加至盖玻片上，从而使转染在细胞开始贴壁前即启动。相比之下，正向转染则是在细胞贴壁后（通常在次日）加入转染混合物。然而，只要给予足够时间使细胞贴壁，也可在同一天内完成正向转染。</li>
		<li>本方法使用4个孔：第1孔：siRNA对照（称为siCTRL）；第2孔：靶向PARP-1的siRNA（siPARP-1）；第3孔：未处理组；第4孔：在照射前1小时用5 µM BMN673处理的细胞。 
		注意：在本实验方案中，所有测试均在照射条件下进行（见第1.3节）。</li>
		<li>将细胞置于37 °C、5% CO2的加湿培养箱中过夜培养；尽管转染方案允许最长3天的培养时间。在BrdU处理前的培养时间取决于siRNA转染效率。若未进行转染，培养16小时已足够使细胞贴附于盖玻片并有一定生长。 
		注意：培养箱条件可根据所用细胞系进行调整。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>第2天
	<ol>
		<li>在适当的培养基中加入BrdU，终浓度为10 µM，孵育16小时（一个细胞周期）。 
		注意：BrdU溶液以二甲基亚砜配制；所用储存液浓度为10 mM，分装后保存于-20 °C。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>第3天
	<ol>
		<li>使用X射线照射仪对培养板进行总剂量为5 Gy的照射（根据照射仪类型调整照射剂量，例如小动物照射仪与台式照射仪）。有关所用照射仪的品牌和型号，请参见材料表。</li>
		<li>将培养板放回培养箱，让细胞恢复培养3小时。</li>
		<li>在3小时孵育期间，配制缓冲液A和缓冲液B，以及在1×磷酸盐缓冲液（PBS）中配制4%多聚甲醛（PFA）。 
		注意：缓冲液A、缓冲液B及蔗糖溶液应在固定当天新鲜配制，并使用新鲜蔗糖溶液以防止污染。
		<ol>
			<li>按照表1中描述的顺序配制缓冲液A（预提取缓冲液），体积为30 mL。 
			注意：1 M蔗糖溶液应在当天配制，以防止污染。</li>
			<li>按照表1中描述的顺序配制缓冲液B（细胞骨架剥离缓冲液），体积为30 mL。 
			&#8203;注意：缓冲液B必须按引用顺序配制，以避免Tween-20与脱氧胆酸钠溶液发生沉淀。</li>
			<li>在通风橱中配制4% PFA，每种条件2 mL（共10 mL）（见表1）。</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 提取前处理与固定
注意：所有提取前步骤和&#160;固定操作均在冰上或4 °C条件下进行，盖玻片始终保留在组织培养板中；仅在封片的最后一步才将盖玻片取出（见讨论部分）。
<ol>
	<li>预提取
	<ol>
		<li>吸除培养基，用 1× PBS 小心洗涤细胞两次，并移除 PBS。加入 2 mL 预提取缓冲液 A，立即在 4 °C 下孵育 10 分钟。 
		注意：在缓冲液 A 中的孵育时间不应延长。在预提取缓冲液中孵育时间过长会导致盖玻片上脱落的细胞数量增加。或者，可将样本置于冰上孵育，代替 4 °C 孵育。</li>
		<li>通过抽吸移除缓冲液 A。 
		注意：移除缓冲液 A 后不要洗涤盖玻片。请直接进行下一步。</li>
		<li>加入 2 mL 细胞骨架剥离缓冲液 B，立即在 4 °C 下孵育 10 分钟。小心抽吸缓冲液 B，并用 1× PBS 小心洗涤细胞一次。再小心吸除 1× PBS。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>固定
	<ol>
		<li>在通风橱内加入 2 mL 4% 多聚甲醛（PFA）固定细胞。 
		注意：PFA 具有毒性，必须在通风橱内操作。</li>
		<li>在室温下孵育 20 分钟。用 1× PBS 洗涤盖玻片两次，并吸除多余液体。</li>
		<li>用 100% 冷甲醇覆盖盖玻片，并在 -20 °C 下孵育 5 分钟。用 1× PBS 洗涤两次。 
		&#8203;注意：此处可暂停实验流程。如有需要，盖玻片可保存在 1× PBS 中并置于 4 °C，培养板用铝箔包裹。但继续进行免疫荧光（IF）实验前，细胞存放时间不应超过 5 天。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. 透化
<ol>
	<li>将细胞与含有0.5% Triton X-100的2 mL 1× PBS在室温下孵育15分钟。用2 mL 1× PBS洗涤盖玻片三次。</li>
</ol>
4. 免疫染色
<ol>
	<li>封闭步骤
	<ol>
		<li>准备足量的新鲜封闭缓冲液（含3% BSA的1×PBS），每张盖玻片使用2 mL。 
		&#8203;注意：额外准备5 mL封闭缓冲液用于配制抗体溶液。</li>
		<li>每孔加入2 mL封闭缓冲液，在室温下孵育1小时。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>一抗孵育
	<ol>
		<li>用新鲜封闭缓冲液配制一抗溶液：BrdU RPN202 稀释比例为1:1000，增殖细胞核抗原（PCNA）稀释比例为1:500，每张盖玻片使用100 µL。 
		注意：为节约抗体，可使用较小体积，22 × 22 mm盖玻片使用75–100 µL，18 × 18 mm盖玻片使用50–75 µL。</li>
		<li>在每张盖玻片上加入100 µL一抗溶液，用镊子将一片Parafilm覆盖在盖玻片上，并小心放置以避免产生气泡。</li>
		<li>用铝箔包裹培养板，在4 °C湿盒中过夜孵育一抗。</li>
		<li>移除Parafilm片，用2 mL无菌1×PBS洗涤盖玻片三次。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>二抗孵育
	<ol>
		<li>用新鲜封闭缓冲液配制足量的二抗溶液：用于BrdU的抗小鼠488荧光二抗A11011稀释比例为1:800，用于PCNA的抗兔568荧光二抗A11011稀释比例为1:800。 
		注意：可根据实验需求更换荧光染料颜色。所用具体品牌见材料表。</li>
		<li>在每张盖玻片上加入100 µL二抗溶液，用镊子将一片Parafilm覆盖在盖玻片上，并小心放置避免产生气泡。</li>
		<li>将培养板用铝箔包裹，在室温下孵育二抗1小时。</li>
		<li>用2 mL 1×PBS洗涤盖玻片三次。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>细胞核染色
	<ol>
		<li>按每张盖玻片2 mL的量，准备含4',6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）的1×PBS溶液，DAPI终浓度为1 µg/mL（1:1000）。</li>
		<li>在每张盖玻片上加入2 mL DAPI溶液，将培养板用铝箔包裹，在室温下孵育10分钟。用1×PBS洗涤盖玻片两次。</li>
		<li>用1×PBS覆盖盖玻片，使用针头或精细镊子从孔底轻轻提起盖玻片。将盖玻片边缘轻触纸巾，小心吸去多余液体。 
		注意：操作时注意不要掉落盖玻片，避免贴附细胞的平面接触纸巾。</li>
		<li>使用10–20 µL专用于免疫荧光的封片剂将盖玻片封固于载玻片上。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
5. 图像采集与分析
注意：图像采集可在多种荧光显微镜上进行。本实验使用配备63倍油镜的落射荧光显微镜；具体品牌和型号见材料表。根据细胞系和线粒体染色程度的不同，Z轴层扫图像并非必需，但可能具有应用价值。
<ol>
	<li>图像分析
	<ol>
		<li>对每幅图像，创建多个 tiff 文件；合并所有层面，但保持颜色通道分离。将这些文件导入 Cell Profiler（Broad 研究所 https://cellprofiler.org/home），并使用“斑点计数”流程进行分析（补充视频 1）。</li>
		<li>上传图像（补充图 S1A）。
		<ol>
			<li>开始创建项目时，在程序中加载斑点计数流程，并将待分析的图像加载至指定区域。</li>
			<li>使用 NamesAndTypes 模块为每幅图像分配一个有意义的名称，以便其他模块引用——C01：代表 BrdU 通道；C02：代表 PCNA 通道；C03：代表 DAPI 通道。 
			注意：这些标识符取决于显微镜；文件名中应有标识以区分不同通道。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>确定用于识别细胞核的文件，并为其命名（根据需要更改名称）（参见 补充图 S1B 和 补充图 S1C）。
		<ol>
			<li>选择对象直径在 50 至 300 像素单位之间，这是细胞核的可接受尺寸范围，但应根据图像中细胞核的实际大小调整该值。 
			注意：50 可能过大，导致较小的细胞核无法被识别；同样，300 可能导致多个聚集的细胞核被计为一个。</li>
			<li>丢弃直径范围之外的对象，以确保仅统计符合标准的对象。</li>
			<li>丢弃接触边界的对象，以排除可能仅部分位于视野中的细胞。</li>
			<li>应用阈值以适配特定图像。以下设置可作为示例参考。根据阈值策略的严格程度调整阈值校正因子。其他设置包括：阈值策略：全局（Global）；阈值方法：Otsu；双类或三类阈值：双类（Two class）；阈值平滑尺度：1；阈值平滑因子：1；阈值上下限：0.0 和 1.0；区分聚集对象的方法：形状（Shape）；划分聚集对象间边界线的方法：传播（Propagate）。 
			注意：对于每个参数，Cell Profiler 均提供相应的定义及变量设置的可选方案。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>识别主要对象以检测焦点（补充图 S2A）。
		<ol>
			<li>使用以下设置：选择输入图像：Maskedgreen；命名待识别的主要对象：BrdUFoci；对象典型直径：1–15；是否丢弃直径范围外的对象：是；是否丢弃接触图像边界的对象：否；阈值策略：自适应（Adaptative）；阈值方法：Otsu；双类或三类阈值：三类（Three class）；阈值平滑尺度：1；阈值平滑因子：3；平滑滤波器大小：4。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>测量强度（补充图 S2B）。
		<ol>
			<li>选择待测量的图像：OrigGreen。</li>
			<li>点击 添加另一幅图像。选择待测量的图像：PCNA。选择待测量的对象：Nuclei。 
			注意：这将用于测量 BrdU 和 PCNA 的强度——即最终用于作图的数据。</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

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<li>Caron, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Poly%28ADP-ribose%29+polymerase-1+antagonizes+DNA+resection+at+double-strand+breaks%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Poly(ADP-ribose) polymerase-1 antagonizes DNA resection at double-strand breaks.</a> Nature Communications. 10 (1), 2954(2019).</li>
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<li>Soniat, M. M., Myler, L. R., Kuo, H. -C., Paull, T. T., Finkelstein, I. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RPA+phosphorylation+inhibits+DNA+resection%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">RPA phosphorylation inhibits DNA resection.</a> Molecular Cell. 75 (1), 145-153 (2019).</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

本文介绍了一种利用免疫荧光染色（IF）在细胞内（in cellulo）检测DNA末端切除变化的方法。目前观察DNA切除效应的标准方法是通过RPA染色；然而，这是一种间接方法，可能受到DNA复制的干扰。此前已有基于BrdU掺入的DNA切除免疫荧光技术，用于对BrdU阳性与BrdU阴性细胞中的信号强度进行分类。但该方法可能因背景信号或线粒体染色导致非同源重组（HR）进行中的细胞被误判为阳性，从而产生较高的BrdU信号强度14,15,16。本文所述方法的主要创新之处在于引入了PCNA染色，从而可特异性选择细胞周期的S期和G2期细胞，确保所检测到的BrdU信号源于DNA末端切除，进而反映同源定向修复过程。
本方案的关键步骤是预提取；若省略此步骤，BrdU 焦点将不可见，而操作不当则会导致细胞完全脱落。缓冲液配制不当会导致预提取不充分，例如细胞骨架部分残留或背景信号增强。必须严格控制在预提...

DNA修复因子的调控是癌症治疗中一种不断发展的方法，尤其适用于DNA双链断裂（DSB）修复缺陷的肿瘤环境。抑制特定的修复因子是一种巧妙的策略，可使癌细胞对DNA损伤剂更加敏感。数十年的研究已发现多种DNA修复基因的突变可作为治疗策略选择的生物标志物1。因此，DNA修复领域已成为药物开发的中心，旨在提供广泛的治疗方案，推动个体化医学的发展。
DSB 通过两条主要途径进行修复：NHEJ 和 HR2。NHEJ 途径具有易错性，能够快速连接两个 DNA 末端，几乎不进行 DNA 末端加工，该过程涉及蛋白激酶（DNA-PKcs）、Ku70/80 复合物、53BP1 和 RIF1 蛋白3。相比之下，HR 是一种精确的修复机制，由 BRCA1 启动4。HR 修复中的一个关键步骤是 DNA 末端切除过程，即断裂末端被降解，产生具有 3'-OH 末端的单链（ss）DNA。BRCA1 促进下游蛋白的招募，形成参与 5' 到 3' 方向 DNA 切除的切除体复合物 MRN/RPA/BLM/DNA2/EXO15。
初始的末端切除通过MRE11的核酸内切酶活性完成，从而允许DNA2和EXO1核酸酶进一步加工。生成的单链DNA突出末端会迅速被复制蛋白A（RPA）包裹，以防止其进一步被降解。随后，BRCA2、PALB2和BRCA1参与介导RPA的置换，并组装RAD51核酸蛋白丝，这是同源定向修复机制所必需的。非同源末端连接（NHEJ）与同源重组（HR）之间的精确平衡对于基因组完整性的最佳维持至关重要。通路的选择取决于细胞周期阶段：在S期至G2期，DNA末端切除水平最高，且姐妹染色单体可作为修复模板，因此优先使用HR进行修复。
聚腺苷二磷酸核糖聚合酶1（PARP-1）是最早被招募到DNA双链断裂（DSB）位点的蛋白质之一。它调控着末端切除活性以及参与非同源末端连接（NHEJ）通路的下游效应因子的组装。5,6PARP-1 在 DNA 复制过程中也参与单链断裂修复7,8由于PARP在DNA修复中具有重要作用，PARP抑制剂（PARPi）被用作癌症治疗手段。在多种同源重组（HR）缺陷型癌症中，PARPi治疗会导致合成致死效应，原因是HR缺陷细胞无法通过替代途径修复累积的DNA损伤。9,10目前有四种获美国食品药品监督管理局（FDA）批准的PARP抑制剂：Olaparib、Rucaparib、Niraparib和Talazoparib（也称为BMN 673），这些药物用于多种乳腺癌和卵巢癌的治疗。11然而，PARP抑制剂耐药现象较为常见，其中一种可能的机制是同源重组功能的重新获得12. 在照射条件下，PARP-1 的缺失或抑制会扰乱 resectosome 机器的功能，导致较长的单链 DNA 片段累积13因此，对DNA切除的深入研究 体内 对于更清晰地理解DNA修复通路，以及后续开发治疗癌症的新策略和克服PARPi耐药性至关重要。 
已有多种方法被用于检测DNA切除事件5。其中一种方法是经典的基于免疫荧光（IF）的技术，该技术利用抗RPA抗体，在应激诱导的DNA双链断裂（DSB）后，对被切除的DNA进行间接染色和可视化观察。通过5-溴-2′-脱氧尿苷（BrdU）对基因组DNA进行标记，并仅检测单链DNA（ssDNA），可直接测量DNA切除事件。该方法避免了对RPA的监测，而RPA参与了DNA复制等多种细胞过程。本文所述方法中，细胞在单个细胞周期内与BrdU共孵育，使BrdU掺入正在复制的细胞DNA的一条链中。在发生切除后，在特定条件下进行免疫荧光染色，仅检测以单链形式存在的BrdU，使用抗BrdU抗体实现。该抗体只能识别暴露的BrdU核苷酸，而无法检测整合在双链DNA中的BrdU。通过荧光显微镜，可将被切除的DNA以点状BrdU/ssDNA灶的形式进行可视化观察。这些灶的核内荧光强度可作为读数，用于量化DNA损伤后的切除程度。本文逐步描述了该方法的操作流程，该方法可适用于大多数哺乳动物细胞系。作为一种概念验证，该方法应具有广泛的应用价值，为在细胞内（in cellulo）监测DNA末端切除提供一种简便手段。

<table><tbody><tr><td>Alexa 568 山羊抗兔</td><td>Molecular probes</td><td>A11011</td><td>1:800</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 山羊抗小鼠</td><td>Molecular probes</td><td>A11001</td><td>1:800</td></tr><tr><td>抗 PARP1 (F1-23)</td><td>自制</td><td></td><td>1:2500</td></tr><tr><td>抗 PCNA (SY12-07)</td><td>Novus</td><td>NBP2-67390</td><td>1:500</td></tr><tr><td>抗 α-微管蛋白 (DM1A)</td><td>Abcam</td><td>Ab7291</td><td>1:100000</td></tr><tr><td>抗 BrdU</td><td>GE Healthcare</td><td>RPN202</td><td>1:1000</td></tr><tr><td>台式X射线辐照仪</td><td>Cell Rad</td><td></td><td></td></tr><tr><td>BMN673</td><td>MedChem Express</td><td>HY-16106</td><td></td></tr><tr><td>溴脱氧尿苷 (BrdU)</td><td>Sigma</td><td>B5002</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma</td><td>A7906</td><td></td></tr><tr><td>Cell profiler</td><td>Broad Institute</td><td>V 3.19</td><td>https://cellprofiler.org/</td></tr><tr><td>Curwood Parafilm M 实验室封口膜 4英寸 / 250英尺</td><td>Fisher scientific</td><td>13-374-12</td><td></td></tr><tr><td>DAPI (4',6-二脒基-2-苯基吲哚，二盐酸盐)</td><td>Invitrogen Life Technology</td><td>D1306</td><td></td></tr><tr><td>DMEM 高糖</td><td>Fisher scientific</td><td>10063542</td><td></td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E3889</td><td></td></tr><tr><td>胎牛血清</td><td>Gibco</td><td>12483-020</td><td></td></tr><tr><td>Fisherbrand 盖玻片：22 x 22 平方形</td><td>Fisher scientific</td><td>12 541B</td><td></td></tr><tr><td>荧光显微镜</td><td>Leica</td><td>DMI6000B</td><td>63x 浸油物镜</td></tr><tr><td>HeLa</td><td>ATCC</td><td>CCL-2</td><td></td></tr><tr><td>HERACELL 160I CO&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; 培养箱 CU 1-21 TC 120V</td><td>VWR</td><td>51030408</td><td>37% CO&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td></tr><tr><td>MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>BioShop Canada</td><td>MAG520.500</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>BioShop Canada</td><td>SOD002.10</td><td></td></tr><tr><td>针头</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>PBS 1x</td><td>Wisent Bio Products</td><td>311-010-CS</td><td></td></tr><tr><td>PFA 16%</td><td>Cedarlane Labs</td><td>15710-S(EM)</td><td></td></tr><tr><td>PIPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P6757-100G</td><td></td></tr><tr><td>ProLong Gold 抗荧光淬灭封片剂</td><td>Invitrogen Life Technology</td><td>P-36930</td><td></td></tr><tr><td>RNAiMAX</td><td>Invitrogen</td><td>13778-075</td><td></td></tr><tr><td>siPARPi</td><td>Dharmacon</td><td></td><td>AAG AUA GAG CGU GAA GGC GAA dTdT</td></tr><tr><td>siRNA 对照</td><td>Dharmacon</td><td></td><td>UUCGAACGUGUCACGUCAA</td></tr><tr><td>脱氧胆酸钠</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D6750-100G</td><td></td></tr><tr><td>蔗糖</td><td>BioShop Canada</td><td>SUC507.5</td><td></td></tr><tr><td>Tris-base</td><td>BioShop Canada</td><td>TRS001.5</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Millipore Sigma</td><td>T8787-250ML</td><td></td></tr><tr><td>Tween20</td><td>Fisher scientific</td><td>BP337500</td><td></td></tr><tr><td>镊子</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

利用brdu-dna标记联合细胞周期区分成像评估全基因组dna双链断裂末端切除

Assessment of Global DNA Double-Strand End Resection using BrdU-DNA Labeling coupled with Cell Cycle Discrimination Imaging

DNA损伤应答（DDR）的研究是一个复杂且至关重要的领域，随着DDR靶向药物在癌症治疗中的应用，其重要性日益凸显。其中的靶点之一是多聚（ADP-核糖）聚合酶（PARPs），该酶可启动多种DNA修复途径。通过使用PARP抑制剂（PARPi）抑制这些酶，可在因乳腺癌1型（BRCA1）、BRCA2或BRCA2的伴侣与定位蛋白（PALB2）发生突变而导致同源重组（HR）缺陷的细胞中产生合成致死效应，从而带来治疗上的脆弱性。
经PARP抑制剂（PARPi）处理的细胞会积累DNA双链断裂（DSBs）。这些断裂由DNA末端切除机制进行加工，导致单链（ss）DNA的形成，进而启动DNA修复。在BRCA1缺陷的背景下，通过突变DNA切除抑制因子（如53BP1和DYNLL1）重新激活DNA切除过程，会导致细胞对PARPi产生耐药性。因此，能够在细胞内（in cellulo）监测DNA切除对于更清晰地理解DNA修复通路以及开发克服PARPi耐药性的新策略至关重要。基于免疫荧光（IF）的技术可用于在DNA损伤后监测全基因组范围的DNA切除情况。该策略需要使用5-溴-2′-脱氧尿苷（BrdU）对基因组DNA进行长时间脉冲标记。在DNA损伤及DNA末端切除发生后，所生成的单链DNA可在天然条件下被抗BrdU抗体特异性检测。此外，还可结合细胞周期标志物来研究DNA切除，以区分细胞周期的不同阶段。处于S/G2期的细胞可用于研究同源重组（HR）过程中的末端切除，而G1期细胞则可用于研究非同源末端连接（NHEJ）。本文详细描述了该IF方法与细胞周期区分相结合的实验方案。

在本实验方案中，采用基于溴脱氧尿苷（BrdU）的检测方法，定量测定HeLa细胞对辐射诱导损伤的切除反应。经免疫荧光染色后，生成的单链DNA（ssDNA）轨迹表现为明显的焦点结构（图1A）。所识别的焦点随后被定量分析，并以细胞核内BrdU染色的总整合强度表示（图1B、补充图S1、补充图S2和补充图S3）。虽然也可测量焦点数量或平均焦点强度，但由于BrdU焦点的大小存在变异性，其可靠性通常低于总核强度。
为了区分由NHEJ引起的短程切除与HR导致的长程切除，使用抗PCNA抗体进行共染色，以鉴定处于S期的细胞（图1 和 补充图S4）。PCNA构成DNA滑动夹，作为DNA聚合酶的持续性因子，在DNA复制过程中至关重要。PCNA在细胞核中显著存在，并在细胞周期的S期达到表达高峰。因此，在早期S期，PCNA信号较弱，...

在本实验方案中，我们演示了如何利用基于免疫荧光的方法，在细胞周期的 S/G2 期可视化 DNA 双链断裂末端的切除过程。

利用BrdU-DNA标记联合细胞周期区分成像评估全基因组DNA双链断裂末端切除

DNA损伤反应（DDR）的研究是一个复杂且至关重要的领域，随着靶向DDR药物的应用日益广泛，该领域的重要性不断提升……

本方案可实现细胞内DNA损伤后DNA及其末端切除的定量分析。该技术的主要优势在于能够标记细胞周期，将细胞限制在S期和G2期，从而确保溴脱氧尿苷信号来源于DNA末端切除过程。本实验操作将由首席研究员Jean-Yves Masson和博士后研究员Sofiane Y. Mersaoui进行演示。在无菌培养罩内操作，根据所需条件数量，向六孔板的每个孔中放入单个盖玻片。每孔接种约150,000个HeLa细胞，用于转染或药物处理。在第三天，经终浓度为10 µM的BrdU过夜孵育后，使用X射线对培养板进行照射，总剂量为5 Gy。照射后，将培养板放回37摄氏度、含5%二氧化碳的湿化培养箱中孵育3小时。进行预提取时，吸去培养基，并用PBS小心洗涤细胞两次。去除PBS后，加入2毫升预提取缓冲液A，将细胞在冰上于4摄氏度孵育10分钟。孵育10分钟后，吸去缓冲液A，加入2毫升细胞骨架剥离缓冲液B，再次进行孵育。然后小心吸去缓冲液B，用PBS洗涤细胞。吸去PBS后，在通风橱中加入2毫升4%多聚甲醛固定细胞。去除多聚甲醛并用 PBS 洗涤后，将盖玻片浸入 100% 冷甲醇中，在 -20 摄氏度孵育 5 分钟，随后用 PBS 洗涤盖玻片两次。为进行透化处理，将细胞与含有 0.5% Triton X-100 的 2 毫升 PBS 在室温下孵育。15 分钟后，用 2 毫升 PBS 洗涤盖玻片三次。进行免疫染色时，向每个孔中加入两毫升封闭缓冲液。孵育一小时后，向每张盖玻片加入100微升一抗溶液。使用镊子将方形封口膜覆盖在盖玻片上，并小心地铺放封口膜，避免产生气泡。然后用铝箔将培养板包好，置于湿盒中，4摄氏度下与一抗孵育过夜。次日，移除封口膜小方块，用2毫升PBS洗涤盖玻片三次。洗涤后，向每张盖玻片上加入100微升二抗溶液，并如图所示用封口膜小方块覆盖盖玻片。将二抗在室温下孵育一小时，并用铝箔包裹以避光。随后用两毫升 1× PBS 将盖玻片洗涤三次。进行细胞核染色时，向每张盖玻片加入两毫升 DAPI 溶液，然后用 PBS 洗涤盖玻片。在载玻片上加入10至20微升的免疫荧光专用封片剂。使用针头或精细镊子从孔底轻轻提起盖玻片。用纸巾轻触其一侧边缘，小心吸去多余液体，然后将盖玻片封固于载玻片上。进行图像采集和分析时，将这些文件导入 CellProfiler，并使用斑点计数流程进行分析。根据文本稿件中描述的设置识别主要对象以确定焦点，并测量其强度。此处展示了辐照后 5-溴-2-脱氧尿苷焦点形成和增殖细胞核抗原染色的代表性图像。生成的单链DNA轨迹表现为明显的焦点。所鉴定的焦点随后被定量，并表示为细胞核内溴脱氧尿苷染色的总整合强度。共染色显示了非同源末端连接导致的短程切除与同源重组的长程切除之间的区别，其中使用抗PCNA抗体来鉴定处于S期的细胞。PCNA 在细胞核中显著表达，在细胞周期的 S 期达到最高表达水平，染色强度较强。随后将结果以散点图形式绘出，以区分 PCNA 阳性和 PCNA 阴性的细胞核。由于无论在何种条件下 BrdU 信号均较低，因此将 PCNA 阴性结果从数据集中剔除，以便进行基于 BrdU 强度的分析。PCNA 阴性细胞核中的 BrdU 斑点总强度基线值为 900 个任意单位，而在 PCNA 阳性细胞核中，该值达到 1,800 AU。在 siRNA 对照条件下，PCNA 阳性细胞核中每个细胞核的 BrdU 斑点总强度约为 1,500 AU。在使用 siRNA 有效敲低 PARP-1 后，BrdU 斑点的强度显著增加至约 1,900 AU。该技术可为同源重组的初始阶段提供关键见解，从而有助于确定某种蛋白质是否参与修复通路的第一步。预提取缓冲液的孵育时间必须严格控制。过度暴露于这些缓冲液将导致细胞过度脱落和背景信号增强。

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使用BrdU-DNA标记结合细胞周期鉴别成像评估全球DNA双链末端切除术

哺乳动物细胞中DNA双链断裂（DSB）修复的分析

通过本方案，利用流式细胞术可轻松测定细胞群体的细胞周期位置，或了解信号如何影响细胞增殖。我们报告了一种简单的实验方法，用于对细胞进行染色并定量分析其在细胞周期中的位置。...

哺乳动物细胞周期位置分析

通过联合使用BrdU对核酸进行代谢标记以及碘化丙啶对总基因组DNA染色，可实现对细胞周期各阶段进展及动力学的细微变化进行追踪。该方法无需对增殖细胞进行化学同步化处理，从而避免了非特异性DNA损伤的引入，进而防止对细胞周期进程造成影响。...

利用代谢标记与流式细胞术测量细胞周期进程动力学

在怀孕小鼠中给予两种胸苷类似物EdU和BrdU，可分析胚胎小鼠脑内神经细胞和前体细胞的细胞周期进程。该方法有助于确定基因毒性应激（包括电离辐射）对脑发育的影响。...

评估基因毒性应激后小鼠发育大脑中神经干细胞与前体细胞的细胞周期进程

双链DNA断裂的修复是一个动态过程，不仅需要在断裂位点形成修复复合物，还要求在损伤被处理后对这些复合物进行解聚。本文中，我们采用免疫荧光显微技术，针对瞬时性和持久性双链断裂，作为解析基因组维持机制的工具。...

通过免疫荧光显微镜表征瞬时性和持久性DNA双链断裂中的DNA修复过程

该方法结合了DNA双链断裂（DSBs）的定量分析、细胞周期分布和细胞凋亡检测，能够实现针对细胞周期特异性的DSB诱导与修复评估，以及修复失败所导致后果的分析。...

细胞周期特异性检测基因毒性应激后γH2AX与细胞凋亡的流式细胞术方法

利用5-乙炔基-2'-脱氧尿苷（EdU）和磷酸化组蛋白H3（pH3）标记进行细胞周期分析是一种多步骤实验流程，可能需要进行大量优化。本文提供了一个详细方案，描述了该流程的全部步骤，包括图像分析和定量方法，以区分处于不同细胞周期阶段的细胞。...

5-乙炔基-2'-脱氧尿苷/磷酸化组蛋白 H3 双标记细胞周期进程分析方案 果蝇 神经干细胞

本文介绍了一种基于流式细胞术的单细胞水平多重衰老相关标志物的可视化与定量分析方法。...

同时成像与基于流式细胞术的多重荧光衰老标志物检测在治疗诱导的癌细胞衰老中的应用

以下实验方案介绍了通过细胞周期同步化后进行RPA2免疫荧光染色，以检测细胞周期G1期中单链DNA焦点的方法。...

可视化细胞周期G1期中的单链DNA焦点

我们介绍了利用基于发光的染色体外报告底物体系来评估细胞中双链断裂修复通路功能完整性的实验方案。...

基于高通量定量发光报告系统的DNA双链断裂修复活性评估

学习使用BrdU-DNA标记结合细胞周期鉴别成像技术，在HeLa细胞中定量评估DNA双链末端切除术。该方法可区分同源重组与非同源末端连接修复通路，为研究PARP抑制剂耐药机制提供关键工具。

利用BrdU-DNA标记联合细胞周期区分成像评估全基因组DNA双链断裂末端切除

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