Name: 体外 使用小鼠胚胎干细胞进行血管疾病建模和药物测试的血管生成的三维发芽测定 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-05-11T14:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 4 s
Description: 了解利用小鼠胚胎干细胞进行三维血管生成发芽测定的实验方法，该模型可在体外模拟血管疾病并进行药物筛选。此技术为研究血管发育机制及高通量筛选提供了可靠平台。

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本工作获得了荷兰健康研究与医疗创新组织（ZonMW 446002501）、Health Holland（LSHM19057-H040）、Marie Skłodowska-Curie COFUND 领导学者计划以及 Rendu-Osler 疾病协会（AMRO）资助项目的资助。

1. mESC 培养基的制备与细胞培养
<ol>
	<li>使用补充了1× Glasgow MEM（G-MEM BHK-21）培养基、10%（体积比）热灭活胎牛血清（FBS）、0.05 mM β-巯基乙醇、1× 非必需氨基酸（NEAA 1×）、2 mM L-谷氨酰胺和1 mM 丙酮酸钠的培养基制备条件培养基 +/-（CM+/-）。</li>
	<li>在CM+/-培养基中添加白血病抑制因子（LIF）（1,500 U/mL）和0.1 mM β-巯基乙醇，制备条件培养基 +/+（CM+/+）。</li>
	<li>在CM+/+培养基中加入两种抑制剂PD0325901（1 µM）和CHIR99021（3 µM），制备含两种抑制剂的条件培养基 +/+（CM+/+ 2i）。</li>
	<li>将25 mL预热的2%明胶溶液加入500 mL不含钙和镁的磷酸盐缓冲液（DPBS）中，混匀，配制0.1%明胶溶液。</li>
	<li>通过将胰蛋白酶（2.5%）与TVP 1×溶液（含9.5% 10× DPBS、1 mM EDTA、0.01%鸡血清、0.01%胰蛋白酶（2.5%）的H2O溶液）按1:10（体积比）混合，配制10×胰蛋白酶-Versene磷酸盐（TVP 10x）缓冲液。 
	注意：所有溶液均需经0.22 µm孔径滤器过滤。长期储存时，培养基应保存于-20 °C；其他试剂可在4 °C保存最多3周（参见材料表）。</li>
	<li>用0.1%明胶溶液（每孔500 µL）包被两块12孔细胞培养板，并在CO2培养箱中（37 °C，5% CO2，湿润环境）孵育30分钟。</li>
	<li>用PBS洗涤明胶包被的培养板，每孔加入500 µL CM+/-培养基。</li>
	<li>在37 °C水浴中解冻两管冷冻保存的经辐照处理的小鼠胚胎成纤维细胞（MEFs，每管1 × 106个细胞），将细胞悬液转移至锥形管中，并加入5 mL CM+/-培养基。</li>
	<li>在室温（RT）下以200 × g离心5分钟。吸除上清液，将细胞沉淀轻柔重悬于12 mL CM+/-培养基中，终浓度为每毫升1.67 × 105个细胞。</li>
	<li>将500 µL MEF悬液接种至12孔细胞培养板中（接种密度为2.4 × 105个细胞/cm2），并在CO2培养箱中过夜（o/n）孵育。</li>
	<li>在CM+/+ 2i培养基中解冻一管冷冻保存的小鼠胚胎干细胞（mESCs，1 × 106个细胞）。</li>
	<li>将mESC悬液接种至预先用PBS洗涤过的、已铺有MEFs的12孔板中，加入1 mL CM+/+ 2i培养基，随后将培养板置于CO2培养箱中培养。每日更换培养基。</li>
	<li>当细胞融合度达到70%时，用DPBS洗涤mESC克隆。每孔加入150 µL预热的10× TVP缓冲液，在室温下孵育30秒以启动酶解消化。</li>
	<li>小心吸除TVP缓冲液，将细胞重悬于1 mL CM+/+ 2i培养基中，并通过轻柔吹打将克隆解离为单细胞悬液。</li>
	<li>将细胞传代至新的含有MEFs的12孔细胞培养板中（传代比例为1:3–1:5）。轻柔混匀以均匀分布细胞，并置于CO2培养箱中继续培养。</li>
	<li>每日更换培养基（2–3 mL），观察细胞生长状态和形态。每2天在细胞融合度达70%时进行连续传代。在启动细胞分化前，连续使用CM+/+培养基传代两次。</li>
</ol>
2. 悬滴法形成拟胚体
<ol>
	<li>通过在CM+/-培养基中添加碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）（50 ng·mL-1）和骨形态发生蛋白4（BMP-4）（5 ng·mL-1）配制新鲜的中胚层分化培养基，并于4 °C保存备用。</li>
	<li>用500 µL的0.1%明胶溶液包被6孔细胞培养板中的一个孔，置于CO2培养箱中孵育30分钟。</li>
	<li>用PBS洗涤明胶包被的培养板，并加入500 µL CM+/-培养基。</li>
	<li>为获得纯的小鼠胚胎干细胞（mESCs）群体，使用10倍体积的TVP缓冲液在室温下消化细胞培养板30秒，将细胞重悬于1 mL中胚层分化培养基中，然后转移至明胶包被的6孔板中孵育30分钟，使MEFs贴壁而mESCs保持悬浮状态。</li>
	<li>将细胞悬液收集至50 mL锥形管中，使用Neubauer血细胞计数板和台盼蓝染料进行活/死细胞计数排除法计数细胞。</li>
	<li>在室温下以200 × g离心5分钟，弃去上清液，将细胞沉淀重悬于中胚层分化培养基中，调整细胞密度至4.55 × 104 个细胞/mL。</li>
	<li>在94 mm低吸附聚苯乙烯培养皿底部加入15 mL无菌水。 
	&#8203;注意：使用三维出芽血管生成实验检测一个特定条件时，需要四个含有悬滴（每滴3.52 mL培养基中含有1.6 × 105个细胞）的培养皿。</li>
	<li>将细胞悬液转移至无菌塑料储液槽中，并用多通道移液器的四个通道分别吸取22 µL细胞悬液（每22 µL液滴含1 × 103个细胞）。</li>
	<li>提起并翻转94 mm培养皿的盖子，将其内表面朝上放置于超净工作台的洁净表面上。</li>
	<li>在每个盖子的内表面沉积40滴细胞悬液。小心翻转盖子，避免扰动液滴，然后将其放回培养皿上，使液滴朝向水面。</li>
	<li>将培养皿置于CO2培养箱中孵育。将此日记为分化第0天。继续培养4天以形成拟胚体（EBs）。</li>
</ol>
3. 拓端细胞位置的竞争实验
<ol>
	<li>按照先前所述方法培养一种荧光标记和一种非荧光标记的mESC&#160;细胞系13。例如，使用黄色标记的7ACS/EYFP mESC和R1 mESC。</li>
	<li>通过将两种mESC细胞系以等量混合（1:1比例）制备嵌合体EB，并将悬滴培养皿置于CO2培养箱中孵育，具体操作如步骤2所述。</li>
</ol>
4. 血管分化用悬浮 EB 培养
<ol>
	<li>在收集悬滴中的EBs之前，准备以下试剂和材料。
	<ol>
		<li>在H2O中配制5%琼脂溶液，并通过高压灭菌（120 °C下20分钟）进行灭菌。</li>
		<li>使用预热的5%琼脂溶液制备含1%琼脂的G-MEM BHK-21培养基，并迅速向一个60 mm的聚苯乙烯培养皿中倒入3 mL。室温下静置1小时使琼脂凝固。使用前将培养皿保存于4 °C。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>通过在CM+/-培养基中添加bFGF（100 ng·mL-1）和VEGF-A（50 ng·mL-1）配制新鲜的2倍血管分化培养基。将培养基保存于4 °C直至使用。</li>
	<li>使用P1000移液器将悬滴收集至15 mL锥形离心管中，在EBs沉降数分钟后移除上清液。</li>
	<li>将EBs重悬于3 mL的2倍血管分化培养基中，将EB悬液转移至一个琼脂包被的培养皿中，并均匀分布EBs以避免聚集。</li>
	<li>将培养皿置于CO2培养箱中培养，并每隔2天更换一次培养基，直至第9天，使用含bFGF（50 ng·mL-1）和VEGF-A（25 ng·mL-1）的1倍血管分化培养基。</li>
	<li>或者，在血管分化培养基中添加血小板源性生长因子-BB（PDGF-BB）（第4天添加10 ng·mL-1，第6天和第8天添加5 ng·mL-1），以促进壁细胞分化。</li>
</ol>
5. 流式细胞术分析
<ol>
	<li>使用 P1000 移液器将培养 9 天的拟胚体收集至 15 mL 圆锥形离心管中，并用预热的 PBS 洗涤一次。</li>
	<li>加入含有 0.2 mg·mL-1 胶原酶 A 的 1 mL G-MEM BHK-21 培养基，将细胞置于 CO2 培养箱中孵育 5 分钟。</li>
	<li>使用 P1000 移液器轻轻吹打，使拟胚体解离。</li>
	<li>加入含 10% FBS 的 1 mL 冷 G-MEM BHK-21 培养基，以终止胶原酶活性。</li>
	<li>在室温下以 200 x g 离心 5 分钟。</li>
	<li>将细胞重悬于含 2% FBS 的 500 µL PBS 中。</li>
	<li>使用纽鲍尔血细胞计数板对细胞进行计数。</li>
	<li>每种染色条件下，将 400,000 个细胞重悬于含 2% FBS 的 100 µL PBS 中。</li>
	<li>在 4 °C 下用以下抗体孵育细胞 45 分钟：APC 标记的抗小鼠 PECAM-1 抗体（克隆号 MEC13.3）和 FITC 标记的抗小鼠 CD45 抗体（克隆号 30-F11），或相应的同型对照抗体。</li>
	<li>用含 2% FBS 的 1 mL PBS 洗涤细胞两次。</li>
	<li>将细胞重悬，使其最终浓度达到每毫升 5 x 106 个细胞。</li>
	<li>使用带细胞筛网 snap cap 的圆底聚苯乙烯试管过滤细胞。</li>
	<li>通过流式细胞术分析 20,000 个 PECAM-1 (+) 事件。</li>
</ol>
6. 三维出芽型血管生成实验与免疫荧光染色
<ol>
	<li>第9天，通过向GMEM BHK-1培养基中添加10% FBS（体积比）、bFGF（50 ng·mL-1）、VEGF-A（25 ng·mL-1）、人重组促红细胞生成素（hEPO）（20 ng·mL-1）、人白细胞介素-6（IL-6）（10 ng·mL-1）、0.05 mM β-巯基乙醇、NEAA（1×）、L-谷氨酰胺（1×）、丙酮酸钠（1×）、I型大鼠尾胶原（1.25 mg·mL-1）和NaOH（3.1 mM），配制出芽培养基。</li>
	<li>为防止胶原凝胶化，将出芽培养基置于冰上保存直至使用。</li>
	<li>为评估促/抗血管生成分子的作用，将选定的药物或溶剂以选定浓度加入出芽培养基中。</li>
	<li>从一个60 mm的琼脂培养皿中收集培养9天的胚胎体（EBs），转移至15 mL圆锥形离心管中（相当于一个实验条件），静置数分钟后弃去上清液。</li>
	<li>用1 mL出芽培养基覆盖35 mm培养皿底部，并在37 °C孵育5分钟以诱导凝胶形成。</li>
	<li>将EBs重悬于2 mL冷的出芽培养基中。</li>
	<li>将细胞悬液转移至已涂有第一层出芽培养基的35 mm培养皿中。</li>
	<li>将EBs均匀分布于培养皿中，确保彼此间距相等。将培养皿置于CO2培养箱中孵育。首次出芽通常在24–48小时内出现。</li>
	<li>第12天，使用刮勺小心地将含有EBs的胶原凝胶转移至载玻片（75 × 26 mm）上。</li>
	<li>用移液器（P1000）吸除多余液体，并在凝胶表面覆盖一层尼龙纱布和吸水滤纸（凝胶 blotting paper），以去除水分。放置250 g重物施加压力2分钟。小心移除尼龙纱布和滤纸，将载玻片在室温下晾干30分钟。</li>
	<li>在室温下用PBS洗涤载玻片三次，每次5分钟。</li>
	<li>使用锌固定液（见材料表）在4 °C过夜固定EBs。或者，在避光条件下用4%多聚甲醛（PFA）在4 °C过夜固定荧光嵌合型EBs。</li>
	<li>去除固定液，在室温下用PBS洗涤载玻片五次，每次5分钟。</li>
	<li>在含0.1% Triton-X100的PBS中室温孵育15分钟，以通透EBs。</li>
	<li>去除通透液，在室温下用PBS洗涤载玻片五次，每次5分钟。</li>
	<li>将EBs在封闭缓冲液（含2%牛血清白蛋白BSA的PBS）中室温孵育1小时。</li>
	<li>为染色内皮出芽结构，使用大鼠抗小鼠抗PECAM-1一抗（1:100稀释）在封闭缓冲液中4 °C过夜孵育。</li>
	<li>用PBS洗涤载玻片五次，每次5分钟。</li>
	<li>在封闭缓冲液中加入山羊抗大鼠Alexa 555二抗（1:250稀释），并在需要时同时加入FITC标记的抗α-SMA抗体（1:250稀释）以染色壁细胞，在室温避光条件下孵育2小时。</li>
	<li>在室温下用PBS洗涤载玻片三次，每次5分钟，最后用H2O洗涤一次，然后进行封片。</li>
</ol>
7. 胚体血管内皮出芽的共聚焦成像、形态测量及定量分析
<ol>
	<li>使用共聚焦显微镜通过焦平面合并（z轴堆叠）获取免疫染色胚胎体（EBs）的高分辨率图像。采用10倍物镜对整个胚胎体进行成像。</li>
	<li>使用ImageJ分析所获得的图像，根据已建立的定量方法13,14,21评估形态学特征，并量化PECAM-1阳性内皮细胞出芽的特性。
	<ol>
		<li>通过手动计数每个单独胚胎体的总出芽数，计算每个胚胎体的平均出芽数。</li>
		<li>使用ImageJ绘图工具测量单个出芽的长度。将内皮出芽的基部定义为胚胎体核心区域起始处，并手动绘制一条线至出芽顶端。</li>
		<li>通过手动计数每个单独出芽中的顶端细胞数量，计算每个出芽的平均顶端细胞数，然后计算每个胚胎体的平均值。</li>
		<li>通过手动确定母体出芽的轴线，并使用ImageJ软件的角度工具测量其间的锐角，计算丝状伪足的取向。统计取向角度&#62;50°的出芽数量，并将其除以目标胚胎体的总出芽数。 
		注：角度范围始终为0°至90°。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>使用共聚焦显微镜获取免疫染色胚胎体的高分辨率图像。采用40倍物镜对单个内皮出芽进行高分辨率成像。</li>
	<li>使用ImageJ软件量化由α-SMA阳性间质细胞（MCs）包围的PECAM-1阳性内皮细胞出芽的血管覆盖面积。
	<ol>
		<li>将合并的图像拆分为独立的红色和绿色通道。</li>
		<li>将图像转换为二值图像。</li>
		<li>分别测量由PECAM-1（红色标记的内皮细胞）和α-SMA（绿色标记的间质细胞）阳性细胞占据的出芽总细胞面积。</li>
		<li>使用图像计算器功能和AND运算符生成合并图像，并测量该图像的总细胞面积。为计算覆盖面积，将共定位图像的面积除以PECAM-1二值图像的面积。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>为分析由嵌合胚胎体发育出的出芽中内皮顶端细胞/ stalk细胞位置的细胞竞争情况，根据荧光信号手动评分顶端细胞数量并标记其基因型来源。计算每个胚胎体的平均值。</li>
</ol>

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</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

本方案描述了一种无偏倚、稳健且可重复的基于三维胚胎体（3D EB）的血管出芽检测方法，适用于筛选调控血管生成的药物和基因。与广泛使用的二维（2D）内皮细胞培养检测方法（如利用人脐静脉内皮细胞（HUVECs）监测细胞迁移的侧向划痕实验或Boyden小室实验）相比，该方法具有多项优势。22,23&#160;或细胞增殖（细胞计数、DNA合成检测、增殖标志物检测或代谢活性检测）24 因为它能独特地实现对内皮细胞和壁细胞分化及其组装成血管网络的研究，该网络可模拟出芽性血管生成的关键步骤。这些步骤包括内皮尖端细胞的选择、茎细胞的增殖、血管芽的空间定向与迁移，以及壁细胞向新生血管的募集25它还为许多三维血管生成模型提供了优势。纤维蛋白珠26,27 或胶原凝胶实验28,...

在过去三十年中，基于靶点的药物发现（TDD）已被制药行业广泛应用于新药研发。TDD 依赖于一个在疾病中起关键作用的明确分子靶点，并采用相对简单的细胞培养系统和药物筛选检测方法1。TDD 项目中常用的典型疾病模型大多包括传统细胞培养方法，例如在人工环境和非生理基质中培养的癌细胞或永生化细胞系。尽管这些模型中的许多已为识别成功的候选药物提供了有效的工具，但由于其与疾病的相关性较差，这类系统的应用仍存在疑问2。
对于大多数疾病而言，其潜在机制确实十分复杂，通常涉及多种细胞类型、独立的信号通路以及多组基因共同参与特定疾病表型的形成。即使是单基因突变作为主要病因的遗传性疾病，情况也是如此。随着近年来人类诱导多能干细胞（iPSC）技术与基因编辑工具的出现，现已能够构建三维类器官和器官芯片疾病模型，这些模型可更真实地模拟体内人类生理的复杂性3,4。此类技术的发展，重新激发了人们对表型药物发现（PDD）项目的兴趣1。PDD 可被视为一种经验性筛选方法，因其不依赖于对特定药物靶点身份的了解，也不依赖于对其在疾病中作用机制的假设。目前，PDD 策略被越来越广泛地认为在首创药物（first-in-class drugs）的发现中具有重要推动作用5。由于人类类器官和器官芯片技术仍处于发展初期，预计在不久的将来，结合创新成像技术和机器学习工具6,7的 iPSC 模型将提供多种新型、复杂的基于细胞的疾病模型，用于药物筛选及相关 PDD 项目，从而克服靶点导向药物发现（TDD）方法效率低下的问题8,9。
尽管人类类器官和器官芯片模型能够为揭示疾病复杂性及新药发现提供重要见解，但将药物推进至新的临床应用仍高度依赖动物模型所提供的疗效与安全性数据。其中，基因修饰小鼠无疑是首选的哺乳动物模型。这类模型具有多种优势：作为哺乳动物，其世代周期相对较短，许多表型与人类疾病相似，并且易于进行遗传操作。因此，基因修饰小鼠被广泛应用于药物发现项目中10然而，在小鼠与人类之间建立有效的转化桥梁仍然是一个重要的挑战11. 发育过程 体外 可与人类类器官和器官芯片模型相媲美的小鼠模型有望在一定程度上弥补这一空白，因为它将允许在小鼠与人类模型之间直接比较药物的有效性和安全性 体内 小鼠和 体外 人类数据
本文介绍了一种在小鼠类胚体（EBs）中进行的血管出芽检测方法。血管由内皮细胞（血管壁的内层衬里）和壁细胞（血管平滑肌细胞&#160;和周细胞）组成12。该实验方案基于小鼠胚胎干细胞（mESCs）通过悬滴法分化形成具有血管结构的类胚体，可模拟de novo内皮细胞与壁细胞的分化过程13,14。小鼠胚胎干细胞可从具有不同遗传背景的第3.5天小鼠囊胚中分离并轻松建立体外培养体系15。此外，该系统还适用于克隆分析、谱系示踪，并可通过简便的遗传操作构建疾病模型13,16。
由于血管为所有器官提供营养，因此几乎所有的疾病（如果不是全部的话）都与微血管系统的变化相关。在病理条件下，内皮细胞可进入活化状态或发生功能障碍，导致血管壁细胞死亡或从血管壁迁移。这些变化可能引起过度的血管生成或血管稀疏，诱发异常血流以及血管屏障缺陷，导致免疫细胞外渗和炎症反应。12,17,18,19因此，针对调节血管的药物开发研究&#160;高，并且已鉴定出多个可用于治疗靶向的分子参与者和概念。在此背景下，所描述的方案特别适用于构建疾病模型和药物筛选，因为它重现了关键特征 体内 出芽性血管生成，包括内皮顶端细胞和茎细胞的选择、内皮细胞迁移与增殖、内皮细胞导向、管状结构形成以及壁细胞募集。该模型还与近期报道的基于人iPSC技术的3D血管检测方法具有相似性20.

<table><tbody><tr><td>2-巯基乙醇</td><td>密理博，默克</td><td>805740</td><td>生物危害：处理时应采取适当的安全防护措施</td></tr><tr><td>Noble 琼脂</td><td>Difco，BD Pharmigen</td><td>214220</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluo 555 山羊抗大鼠 IgG</td><td>Life technologies</td><td>A21434</td><td></td></tr><tr><td>APC标记的大鼠抗小鼠PECAM-1抗体（克隆MEC13.3）</td><td>BD 生物科学</td><td>551262</td><td></td></tr><tr><td>APC 大鼠 IgG2a &amp;kappa; 同型对照（克隆&amp;nbsp; R35-95</td><td>BD 生物科学</td><td>553932</td><td></td></tr><tr><td>Axiovert 25 倒置相差组织培养显微镜</td><td>ZEISS</td><td></td><td></td></tr><tr><td>碱性成纤维细胞生长因子-2（bFGF）</td><td>Peprotech</td><td>450-33</td><td></td></tr><tr><td>台式离心机，Allegra X-15R</td><td>贝克曼库尔特</td><td>392932</td><td></td></tr><tr><td>生物安全柜 BioVanguard（Green Line）</td><td>Telstar</td><td>133H401001</td><td></td></tr><tr><td>牛血清白蛋白（BSA）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9418</td><td></td></tr><tr><td>细胞计数板，Buerker 型，0.100 mm</td><td>Marienfeld</td><td>640211</td><td></td></tr><tr><td>细胞培养皿 60 x 15 mm</td><td>康宁</td><td>353802</td><td></td></tr><tr><td>细胞培养皿，35 × 10 毫米</td><td>康宁</td><td>353801</td><td></td></tr><tr><td>12孔细胞培养板</td><td>康宁</td><td>3512</td><td></td></tr><tr><td>CFX96 Touch 实时荧光定量 PCR 检测系统</td><td>伯乐（Bio-Rad）</td><td>1855196</td><td></td></tr><tr><td>鸡血清</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C5405</td><td></td></tr><tr><td>CHIR-99021（CT99021）HCl</td><td>Selleckchem</td><td>S2924</td><td></td></tr><tr><td>I型胶原蛋白，高浓度，大鼠尾部来源，100mg</td><td>康宁</td><td>354249</td><td></td></tr><tr><td>胶原酶A</td><td>罗氏</td><td>10103586001</td><td></td></tr><tr><td>共聚焦激光扫描显微镜，TCS SP5</td><td>徕卡</td><td></td><td></td></tr><tr><td>盖玻片，24 &amp;times; 50 mm</td><td>Vwr</td><td>631-0146</td><td></td></tr><tr><td>DAPT &amp;gamma;?分泌酶抑制剂</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D5942</td><td></td></tr><tr><td>DC101 抗小鼠 VEGFR-2 克隆</td><td>BioXcell</td><td>BP0060</td><td></td></tr><tr><td>DC101 同型对照 大鼠 IgG1</td><td>BioXcell</td><td>BP0290</td><td></td></tr><tr><td>二甲基亚砜（DMSO）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D2438-5X</td><td>生物危害：处理时应采取适当的安全防护措施</td></tr><tr><td>DPBS（10倍浓度），无钙，无镁</td><td>Gibco，赛默飞世尔科技</td><td>14200067</td><td></td></tr><tr><td>EDTA 40 mM</td><td>Gibco，赛默飞世尔科技</td><td>15575-038</td><td></td></tr><tr><td>胚胎干细胞 胎牛血清</td><td>Gibco，赛默飞世尔科技</td><td>16141-079</td><td>应进行批次测试，以确保胚胎干细胞的最大存活率和生长状态。在60℃下加热灭活&amp;deg;C 并在 &amp;minus;20 &amp;deg;C，最长可保存1年</td></tr><tr><td>Eppendorf 微型离心机 5415R</td><td>Eppendorf AG</td><td>&amp;nbsp;Z605212</td><td></td></tr><tr><td>促红细胞生成素，人源（hEPO），250 U（2.5 &amp;micro;g)（1 mL）</td><td>罗氏</td><td>11120166001</td><td></td></tr><tr><td>ESGRO 重组小鼠 LIF 蛋白（10? 单位）&amp;nbsp;&amp;nbsp;1 mL</td><td>密理博，默克</td><td>ESG1107</td><td></td></tr><tr><td>15 mL Falcon管</td><td>Greiner Bio-One</td><td>188271</td><td></td></tr><tr><td>50 mL Falcon管</td><td>Greiner Bio-One</td><td>227270</td><td></td></tr><tr><td>滤芯吸头，透明，无菌，F. Gilson，P-200</td><td>Greiner Bio-One</td><td>739288</td><td></td></tr><tr><td>滤芯吸头，透明，无菌，F. Gilson，P10</td><td>Greiner Bio-One</td><td>771288</td><td></td></tr><tr><td>滤芯吸头，透明，无菌，F. Gilson，P1000</td><td>Greiner Bio-One</td><td>740288</td><td></td></tr><tr><td>FITC 标记的抗-&amp;alpha; 平滑肌肌动蛋白（SMA）（克隆 1A4）</td><td>Sigma Aldrich</td><td>F3777</td><td></td></tr><tr><td>FITC 标记的大鼠抗小鼠 CD45 抗体（克隆号 30-F11）</td><td>Biolegend</td><td>103107</td><td></td></tr><tr><td>FITC 大鼠 IgG2b， &amp;kappa; 同型对照抗体（克隆号 RTK4530）</td><td>Biolegend</td><td>400605</td><td></td></tr><tr><td>荧光封片剂</td><td>DAKO</td><td>S3023</td><td></td></tr><tr><td>气体压缩</td><td>Cutisoft</td><td>45846</td><td></td></tr><tr><td>纱布 Cutisoft 10 x 10 cm</td><td>Bsn Medical</td><td>45844_00</td><td></td></tr><tr><td>凝胶印迹纸，型号 GB003</td><td>Whatman</td><td>WHA10547922</td><td></td></tr><tr><td>明胶溶液，B型</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G1393-100 ml</td><td></td></tr><tr><td>格拉斯哥改良型最低基本培养基（GMEM）</td><td>Gibco，赛默飞世尔科技</td><td>21710082</td><td></td></tr><tr><td>IHC 锌固定液</td><td>BD Pharmigen</td><td>550523</td><td></td></tr><tr><td>IncuSafe CO2 培养箱</td><td>PHCBi</td><td>MCO-170AICUV-PE</td><td></td></tr><tr><td>白细胞介素-6，人（hIL-6）</td><td>罗氏</td><td>11138600001</td><td></td></tr><tr><td>L-谷氨酰胺 200 mM</td><td>Gibco，赛默飞世尔科技</td><td>25030-024</td><td></td></tr><tr><td>MEM非必需氨基酸溶液（100倍浓缩）</td><td>Gibco，赛默飞世尔科技</td><td>11140035</td><td></td></tr><tr><td>显微镜载玻片盒</td><td>Kartell Labware</td><td>278</td><td></td></tr><tr><td>显微镜载玻片，Starfrost</td><td>克尼特尔玻璃</td><td>VS113711FKB.0</td><td></td></tr><tr><td>Mm_Cdh5_1_SG QuantiTect 引物检测</td><td>Qiagen</td><td>QT00110467</td><td></td></tr><tr><td>Mm_Eng_1_SG QuantiTect 引物检测试剂盒</td><td>Qiagen</td><td>QT00148981</td><td></td></tr><tr><td>Mm_Epha4_1_SG QuantiTect 引物检测试剂盒</td><td>Qiagen</td><td>QT00093576</td><td></td></tr><tr><td>Mm_Ephb2_1_SG QuantiTect 引物检测</td><td>Qiagen</td><td>QT00154014</td><td></td></tr><tr><td>Mm_Flt1_1_SG QuantiTect 引物检测</td><td>Qiagen</td><td>QT00096292</td><td></td></tr><tr><td>Mm_Flt4_1_SG QuantiTect 引物检测</td><td>Qiagen</td><td>QT00099064</td><td></td></tr><tr><td>Mm_Gapdh_3_SG QuantiTect 引物检测试剂盒</td><td>Qiagen</td><td>QT01658692</td><td></td></tr><tr><td>Mm_Kdr_1_SG QuantiTect 引物检测试剂盒</td><td>Qiagen</td><td>QT00097020</td><td></td></tr><tr><td>Mm_Notch1_1_SG QuantiTect 引物</td><td>Qiagen</td><td>QT00156982</td><td></td></tr><tr><td>Mm_Nr2f2_1_SG QuantiTect 引物检测试剂盒</td><td>Qiagen</td><td>QT00153104</td><td></td></tr><tr><td>Mm_Pecam1_1_SG QuantiTect 引物</td><td>Qiagen</td><td>QT01052044</td><td></td></tr><tr><td>Mm_Tek_1_SG QuantiTect 引物试剂盒</td><td>Qiagen</td><td>QT00114576</td><td></td></tr><tr><td>小鼠（ICR）失活胚胎成纤维细胞&amp;nbsp; (2 M)</td><td>Gibco，赛默飞世尔科技</td><td>A24903</td><td>将小瓶存放在液氮中（195.79 &amp;deg;C）无限期</td></tr><tr><td>小鼠胚胎干细胞系 7AC5/EYFP (ATCC SCRC-1033)</td><td>ATCC</td><td>SCRC-1033</td><td>由加拿大安大略省多伦多市大学大道600号，西奈山医院，山姆·卢嫩菲尔德研究所，A. Nagy博士生成。[Hadjantonakis, A. K., 等，发育机制。76 (1&amp;ndash;2), 79&amp;ndash;90 (1998)].</td></tr><tr><td>小鼠胚胎干细胞系 Acvrl1 +/- 和 Acvrl1 +/+</td><td></td><td></td><td>在莱顿大学医学中心生成 [Thalgott, J.H. 等. Circulation. 138 (23), 2698&amp;ndash;2712 (2018)].</td></tr><tr><td>小鼠胚胎干细胞系 E14</td><td></td><td></td><td>由 M Letarte 实验室提供，根据 Cho S. K. 等人发表于《血液》98 卷 13 期 3635 页的方法制备&amp;ndash;3642 (2001).</td></tr><tr><td>小鼠胚胎干细胞系 R1 (ATCC SCRC-1011)</td><td>ATCC</td><td>SCRC-1011</td><td>由加拿大安大略省多伦多市大学大道600号西奈山医院山姆·卢嫩菲尔德研究所A·纳吉博士（Dr A Nagy）制备。[Nagy, A., 等. 美国国家科学院院刊. 90 (18), 8424]&amp;ndash;8428 (1993)].</td></tr><tr><td>小鼠胚胎干细胞系 Z/Red（品系 129/Ola）</td><td></td><td></td><td>由加拿大安大略省多伦多市大学大道600号西奈山医院山姆·卢嫩菲尔德研究所A. Nagy博士团队构建 [Vintersten, K., 等. Genesis. 40 (4), 241&amp;ndash;246 (2004)].</td></tr><tr><td>NanoDrop 1000 UV/VIS 分光光度计</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>ND-1000</td><td></td></tr><tr><td>PD0325901</td><td>Selleckchem</td><td>S1036</td><td></td></tr><tr><td>PDGF-BB，重组人源</td><td>Peprotech</td><td>100-14B</td><td></td></tr><tr><td>Pecam-1 抗体，大鼠抗小鼠</td><td>BD 生物科学</td><td>550274</td><td></td></tr><tr><td>青霉素-链霉素（10,000 U/mL）</td><td>Gibco，赛默飞世尔科技</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>培养皿，聚苯乙烯材质，94/16 毫米，标准型，带通气孔，无菌</td><td>Greiner Bio-One</td><td>633181</td><td></td></tr><tr><td>Pipetboy acu 2</td><td>Integra-Biosciences</td><td>155 019</td><td></td></tr><tr><td>Pipetman G 多通道移液器 P8 x 200G</td><td>Gilson</td><td>F144072</td><td></td></tr><tr><td>Pipetman G 初学者套装，4 支移液器套装，P2G，P20G，P200G，P1000G</td><td>Gilson</td><td>F167360</td><td></td></tr><tr><td>重组人BMP-4蛋白</td><td>R&amp;amp;D Systems</td><td>314-BP</td><td></td></tr><tr><td>RNeasy Plus mini试剂盒</td><td>QIAGEN</td><td>74134</td><td></td></tr><tr><td>10 mL 血清移液管</td><td>Greiner Bio-One</td><td>607 180</td><td></td></tr><tr><td>25 mL 血清移液管</td><td>Greiner Bio-One</td><td>760 180</td><td></td></tr><tr><td>5 mL 血清移液管</td><td>Greiner Bio-One</td><td>606 180</td><td></td></tr><tr><td>氢氧化钠（NaOH）</td><td>默克</td><td>106498</td><td></td></tr><tr><td>100 mM 丙酮酸钠</td><td>Gibco，赛默飞世尔科技</td><td>11360039</td><td></td></tr><tr><td>5 ml 圆底试管，带细胞滤网盖</td><td>康宁</td><td>352235</td><td></td></tr><tr><td>热循环仪，T100</td><td>伯乐（Bio-Rad）</td><td>1861096</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100（BioXtra）</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T9284</td><td></td></tr><tr><td>0.4% 台盼蓝溶液</td><td>Gibco，赛默飞世尔科技</td><td>15250061</td><td></td></tr><tr><td>胰蛋白酶（2.5%）</td><td>Gibco，赛默飞世尔科技</td><td>15090046</td><td></td></tr><tr><td>真空过滤/储存瓶系统，500 mL</td><td>康宁</td><td>430758</td><td></td></tr><tr><td>VEGFA&lt;sup&gt;165&lt;/sup&gt; ，重组小鼠</td><td>Peprotech</td><td>450-32</td><td></td></tr><tr><td>无菌水</td><td>Fresenius-Kabi</td><td>B230531</td><td></td></tr><tr><td>水浴锅，Lab-Line 数字式</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>18052A</td><td></td></tr></tbody></table>

体外 利用小鼠胚胎干细胞进行血管生成的三维出芽实验，用于血管疾病建模与药物筛选

In Vitro Three-Dimensional Sprouting Assay of Angiogenesis Using Mouse Embryonic Stem Cells for Vascular Disease Modeling and Drug Testing

诱导多能干细胞（iPSC）和基因编辑技术的最新进展推动了基于人类细胞的新型疾病模型的发展，为表型药物发现（PDD）项目提供了有力支持。尽管这些新型模型能够更准确地预测研究性药物在人体中的安全性和有效性，但其向临床转化仍高度依赖哺乳动物数据，尤其是小鼠疾病模型的应用。与此同时，除人类类器官或器官芯片疾病模型外，相关模型的开发也正在推进 体外 因此，小鼠模型在评估跨物种间药物直接疗效和安全性比较方面仍存在未满足的需求 体内 和 体外 条件。本文描述了一种利用小鼠胚胎干细胞分化为类胚体（EBs）的血管出芽检测方法。将具有血管化的EBs培养于三维胶原凝胶中，可形成延伸扩展的新血管，该过程称为出芽性血管生成。该模型重现了 体内 出芽性血管生成——即从已存在的血管网络形成新血管的过程，包括内皮尖端细胞的选择、内皮细胞的迁移与增殖、细胞导向、管状结构形成以及壁细胞的招募。该模型适用于筛选调控血管生成的药物和基因，且与近期报道的基于人诱导多能干细胞（iPSC）技术的三维（3D）血管检测方法具有相似性。

血管出芽实验的操作流程概述见图1。将来自三个独立的129/Ola小鼠胚胎干细胞系（Z/Red、R1和E14）的9日龄胚胎小体（EBs）用胶原酶A消化为单细胞。细胞经PECAM-1染色后，按所述方法进行荧光激活细胞分选（FACS）分析。所有细胞系均表现出强烈的内皮细胞分化能力，且在向内皮细胞分化的能力方面未观察到差异。所有细胞系产生的内皮细胞比例约为10.5% ± 1.3%（图2A）。同时定量分析了PECAM-1（+）细胞群体中泛内皮细胞标志物的相对表达水平。在不同细胞系及实验之间，所检测的全部标志物（Flk1、Flt1、Flt4、Eng、Tie2 和 Cdh5）的mRNA表达水平均具有可比性，证实了该分化方案的稳定性（图2B）。PECAM-1（+）细胞群体中动脉标志物（Notch1 和 Efnb2）或静脉标志物（<em...

该实验利用小鼠胚胎干细胞分化形成的类胚体，将其培养在三维胶原凝胶中，以在体外分析调控出芽型血管生成的生物学过程。in vitro。该技术可用于药物测试、疾病建模，以及研究在胚胎致死性缺失背景下特定基因的功能。

诱导多能干细胞（iPSC）和基因编辑技术的最新进展使得开发基于人类细胞的新型疾病模型成为可能，用于……

本方案描述了一种体外出芽型血管生成检测方法，可模拟血管形成的多种特征，并可用于药物测试。该方法易于在实验室中实施，具有良好的稳健性和可扩展性。其与使用人内皮细胞和微球的检测方法具有诸多相似之处。该模型能够稳健地模拟表型，表现出内皮顶端细胞选择缺陷和定向内皮细胞迁移异常，从而导致病理性血管生成。本研究可为调控出芽式血管生成的机制、关键基因及信号通路提供见解，尤其是通过开展遗传筛选实现。主要挑战在于维持小鼠胚胎干细胞在培养过程中的质量或 pluripotency（多能性）。定期检测细胞系的多能性状态及其形态学特征至关重要。对细胞系进行核型分析也非常重要，因为它们在培养过程中容易丢失或获得染色体。首先，向六孔细胞培养板中的一个孔加入500微升0.1%明胶溶液，进行包被，并将其置于二氧化碳培养箱中孵育30分钟。随后用PBS洗涤明胶包被的培养板，并加入500微升新配制的CM±培养基。为了获得纯的小鼠胚胎干细胞（mESCs）群体，使用10倍体积的TVP缓冲液在室温下消化细胞培养板30秒。随后将细胞重悬于1毫升中胚层分化培养基中，然后转移至经明胶包被的6孔板中孵育30分钟，使小鼠胚胎成纤维细胞贴壁，而mESCs保持悬浮状态。将细胞悬液转移至15毫升离心管中，用台盼蓝染色后在Neubauer血细胞计数板上计数活细胞。然后在室温下以200 × g离心细胞5分钟。弃去上清液，并将细胞沉淀重悬于适量的中胚层分化培养基中。通过向底部加入15毫升无菌水，准备四个94毫米低吸附性聚苯乙烯培养皿。将细胞悬液转移至无菌塑料储液槽后，用多通道移液器的四个通道分别吸取22微升细胞悬液。将94毫米培养皿的倒置皿盖内面朝上放置于超净台的洁净表面上。将细胞悬液在每个皿盖内表面滴加40滴，然后小心地将皿盖翻转，避免扰动，重新放回培养皿上，使液滴朝向水面。将培养皿置于二氧化碳培养箱中孵育四天，以此作为分化第零天。孵育四天后，使用P1000移液器将悬滴收集至15毫升锥形管中。让EB在管中沉降，然后移除上清液。将EBs重悬于3毫升2倍血管分化培养基中，然后转移至60毫米琼脂包被的培养皿中，并均匀分布EB悬液。将培养皿置于二氧化碳培养箱中培养至第9天，每两天更换一次培养基。通过在35毫米培养皿底部加入1毫升出芽培养基，制备培养皿。为诱导凝胶化，将培养皿在37摄氏度下孵育5分钟。从一个琼脂培养皿中收集9天龄的拟胚体至15毫升锥形管中，并移除上清液。用2毫升冷的出芽培养基重悬拟胚体，转移至已包被第一层出芽培养基的培养皿中。将拟胚体均匀分布在培养板上，确保彼此间距相等。在培养约24至48小时后，应可见首个芽状结构形成。在第12天，使用刮铲小心地将含有拟胚体的胶原凝胶转移至载玻片上。用移液器吸除多余液体，并在凝胶上方放置尼龙纱布和吸水滤纸以脱水。用250克重物加压两分钟。然后移除尼龙纸，使载玻片在室温下晾干30分钟。干燥后，于4°C条件下用锌溶液固定EBs过夜。次日，在用PBS洗涤载玻片五次之前，先去除固定液。使用含0.1% Triton X-100的PBS对EBs进行透化处理。孵育15分钟后，除去透化溶液，用PBS洗涤载玻片，每次5分钟，共洗涤5次。将拟胚体在封闭缓冲液中室温孵育1小时，随后用PBS洗涤5分钟。然后加入用封闭缓冲液稀释的一抗，于4摄氏度孵育过夜。然后将切片置于封闭缓冲液中，与山羊抗大鼠Alexa 555二抗在室温下孵育两小时。孵育结束后，用PBS洗涤切片三次，每次五分钟，再用水洗涤一次，随后封片进行显微镜观察。三维出芽型血管生成实验在三个胚胎体（EBs）上进行，使用了两种药物DC101和DAPT。随着浓度增加，这两种化合物在EB模型中逐渐抑制了血管生成。EB中不同浓度的药物显示，高剂量的DC101会抑制血管芽的数量和长度。而DAPT在1 µmol/L剂量下则表现出相反的作用。DAPT 在低剂量下即可显著增加每条血管出芽中具有导向缺陷表型的内皮顶端细胞数量，而 DC101 无此效应。在来源于 ACVRL1 野生型和 ACVRL1 杂合基因型的遗传性出血性毛细血管扩张症类胚体中，观察到血管出芽异常，大量出芽以相对于母体血管的随机角度出现导向缺陷表型。将一种野生型小鼠胚胎干细胞系与另一种未标记的野生型小鼠胚胎干细胞系以 1:1 比例混合，结果两者对前端内皮顶端细胞的贡献均等。对该代表性嵌合体EB进行显微分析，以确定前沿内皮尖端细胞的基因型来源。为了定量分析血管芽的壁细胞覆盖情况，将EB固定并用内皮细胞标志物PECAM和壁细胞标志物α平滑肌肌动蛋白进行染色。高倍镜图像显示，单个血管芽被壁细胞所包围。在进行颜色通道分离后执行二值化转换，并对由α-SMA阳性壁细胞包覆的PECAM阳性血管所占比例进行定量分析。胚胎干细胞系的遗传背景也是研究人员必须考虑的关键因素，因为不同细胞系的出芽能力存在差异。该方法可用于利用RNA干扰技术或携带基因突变的小鼠胚胎干细胞库进行遗传筛选。

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体外 使用小鼠胚胎干细胞进行血管疾病建模和药物测试的血管生成的三维发芽测定

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了解利用小鼠胚胎干细胞进行三维血管生成发芽测定的实验方法，该模型可在体外模拟血管疾病并进行药物筛选。此技术为研究血管发育机制及高通量筛选提供了可靠平台。

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