利用 体内 出生后电穿孔法研究小脑颗粒神经元形态及突触发育
2021年6月9日
本文描述了一种方法，用于在小鼠出生后脑发育过程中可视化颗粒神经元的突触发生，该时期这些细胞会精细调节其突触结构，并形成突触以整合到整个脑神经回路中。
本方案旨在研究不同发育阶段的小脑颗粒神经元，以观察其关键的形态学生长过程。该技术的优势包括细胞特异性靶向、转染载体的快速表达以及细胞的稀疏标记，从而便于研究细胞自主性效应。首先，从加样移液器吸头处截取一段11.2毫米的片段，并将该片段套在Hamilton注射器的尖端作为限位垫片，以将注射深度限制在1.5毫米。
用胶水或封口膜将间隔物固定在注射器尖端。为研究实验幼鼠小脑矢状脑切片中单个电穿孔颗粒神经元的形态，使用共聚焦显微镜以每层0.5微米的步长采集Z轴层扫图像。每个图像窗口内只拍摄一个细胞，以便于图像分析和三维重建。
使用简单神经突追踪器以盲法分析神经突长度和树突爪的形成。将电转染的小脑颗粒神经元（CGNs）单通道Z轴层扫图像上传至Fiji，点击插件“Segmentation”和“Simple Neurite Tracer”，从下拉菜单中选择“Create New 3D Viewer”。滚动至连接细胞胞体的树突基部，在连接处单击以开始创建路径。
通过点击细胞填充信号最亮的区域并按 Y 键保留轨迹，手动追踪路径。持续追踪至树突末端，并按 F 键确认路径。或者，追踪至爪状结构的基部。接下来，从该结构的基部开始，追踪最长的神经突直至末端。
按住 Windows 系统中的 Control 键或 macOS 中的 ALT 键，点击路径以追踪次级和三级分支。按下 F 键确认路径。观察到追踪测量结果将在单独窗口中显示。将所有爪状分支的尺寸相加，得到每个爪的总长度。
在代表性分析中，转染后3至14天的小脑颗粒神经元（CGNs）投射图像显示树突数量呈进行性减少。CGNs经历了一个从3天到7天的树突发育阶段，随后进入精细化过程，导致超过50%的多余树突被修剪。这一事件与剩余树突逐渐延长并形成 claw-like 结构的发育过程同步发生，表明这些发育过程是同时进行的。
到第7天时，约75%的树突上出现了爪状突起。每个标记的颗粒神经元（CGN）均在NMRS中进行重建，以量化其全胞体-树突表面积和体积。在发育过程中，CGN的大小未观察到显著差异。
尽管在7天时，颗粒神经元的体积相较于3天、5天和10天时显著减少了20%。操作过程中最重要的是在注射前准确定位小脑。该方法可通过转染shRNA、siRNA或Cre重组酶，在体内对基因进行遗传学操控，以研究这些基因在颗粒神经元发育中的作用。
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概述
本文介绍了一种利用体内电穿孔技术研究小鼠发育中小脑颗粒神经元（CGNs）形态发育的实验方案。该技术可实现对CGNs的稀疏标记和遗传学操作，从而能够在关键发育阶段对树突生长、爪状突起形成及突触发生进行详细分析。该方法结合了精确注射、共聚焦成像和定量形态测量分析，以实现对CGN成熟过程的长期追踪。
关键研究组成部分
科学领域
- 神经科学
- 发育生物学
- 细胞生物学
背景
- 神经元在大脑发育过程中会经历显著的结构和功能变化。
- 啮齿类动物的小脑是研究单细胞形态发生的模型系统，尤其是颗粒神经元（CGNs）。
- CGNs 形成特化的树突爪结构，对突触输入至关重要。
- 传统的标记方法通常缺乏细胞特异性或时间分辨率。
研究目的
- 在体内可视化并量化单个颗粒神经元（CGNs）的形态发育过程。
- 追踪发育过程中树突的生长、修剪及爪状突起的形成。
- 提供一个用于对颗粒神经元（CGNs）进行细胞自主性遗传操作的平台。
使用方法
- 在发育中的小鼠小脑内对颗粒神经元前体细胞进行体内电穿孔。
- 对颗粒神经元进行稀疏标记，以实现清晰的形态学分析。
- 采用共聚焦显微镜结合Z轴层扫成像进行三维重建。
- 使用Fiji和Simple Neurite Tracer插件手动追踪并量化神经突长度及树突爪状结构。
主要结果
- 注射后第3至14天（DPI）的投射图像显示，每颗颗粒神经元（CGN）的树突数量呈进行性减少。
- 在注射后第3至7天（DPI）期间，颗粒神经元经历树突修剪过程，清除了超过50%的多余树突。
- 残留树突末端形成爪状结构，至第7天时约75%的树突具有爪状结构。
- 颗粒神经元的体积总体保持稳定，但在第7天时与其它时间点相比，体积显著减少了20%。
结论
- 该方案可实现对体内颗粒细胞神经元（CGN）形态发育的详细且特异于细胞的分析。
- 树突修剪与爪状突起形成是CGN成熟过程中的同步事件。
- 该方法可适用于基因操作，用于研究基因在CGN发育中的功能。
常见问题
行业重要性概述
对小脑颗粒神经元（CGN）形态及突触发育进行定量的活体分析，可满足神经发育靶点验证中对预测可信度的关键需求。稀疏标记与基因操作能力可在中枢神经系统（CNS）发现的最早阶段实现机制层面的风险评估。该方法通过将细胞形态发生与突触整合相联系，支持转化研究的连续性，为专注于神经生物学的研发项目组合决策提供依据。
生物制药研发中的战略应用
早期发现与靶点验证
- 可直接探究基因功能在CGN形态发生和突触形成中的作用。
- 通过在体内分离细胞自主性效应，支持机制性风险降低。
- 提供基于假设驱动的靶点验证的定量读出结果。
- 基于形态学和突触表型，促进神经发育靶点的分类筛选。
筛选与检测方法开发
- 建立经过验证且可重复的神经元形态成像与分析工作流程。
- 提供用于下游筛选的定量指标，如树突数量、爪状突起形成及神经突长度。
- 通过盲法、软件辅助的形态测量分析实现检测方法的标准化。
- 为中枢神经系统研究流程中的化合物或遗传筛选准备稳健的生物系统。
转化与临床前研究
- 将形态学表型与啮齿类动物模型中与疾病相关的突触发育相匹配。
- 支持从早期发现到神经发育干预的临床前验证的连续性研究。
- 为评估突触成熟过程中的转化生物标志物提供平台。
- 通过将细胞变化与功能性突触结果相关联，降低研发风险。
流程与工作流整合
该方法整合了从早期发现到中枢神经系统研究中先导化合物鉴定的全过程，能够对基因或药物干预进行迭代式假设检验和定量表型分析。
- Discovery Biology：支持在神经元形态发生和突触形成中进行基因功能的零假设检验。
- Screening：提供可重复的、定量的输出结果，用于树突和突触结构分析。
- Analytics：提供盲法、软件辅助的神经突长度、树突爪结构和细胞体积测量。
- Translational Research：将细胞表型与体内疾病相关的突触发育相联系。
- Enterprise Reuse：适用于多种遗传操作和中枢神经系统模型系统，在不同发现项目中可重复使用。
运营与企业影响
- 科学价值：提高神经发育靶点验证和机制去风险的预测可信度。
- 操作价值：标准化体内成像和形态计量分析，以实现可重复性和可扩展性。
- 战略价值：通过将基因扰动与可量化的神经元表型关联，为决策提供依据。
- 项目组合影响：基于可靠的体内数据，实现对中枢神经系统靶点的风险调整优先排序。
实施注意事项
- 需要具备啮齿类动物神经解剖学的专业知识以及精确的立体定位注射技术。
- 需要具备共聚焦显微镜及高级图像分析软件（例如 Fiji、Simple Neurite Tracer）的使用条件。
- 需要跨团队协作以实现盲法分析和数据解读的标准化。
- 可适用于多种遗传载体（shRNA、siRNA、Cre 重组酶），用于细胞自主性研究。
- 注射准确性与细胞标记效率对于获得可重复的结果至关重要。
