使用荧光相关光谱检测蛋白质聚合
2021年4月25日
我们在这里介绍了一个程序，以测量蛋白质寡聚物和聚合在细胞溶解和活细胞使用荧光相关性光谱。
荧光相关光谱的最佳原理FCS最初是在20世纪70年代发明的。在20世纪90年代，通过与共焦仪器显微镜相结合，对FCS建立了重要和许多改进。自那时以来，FCS 已用于许多化学和病毒治疗应用，如分子相互作用和蛋白质聚合分析。
蛋白质聚集是神经退行性疾病的标志。荧光亮度是分子大小的单粒子，由扩散特性解释。它对于测量蛋白质聚合非常重要，因为它可以确定分子的预计生命周期，还可以区分同质化或异质聚合。
在这里，我们介绍了一个程序，以测量与聚合形式蛋白相关的肌萎缩性侧索硬化症的扩散，使用FCS在细胞裂解剂和活细胞。准备100毫米塑料盘生长神经2a细胞舒适地坐在正常的生长介质。确认细胞的汇流。
删除介质。将 3.5 毫升的 Trypsin-EDTA 溶液添加到第三个墨盒盘中，并在 37 摄氏度下孵育一分钟。将 9.5 毫升的正常生长介质加入菜中并暂停。
细胞悬架与尝试盘蓝色混合，以染色死细胞。将悬架添加到单元计数幻灯片中。使用细胞计数器或手动计算细胞数量。
检查活细胞编号及其生存能力。将计数介质中的细胞稀释为 1.0 倍 10 到每毫升 5 的功率。在 35 毫米塑料盘中加入两毫升细胞悬浮，用于细胞裂解或生长空间盘，用于活细胞测量。
在37摄氏度下孵化这道菜一天。第二天，准备质粒DNA和转染试剂的混合物。将转染混合物添加到细胞计数介质中，并孵育细胞 24 小时。
一天后使用常规显微镜检查 GFP 表达式。你可以看到细胞中非常明亮的TDP25成分体。
细胞裂解应在生化台进行。取出盘中的介质。在 25 摄氏度下加入两毫升 PBS，作为介质清洗。
删除 PBS。将盘子放在碎冰顶部的铝板上。立即将 200 微滑解缓冲器添加到菜中。
用细胞刮刀刮盘子。在新的1.5毫米管中用未溶解的细胞碎片回收溶解物。在摄氏四度的离心解体。
对于活细胞测量，在测量前用新的介质替换介质。使用相位对比显微镜检查细胞附件。此外，使用荧光显微镜检查 GFP 表达式。
使用共焦显微镜组合FCS系统。打开488纳米激光。稳定系统至少30分钟。
设置光学路径。使用 488 纳米激光进行即时照明。使用适当的光束分路器和分光计。
还有荧光保险丝通常，我们将使用盖玻璃室进行校准和溶液测量。小心，拿盖玻璃室。
将玻璃表面放在透镜筛选纸上。倒入FCS校准。在中加入罗达明 6G 解决方案。
在目标上加入超纯水。不要使用油。将腔室设置在显微镜舞台上。
将舞台移动到适当的位置。创建针孔调整并打开针孔调整向导。监控光子计数速率，作为 x 方向针孔的粗移动。
最亮的位置是正确确定的。接下来，将光人计数率监控为精细运动。最亮的位置被成功确定这是 x 方向的针孔位置。
同样，搜索针孔最亮的位置以查找 y 方向。y 方向最亮的位置也成功确定。复合针孔的 x 和 y 位置。
最好在每天测量前调整针孔位置。更改实时路径时，必须再次调整针孔位置。创建计数速率并监控电话计数速率。
更改为 CPM 监控模式。计算您运行的对象的校正环，以便 CPM 值最高。关闭计数速率窗口。
从罗达明 6G 解决方案测量开始。测量完成后，单击适合执行曲线拟合分析。选择一个模型来安装旧的相关函数。
对于罗达明 6G，选择具有三胞胎状态的 1 组件、3 维扩散模型。通过移动红线设置合适的启动时间。单击"适合所有人"，开始安装计算。
检查拟合偏差。确保双方被张贴和负，大约为零。检查合适的值。
确保扩散时间大致在 20-30 微秒之间。此外，结构参数为 4 到 8。打开拟合面板，并选择测量模型。
在拟合面板中输入模型中样本的相同结构参数值。确保类型应设置为固定。GFP-TDP25在细胞测得。
将利萨特放在盖玻璃室中。放置盖子以避免赖酸干涸。将舞台盖放在浅色阴影上。
在采集面板中，设置激光功率、测量时间及其重复性。开始收购。观察到一个尖峰。
再次观察到尖峰。尖峰表示通过检测体的明亮分子。尖峰表示可溶性寡头或聚合物。
创建适合执行曲线拟合分析。选择具有三元状态的 2 组件三维扩散模型。设置合适的开始时间。
单击"适合所有"。检查合适的值。SOD1-G85R 在活细胞中标有 GFP 测量标签。
与溶液测量不同，我建议使用热阶段孵化器。将细胞培养盘设置在显微镜舞台上。使用眼部确认焦点和位置。
选择测量单元。使用快速扫描模式放大和调整单元位置。使用慢速扫描速度模式获取单元格快照。
使用位置工具选择 FCS 测量位置。十字线表示测量位置。开始测量。
光子计数率记录的轻微下降表明GFP的光漂白。执行曲线拟合。显示了细胞糖酸盐中GFP-TDP25的代表性结果。
上图记录了光子计数速率。箭头的位置是尖峰，表示可溶性寡头和聚合物。中间图表示旧的相关函数。
灰色线显示低、旧相关函数。洋红色线显示安装的功能。虚线表示安装的开始和结束时间。
下表显示拟合值。接下来，在活细胞中显示 SOD1-G85R-GFP 的代表性结果。上图表示我们光子计数率的记录。
记录的光子计数率逐渐下降，表明不同测量的GFP增长的光漂白。这是因为活细胞的扩散速度很慢。中间图表示 SOD1 的旧相关函数。
灰色线显示低、旧相关函数。洋红色线显示安装的功能。虚线表示适合的开始和结束时间。
下表显示合适的值。在这里，我们向您展示此程序，以测量来自细胞裂解液中每个细胞相关 TDP-25 的扩散，以及使用 FCS 在活细胞中 SOD1 的一切突变。细胞裂解物中的可溶性寡聚物和聚合通常可观察到尖峰或爆裂。
另一方面，在活细胞中，除了可能明显的活体结构外，很少观察到这种尖峰。变异SAD1的缓慢扩散物种为我们内部的单个粒子（如SAD1均匀化）增加了均值亮度。此处显示的程序简单且值得。
FCS不含辐射，直接处于休眠状态。这只是你和我们的想象力的同理心。
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概述
本研究提出了一种利用荧光相关光谱 (FCS) 来测量细胞裂解物和活细胞中的蛋白质低聚体和聚集的程序。重点是分析与肌萎缩侧索硬化症相关的蛋白质聚集，强调了 FCS 在描述生物样品中分子相互作用方面的重要性。
关键研究组成部分
研究领域
- 蛋白质聚集分析
- 神经退行性疾病研究
- 分子相互作用
背景
- 荧光相关光谱 (FCS) 是一种在 1970 年代开发的敏感技术，在 1990 年代与共聚焦显微镜结合得到改进。
- FCS 对于理解分子大小和扩散性质至关重要。
- 蛋白质聚集对于研究神经退行性疾病至关重要。
使用的方法
- 荧光相关光谱
- Neuro2a 细胞的细胞裂解物
- 用于实时分析的共聚焦显微镜系统
主要结果
- 成功测量了活细胞中的蛋白质聚集。
- 扩散性质提供了分子相互作用的见解。
- FCS 数据中的峰值表明可溶性低聚体或聚集体。
结论
- 该方法有效地展示了活体系统中蛋白质聚集的动力学。
- 这项研究有助于从分子水平理解神经退行性疾病。
常见问题
Executive Industry Relevance
Fluorescence correlation spectroscopy (FCS) enables high-sensitivity detection of protein aggregation, a critical factor in neurodegenerative disease research and early drug discovery. Quantitative measurement of diffusion properties in cell lysates and live cells supports mechanistic de-risking and target validation for aggregation-prone proteins. Integrating FCS into discovery workflows enhances predictive confidence and informs portfolio triage decisions for neurodegeneration programs.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables direct interrogation of aggregation mechanisms in disease-relevant proteins.
- Supports functional target validation by distinguishing monomeric and aggregated species.
- Provides mechanistic de-risking through quantitative diffusion analysis.
- Facilitates predictive confidence in target selection for neurodegenerative indications.
Screening & Assay Development
- Prepares validated biological systems for downstream aggregation screening.
- Delivers quantitative, reproducible readouts of protein aggregation states.
- Enables assay standardization for compound evaluation targeting aggregation pathways.
- Supports scalability and platform reuse for multiple protein targets.
Translational & Preclinical Research
- Aligns aggregation measurements with disease-relevant cellular models.
- Ensures continuity from discovery through preclinical validation of aggregation-modulating agents.
- Provides risk-adjusted data for advancement decisions in neurodegeneration pipelines.
- Strengthens translational biomarker strategies by linking aggregation to functional outcomes.
Pipeline & Workflow Integration
FCS-based aggregation detection fits at the interface of early discovery and lead identification, providing actionable data for both target validation and assay development in neurodegeneration research.
- Discovery Biology: Quantifies aggregation dynamics to clarify disease mechanisms and de-risk targets.
- Screening: Supplies reproducible, quantitative aggregation metrics for compound triage.
- Analytics: Generates diffusion and brightness measurements to compare aggregation across conditions.
- Translational Research: Bridges in vitro and live cell aggregation data for preclinical continuity.
- Enterprise Reuse: Establishes a standardized, reusable platform for aggregation analysis across programs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in aggregation studies.
- Operational Value: Delivers standardized, reproducible, and scalable aggregation measurements.
- Strategic Value: Informs go/no-go decisions and enhances capital efficiency in neurodegeneration portfolios.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of aggregation-targeting assets.
Implementation Considerations
- Requires expertise in confocal microscopy and FCS data analysis.
- Needs access to calibrated FCS instrumentation and fluorescence labeling capabilities.
- Demands cross-team standardization for sample preparation and measurement protocols.
- Adaptable to various aggregation-prone proteins with appropriate fluorescent tags.
- Photobleaching and calibration must be carefully managed for reliable results.
