Name: 使用荧光相关光谱检测蛋白质聚合 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-04-25T15:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 4 s
Description: 学习使用荧光相关光谱技术检测蛋白质聚合的方法，该方法适用于细胞裂解液和活细胞中的ALS相关蛋白TDP25和突变SOD1。该技术可分析蛋白质扩散特性并区分单体与聚集体，为神经退行性疾病研究提供标准化方案。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

A.K. 获得日本学术振兴会（JSPS）科学研究费助成项目（C）（#18K06201）、中谷基金会针对新型冠状病毒感染对策的助成金、北海道大学未来研究领袖培养办公室（L-Station）的资助，以及好庵社基金会的助成金支持。M.K. 部分获得日本学术振兴会（JSPS）创新领域科学研究费助成项目的支持。 &#34;用于多分子拥挤生物系统的化学&#34; （#20H04686）以及日本学术振兴会（JSPS）创新领域科学研究费补助金 &#34;生命物质的信息物理学&#34; (#20H05522)

1. 材料与试剂
<ol>
	<li>使用无热原的溶液和培养基进行细胞培养（表1）。</li>
	<li>使用超纯水配制生化实验所需的溶液，并确保其无DNase/RNase。</li>
	<li>选择适合细胞培养的胎牛血清（FBS），并经过批次检测流程。由于所选FBS批次会定期更换，此处无法提供具体的目录号和批次编号。</li>
	<li>质粒DNA
	<ol>
		<li>准备用于表达eGFP单体的pmeGFP-N15；用于表达GFP-TDP25的pmeGFP-C1-TDP256；用于表达SOD1-G85R-GFP的pmeGFP-N1-SOD1-G85R7；以及用作载体的pCAGGS8。 
		注：meGFP是增强型绿色荧光蛋白（eGFP）的单体变体，携带A206K突变。TDP25是与肌萎缩侧索硬化症（ALS）相关的TDP-43蛋白C端片段。SOD1-G85R是与ALS相关的SOD1突变体。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>细胞株
	<ol>
		<li>使用小鼠神经母细胞瘤Neuro2a细胞。 
		&#8203;注：Neuro2a细胞具有较高的转染效率，并能高效表达外源蛋白。对于TDP25的表达，需要选用表达效率高的细胞株，如Neuro2a或HEK293细胞。在HeLa细胞中，TDP25无法有效表达。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 细胞培养与转染
<ol>
	<li>在100 mm塑料培养皿中，使用正常生长培养基培养处于半汇合状态的Neuro2a细胞。 
	注意：前次传代后需在37 °C孵育约48–72小时，直至达到半汇合状态。</li>
	<li>移除培养基。</li>
	<li>向细胞培养皿中加入0.5 mL胰蛋白酶-EDTA溶液，并在37 °C孵育1分钟。</li>
	<li>向培养皿中加入9.5 mL正常生长培养基，重悬脱落的细胞。</li>
	<li>使用台盼蓝染色死细胞，通过细胞计数仪或手动计数细胞数量，然后将细胞用培养基稀释至浓度为1.0 × 105/mL。</li>
	<li>将2 mL细胞悬液加入35 mm塑料培养皿（用于细胞裂解）或玻璃底培养皿（用于活细胞检测）中。</li>
	<li>将培养皿在37 °C孵育1天。</li>
	<li>在转染当天前15分钟开始进行以下准备工作。</li>
	<li>准备两个1.5 mL离心管，每管加入100 μL Opti-MEM I培养基。</li>
	<li>在第一管中加入1.0 μg质粒DNA（溶液A）；在第二管中加入2.5 μL Lipofectamine 2000（溶液B）。 
	注意：为保持转染效率，应维持总DNA量不变。若需降低活细胞FCS检测中的蛋白表达水平，应减少用于蛋白表达的质粒DNA比例（例如，pmeGFP-N1-SOD1-G85R为0.2 μg，pCAGGS混合物为0.8 μg）。此外，Lipofectamine 2000的体积与质粒DNA的量之间应保持相同比例。</li>
	<li>将溶液A与溶液B轻轻混合（将其中一种加入另一管中），室温孵育1分钟，得到溶液C。</li>
	<li>将溶液C加入培养基中，并在37 °C继续孵育细胞24小时。</li>
</ol>
3. 细胞裂解 &amp;#38; 培养基更换
<ol>
	<li>使用普通显微镜检测GFP表达情况。</li>
	<li>移除培养皿中的培养基。</li>
	<li>加入2 mL 25 °C的PBS洗涤培养基，随后移除PBS。</li>
	<li>将培养皿置于覆盖碎冰的铝板上。 
	注意：我们使用在周日工具店购买或市售的实验室用1 mm厚铝板。</li>
	<li>加入200 μL 4 °C的裂解缓冲液，轻轻摇动培养皿，使缓冲液均匀分布于皿底。</li>
	<li>用细胞刮刀刮取培养皿中的细胞，并将含有未溶解细胞碎片的裂解液转移至新的1.5 mL离心管中。</li>
	<li>在4 °C条件下，以20,400 x g离心5分钟。</li>
	<li>将上清液转移至新的1.5 mL离心管中，置于4 °C或冰上保存。 
	注意：切勿冷冻裂解液。</li>
	<li>进行活细胞检测时，应在检测前更换培养基。使用相差显微镜检查细胞贴壁情况，并通过荧光显微镜确认表达情况。</li>
</ol>
4. 荧光相关光谱（FCS）校准
<ol>
	<li>启动系统并运行操作软件。打开氩离子激光器（Argon+，458/477/488/514 nm）。系统至少稳定运行 30 分钟。</li>
	<li>设置光路：主分光镜：HFT488；二向色镜：NFT600；荧光截止滤光片：带通滤光片 505–540（BP505–540）；探测器：雪崩光电二极管（APD）。</li>
	<li>通过直接输入数值设置针孔大小（66 μm；1 个艾里单位）。</li>
	<li>将罗丹明 6G（Rh6G）溶液加入载玻片腔室的孔中，并将腔室置于显微镜载物台上。</li>
	<li>在物镜上添加浸没用超纯水。请勿使用浸油。</li>
	<li>将腔室放置在显微镜载物台上，并移动载物台至合适位置。</li>
	<li>通过检测玻璃表面散射光聚焦到上层玻璃表面。将物镜降至底部后，顺时针旋转调焦旋钮进行调节。 
	注意：请确认调焦旋钮的旋转方向，因为日本和德国制造的设备方向相反。</li>
	<li>将焦点向上提升 200 μm，以观察溶液内部。</li>
	<li>点击 计数率，监测光子计数率。</li>
	<li>逐步增加声光可调滤波器（AOTF）的数值（例如激发激光透射率），使计数率达到 10 kHz 以上。</li>
	<li>点击 针孔调节，打开针孔调节向导。在 x 轴和 y 轴方向上分别找到光子数最高（峰值）的针孔位置。</li>
	<li>调节物镜的校正环，使每分子计数（CPM）值达到最大。 
	注意：由于本实验所用腔室盖玻片厚度为 0.12–0.17 mm，校正环应位于其最小值附近或仅稍作几圈调节，此时 CPM 值最高。</li>
	<li>逐步降低 AOTF 数值，使 CPM 值降至 2–3 kHz。</li>
	<li>采集 Rh6G 的自相关函数（ACF）信号，持续 90 秒。</li>
	<li>测量完成后，点击 拟合 进行曲线拟合分析。</li>
	<li>选择包含三重态的单组分三维（3D）扩散模型。 
	注意：Rh6G 为单一分散体系，其扩散行为符合含三重态的单组分扩散模型。</li>
	<li>通过移动红线设置拟合起始时间。点击 全部拟合 并检查拟合偏差。完成曲线拟合后，确保扩散时间（DT）和结构参数（SP）分别大致处于 20–30 μs 和 4–8 的范围内。</li>
	<li>记录结构参数的数值。在同一天、相同光学条件下，使用相同类型的玻璃底培养皿或腔室化盖玻片进行所有 ACF 测量时，均应使用该 SP 值进行曲线拟合分析。</li>
</ol>
5. 细胞裂解液中的FCS测量
<ol>
	<li>制备细胞裂解液（见上文）。</li>
	<li>将裂解液置于盖玻片腔室中。加盖以防止干燥，并使用载物台盖板遮光。</li>
	<li>设置采集条件，包括激光功率、测量时间和重复次数。</li>
	<li>点击 计数率，调节激光的AOTF值，使CPM值超过1 kHz。</li>
	<li>进行1分钟的预实验测量。检查计算得到的ACF是否呈现正向振幅且衰减平滑。</li>
	<li>进行5分钟的正式测量。 
	注意：总测量时间应逐步增加，直至ACF曲线形状不再随测量时间延长而改变。</li>
	<li>点击“拟合”以执行曲线拟合分析。</li>
	<li>选择包含三重态的双组分三维扩散模型。在点击“全部拟合”之前，务必输入SP值，并将其设置由“自由”更改为&#34;固定&#34;，而非&#34;自由&#34;。</li>
	<li>将拟合结果表格导出为制表符分隔的文本文件。</li>
	<li>如有需要，将ACF和计数率记录导出为制表符分隔的文本文件。</li>
</ol>
6. 活细胞中FCS测量
<ol>
	<li>测量前更换为新鲜培养基。</li>
	<li>使用加热台孵育器。将细胞培养皿放置在显微镜载物台上。</li>
	<li>使用共聚焦显微镜确认焦平面和位置。选择待测细胞，放大并调整细胞位置。采用慢速扫描模式获取表达GFP的细胞的荧光图像。</li>
	<li>在&#34;FCS&#34;部分中，使用Position选择FCS测量位置。</li>
	<li>使用十字准线选择至少一个FCS测量点（图1）。</li>
	<li>测量ACF持续1分钟。 
	注意：由于荧光蛋白在活细胞中移动较慢，相较于溶液环境更容易发生光漂白，因此测量时间应尽可能短。通常难以像溶液测量那样获得平滑的细胞内ACF曲线，因为长时间测量会导致荧光蛋白的光漂白。</li>
	<li>点击Fit，使用包含三重态的双组分三维扩散模型进行曲线拟合分析。 
	注意：对于活细胞测量，使用包含三重态的双组分三维扩散模型更为合适，因为在活细胞中存在多种可移动组分，经验上很难通过单组分三维扩散模型将卡方值降至理想水平。但即使采用三组分三维扩散模型，其扩散组分的分离效果通常也不如双组分模型清晰。</li>
</ol>

<ol><li>Ross, C. A., Poirier, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+aggregation+and+neurodegenerative+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Protein aggregation and neurodegenerative disease.</a> Nature Medicine. 10, Suppl 10-17 (2004).</li>
<li>Hipp, M. S., Kasturi, P., Hartl, F. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+proteostasis+network+and+its+decline+in+ageing%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Review+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">The proteostasis network and its decline in ageing.</a> Nature Review Molecular Cell Biology. 20 (7), 421-435 (2019).</li>
<li>Kitamura, A., Nagata, K., Kinjo, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conformational+analysis+of+misfolded+protein+aggregation+by+FRET+and+live-cell+imaging+techniques%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Molecular+Science%22%5BJournal%5D)">Conformational analysis of misfolded protein aggregation by FRET and live-cell imaging techniques.</a> International Journal of Molecular Science. 16 (3), 6076-6092 (2015).</li>
<li>Rigler, R., Mets, U., Widengren, J., Kask, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescence+Correlation+Spectroscopy+with+High+Count+Rate+and+Low-Background+-+Analysis+of+Translational+Diffusion%5BTitle%5D)+AND+%22European+Biophysics+Journal+with+Biophysics+Letters%22%5BJournal%5D)">Fluorescence Correlation Spectroscopy with High Count Rate and Low-Background - Analysis of Translational Diffusion.</a> European Biophysics Journal with Biophysics Letters. 22 (3), 169-175 (1993).</li>
<li>Zacharias, D. A., Violin, J. D., Newton, A. C., Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Partitioning+of+lipid-modified+monomeric+GFPs+into+membrane+microdomains+of+live+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Partitioning of lipid-modified monomeric GFPs into membrane microdomains of live cells.</a> Science. 296 (5569), 913-916 (2002).</li>
<li>Kitamura, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interaction+of+RNA+with+a+C-terminal+fragment+of+the+amyotrophic+lateral+sclerosis-associated+TDP43+reduces+cytotoxicity%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Interaction of RNA with a C-terminal fragment of the amyotrophic lateral sclerosis-associated TDP43 reduces cytotoxicity.</a> Scientific Reports. 6, 19230(2016).</li>
<li>Kitamura, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dysregulation+of+the+proteasome+increases+the+toxicity+of+ALS-linked+mutant+SOD1%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+to+Cells%22%5BJournal%5D)">Dysregulation of the proteasome increases the toxicity of ALS-linked mutant SOD1.</a> Genes to Cells. 19 (3), 209-224 (2014).</li>
<li>Niwa, H., Yamamura, K., Miyazaki, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+selection+for+high-expression+transfectants+with+a+novel+eukaryotic+vector%5BTitle%5D)+AND+%22Gene%22%5BJournal%5D)">Efficient selection for high-expression transfectants with a novel eukaryotic vector.</a> Gene. 108 (2), 193-199 (1991).</li>
<li>Kitamura, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytosolic+chaperonin+prevents+polyglutamine+toxicity+with+altering+the+aggregation+state%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Cytosolic chaperonin prevents polyglutamine toxicity with altering the aggregation state.</a> Nature Cell Biology. 8 (10), 1163-1170 (2006).</li>
<li>Kitamura, A., Shibasaki, A., Takeda, K., Suno, R., Kinjo, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+the+substrate+recognition+state+of+TDP-43+to+single-stranded+DNA+using+fluorescence+correlation+spectroscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry+and+Biophysics+Reports%22%5BJournal%5D)">Analysis of the substrate recognition state of TDP-43 to single-stranded DNA using fluorescence correlation spectroscopy.</a> Biochemistry and Biophysics Reports. 14, 58-63 (2018).</li>
<li>Kinjo, M., Sakata, H., Mikuni, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((First+steps+for+fluorescence+correlation+spectroscopy+of+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Protocols%22%5BJournal%5D)">First steps for fluorescence correlation spectroscopy of living cells.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2011 (10), 1185-1189 (2011).</li>
<li>Kinjo, M., Sakata, H., Mikuni, S. Fluorescence correlation spectroscopy example: shift of autocorrelation curve. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aKinjo%2C+M+%22Cold+Spring+Harbor+Protocols%22">Cold Spring Harbor Protocols</a>. 2011 (10), 1267-1269 (2011).</li>
<li>Kinjo, M., Sakata, H., Mikuni, S. Basic fluorescence correlation spectroscopy setup and measurement. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aKinjo%2C+M+%22Cold+Spring+Harbor+Protocols%22">Cold Spring Harbor Protocols</a>. 2011 (10), 1262-1266 (2011).</li>
<li>Jazani, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+alternative+framework+for+fluorescence+correlation+spectroscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communication%22%5BJournal%5D)">An alternative framework for fluorescence correlation spectroscopy.</a> Nature Communication. 10 (1), 3662(2019).</li>
<li>Pack, C., Saito, K., Tamura, M., Kinjo, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microenvironment+and+effect+of+energy+depletion+in+the+nucleus+analyzed+by+mobility+of+multiple+oligomeric+EGFPs%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Microenvironment and effect of energy depletion in the nucleus analyzed by mobility of multiple oligomeric EGFPs.</a> Biophysical Journal. 91 (10), 3921-3936 (2006).</li>
<li>Ries, J., Chiantia, S., Schwille, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Accurate+determination+of+membrane+dynamics+with+line-scan+FCS%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Accurate determination of membrane dynamics with line-scan FCS.</a> Biophysical Journal. 96 (5), 1999-2008 (2009).</li>
<li>Fujioka, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phase+separation+organizes+the+site+of+autophagosome+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Phase separation organizes the site of autophagosome formation.</a> Nature. 578 (7794), 301-305 (2020).</li>
<li>Sadaie, W., Harada, Y., Matsuda, M., Aoki, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+in+vivo+fluorescence+cross-correlation+analyses+highlight+the+importance+of+competitive+effects+in+the+regulation+of+protein-protein+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Cellular+Biology%22%5BJournal%5D)">Quantitative in vivo fluorescence cross-correlation analyses highlight the importance of competitive effects in the regulation of protein-protein interactions.</a> Molecular and Cellular Biology. 34 (17), 3272-3290 (2014).</li>
<li>Cohen, L. D., Boulos, A., Ziv, N. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+non-fluorescent+HaloTag+blocker+for+improved+measurement+and+visualization+of+protein+synthesis+in+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22F1000Research%22%5BJournal%5D)">A non-fluorescent HaloTag blocker for improved measurement and visualization of protein synthesis in living cells.</a> F1000Research. 9, (2020).</li>
</ol>

这些作者没有利益冲突。

在测量前进行系统校准时，应使用与样品测量相同的玻璃器皿（例如，用于细胞裂解液的8孔盖玻片培养皿和用于活细胞的35 mm玻璃底培养皿）。由于罗丹明6G（Rh6G）会吸附在玻璃表面，其有效浓度有时会降低。若出现此情况，仅用于针孔调整时可使用较高浓度的Rh6G溶液（如1 μM）。必须避免过高的光子计数率，以保护探测器（例如，超过1000 kHz）。此外，高浓度溶液不适用于自相关函数的采集（应保持低于100 kHz）。针孔位置的校准至关重要。若光学系统使用频繁，针孔发生显著位移的情况较为罕见；因此，通常开始时使用&#34;Fine&#34;即可找到合适的位置。若使用&#34;Fine&#34;无法找到计数率的峰值位置，应先使用&#34;Coarse&#34;将针孔从运动范围的一端移动到另一端，再通过&#34;Fine&#34;进行定位。若自相关函数（ACF）的幅度呈平坦状，需检查焦点和位置是否合适。
在完成 Rh6G 测量及其拟合后，如果 DT 和/或 SP 超出指定范围，应重新调整针孔和校正环。若仍超出范围，建议联系设备制造商的技术支持，因为这可能是光学系统存在缺陷所致。利用测得的 DT...

涉及神经退行性疾病的蛋白质聚集，如肌萎缩侧索硬化症（ALS）、阿尔茨海默病、帕金森病、亨廷顿病等1 已知具有毒性，会扰乱细胞和器官中的蛋白质稳态（proteostasis），进而可能导致衰老2清除蛋白质聚集被视为一种潜在的治疗策略；然而，目前尚未建立能够有效抑制蛋白质聚集形成并降解已形成蛋白质聚集体的化合物（例如小分子或药物）。此外，蛋白质聚集产生毒性的具体机制仍不明确。因此，为了推动与蛋白质聚集相关的研究，建立可简便检测蛋白质聚集的高通量方法显得尤为重要。利用能够识别蛋白质聚集构象的抗体或聚集特异性荧光染料来检测蛋白质聚集的方法已被广泛使用。3然而，使用这些经典方法检测聚集现象尤其困难，特别是在活细胞中。 
荧光共振能量转移（FRET）是一种用于检测蛋白质聚集和结构变化的方法。然而，FRET 无法分析蛋白质的动力学过程（例如活细胞中蛋白质的扩散和寡聚化）3。因此，本文介绍一种简单的方法，利用荧光相关光谱（FCS）在溶液（例如细胞裂解液）和活细胞中检测蛋白质聚集。FCS 能够以单分子灵敏度测量荧光分子的扩散特性和亮度4。FCS 是一种基于激光扫描共聚焦显微镜（LSM）的光子计数方法。通过使用高灵敏度的光子探测器，并计算光子到达时间的自相关函数（ACF），可测量荧光分子在检测体积内通过的时间和亮度。分子量增加时，扩散速度减慢；因此，可利用 FCS 估算分子间的相互作用。更有力的是，荧光分子亮度的增加表明分子发生了同源寡聚化。因此，FCS 是检测此类蛋白质聚集的有力工具。

<table><tbody><tr><td>含酚红的 0.25% (w/v) 胰蛋白酶-1 mmol/L EDTA&amp;middot;4Na 溶液（胰蛋白酶-EDTA）</td><td>Fujifilm Wako Pure Chemical Corp.</td><td>201-16945</td><td></td></tr><tr><td>100 mm 塑料培养皿</td><td>CORNING</td><td>430167</td><td></td></tr><tr><td>35 mm 玻璃底培养皿</td><td>IWAKI</td><td>3910-035</td><td>用于活细胞检测</td></tr><tr><td>35 mm 塑料培养皿</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>150460</td><td></td></tr><tr><td>铝制板</td><td>Bio-Bik</td><td>AB-TC1</td><td></td></tr><tr><td>C-Apochromat 40x/1.2NA Korr. UV-VIS-IR M27</td><td>Carl Zeiss</td><td></td><td>物镜</td></tr><tr><td>细胞刮刀</td><td>Sumitomo Bakelite Co., Ltd.</td><td>MS-93100</td><td></td></tr><tr><td>醋酸纤维素滤膜（0.22 mm）</td><td>Advantech Toyo</td><td>25CS020AS</td><td></td></tr><tr><td>8 孔盖玻片培养板</td><td>IWAKI</td><td>5232-008</td><td>用于溶液检测</td></tr><tr><td>杜尔贝科改良伊格尔培养基（DMEM）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D5796</td><td>基础培养基</td></tr><tr><td>胎牛血清（FBS）</td><td>biosera</td><td></td><td>需进行批号检测</td></tr><tr><td>Lipofectamine 2000</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11668019</td><td></td></tr><tr><td>LSM510 META + ConfoCor3</td><td>Carl Zeiss</td><td></td><td>FCS 系统</td></tr><tr><td>小鼠神经母细胞瘤 Neuro2a 细胞</td><td>ATCC</td><td>CCL-131</td><td>细胞系</td></tr><tr><td>Opti-MEM I</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>31985070</td><td></td></tr><tr><td>pCAGGS</td><td>RIKEN</td><td>RDB08938</td><td>转染载体用质粒 DNA</td></tr><tr><td>青霉素-链霉素溶液（&amp;times;100）</td><td>Fujifilm Wako Pure Chemical Corp.</td><td>168-23191</td><td></td></tr><tr><td>pmeGFP-C1-TDP25</td><td></td><td></td><td>编码单体 eGFP 标记的 TDP25 的质粒 DNA</td></tr><tr><td>pmeGFP-N1</td><td></td><td></td><td>编码单体 eGFP 表达的质粒 DNA</td></tr><tr><td>pmeGFP-N1-SOD1-G85R</td><td></td><td></td><td>编码与单体 eGFP 融合的 ALS 相关 SOD1 G85R 突变体的质粒 DNA</td></tr><tr><td>蛋白酶抑制剂混合物</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P8304</td><td></td></tr></tbody></table>

使用荧光相关光谱法检测蛋白质聚集

Detection of Protein Aggregation using Fluorescence Correlation Spectroscopy

蛋白质聚集是神经退行性疾病的一个标志性特征，例如肌萎缩侧索硬化症（ALS）、阿尔茨海默病（AD）、帕金森病（PD）、亨廷顿病（HD）等。为了检测和分析可溶性或弥散状态的蛋白质寡聚体或聚集体，已采用荧光相关光谱技术（FCS），该技术具有单分子灵敏度，可检测单个粒子的扩散速度和亮度。然而，用于蛋白质聚集检测的标准化操作流程和关键技术细节尚未被广泛共享。本文展示了在细胞裂解液和活细胞中，利用FCS测量易聚集蛋白质扩散特性的标准操作流程：以与ALS相关的TAR DNA/RNA结合蛋白43 kDa的25 kDa羧基末端片段（TDP25）和超氧化物歧化酶1（SOD1）为研究对象。代表性结果表明，在小鼠神经母细胞瘤Neuro2a细胞裂解液的可溶性组分中，部分绿色荧光蛋白（GFP）标记的TDP25聚集体仍轻微存在。此外，携带ALS相关突变的GFP标记SOD1在活细胞中表现出更慢的扩散速度。因此，本文介绍了利用FCS通过蛋白质扩散特性来检测其聚集状态的操作流程。

我们在细胞裂解液中对GFP-TDP25以及在活细胞中对SOD1-G85R-GFP进行了FCS测量。在这两种情况下，均获得了正振幅且平滑的自相关曲线（ACF）。我们此前已证明，在指定条件下，Neuro2a细胞中表达的GFP-TDP25部分可在可溶性组分中回收6。在细胞裂解液的可溶性组分中，利用FCS在光子计数率记录中检测到极强的荧光分子信号（图2A，上方，箭头所示）。此类“尖峰（也称为爆发信号）”在GFP单体及单分散化学荧光染料溶液中均未观察到，提示这些尖峰代表寡聚化蛋白9。采用包含三重态的双组分三维扩散模型进行曲线拟合分析显示，快速扩散组分（DTFast = 186 μs）约占90%，其余10%的扩散时间为2.3 ms（图2A，下方；以及表2）。
在活细胞中进行 SOD1-G85R-GFP 测量时，光子计数率记录显...

本文介绍一种利用荧光相关光谱法在细胞裂解液和活细胞中检测蛋白质寡聚体及聚集物的实验方法。

蛋白质聚集是神经退行性疾病（如肌萎缩侧索硬化症（ALS）、阿尔茨海默病（AD）、帕金森病……）的标志性特征。

荧光相关光谱（FCS）的基本原理最初于20世纪70年代被提出。在20世纪90年代，通过与共聚焦显微镜装置相结合，FCS实现了多项重要且关键的改进。自那时起，FCS已被广泛应用于多种化学及病毒治疗领域，例如分子相互作用和蛋白质聚集分析。蛋白质聚集是神经退行性疾病的特征之一。荧光亮度反映了分子尺度下通过扩散特性所描述的单个粒子行为。在测量蛋白质聚集时，荧光亮度极为重要，因为它不仅可以确定分子的预期生命周期，还能区分同源或异源聚合。在此，我们介绍一种利用荧光相关光谱法（FCS）在细胞裂解液和活细胞中检测与肌萎缩侧索硬化相关的聚集态蛋白扩散的实验步骤。准备一个100毫米的塑料培养皿，其中培养有处于正常生长培养基中的Neuro2a细胞。确认细胞汇合度。移除培养基。向第三个 cartridge 培养皿中加入 3.5 毫升胰蛋白酶-EDTA 溶液，在 37 摄氏度下孵育 1 分钟。向培养皿中加入 9.5 毫升正常生长培养基并混悬细胞。将细胞悬液与台盼蓝混合，以染色死细胞。将悬液加入细胞计数板。使用细胞计数器或手动计数细胞数量。检测活细胞数量及其活力。用计数后的培养基将细胞稀释至每毫升1.0 × 10⁵个细胞。取2毫升细胞悬液加入35毫米塑料培养皿中，用于细胞裂解；或加入活细胞检测用的生长培养皿中。将培养皿在37摄氏度下孵育一天。第二天，制备质粒DNA与转染试剂的混合物。将转染混合物加入已计数细胞的培养基中，并将细胞孵育24小时。一天后，使用常规显微镜检测GFP表达。可以在细胞中观察到非常明亮的TDP25包涵体。细胞裂解应在生化实验台进行。移除培养皿中的培养基，加入2 mL 25 °C的PBS作为洗涤液。移除 PBS。将培养皿置于覆盖在碎冰上的铝板上。立即向培养皿中加入 200 微升裂解缓冲液。使用细胞刮刀刮取培养皿。将含有未溶解细胞碎片的裂解液收集到新的1.5毫米离心管中。在4°C下离心裂解液。进行活细胞测量时，测量前需更换为新鲜培养基。使用相差显微镜检查细胞贴壁情况，同时使用荧光显微镜检测GFP表达情况。使用共聚焦显微镜结合的FCS系统。打开488纳米激光器。使系统稳定至少30分钟。搭建光路。使用488纳米激光作为激发光源。使用合适的分束器和二向色镜。此外，还有荧光融合器。通常，我们会使用盖玻片腔室进行校准和溶液测量。小心地取用盖玻片腔室。将玻璃表面放置在镜头筛选纸上。倒入FCS校准液，同时加入罗丹明6G溶液。将超纯水加在物镜上。请勿使用油。将样本室置于显微镜载物台上。将载物台移动至适当位置。创建针孔调节并打开针孔调节向导。在对 x 方向的针孔进行粗调移动时，监测光子计数率。已正确确定最亮位置。接下来，通过微调移动监测光子计数率。最亮位置已成功确定，此即为 x 方向的针孔位置。同样地，搜索针孔在 y 方向上的最亮位置。y 方向的最亮位置也已成功确定。将针孔的 x 和 y 位置进行合并。最好在每天测量前调整针孔位置。当活体路径改变时，必须再次调整针孔位置。创建计数率并监测光子计数率。切换至 CPM 监测模式。调节所检测物体的校正环，使 CPM 值达到最高。关闭计数率窗口。首先测量罗丹明6G溶液。测量完成后，单击拟合以执行曲线拟合分析。为旧的关联函数选择一个拟合模型。对于罗丹明6G，选择包含三重态的单组分三维扩散模型。通过移动红线来设定拟合起始时间。点击“拟合全部”以开始拟合计算。检查拟合偏差。确保两侧分布对称且为负值，接近零。检查拟合值。确保扩散时间大致在20-30微秒范围内。此外，结构参数应在4到8之间。打开拟合面板，为测量选择一个模型。在拟合面板中，为样品模型输入相同的结构参数值，并确保类型设置为固定。检测细胞裂解液中的GFP-TDP25。将裂解液置于盖玻片腔室中。盖上盖子以防止裂解液干燥。放置载物台盖板以遮挡光线。在采集面板中，设置激光功率、测量时间及其重复次数。开始采集。观察到一个尖峰信号。再次观察到一个峰。该峰表明有明亮的分子通过了检测区域。峰的存在提示可溶性寡聚体或聚集体的存在。创建拟合以执行曲线拟合分析。选择包含三重态的双组分三维扩散模型。设置拟合起始时间。单击“全部拟合”。检查拟合值。在活细胞中对GFP标记的SOD1-G85R进行检测。与溶液测量不同，我建议使用加热台孵育器。将细胞培养皿放置在显微镜载物台上，使用目镜确认焦距和位置。选择一个测量细胞。使用快速扫描模式放大并调整细胞位置。使用慢速扫描模式获取细胞的图像快照。使用位置工具选择一个FCS测量位置。十字准线指示测量位置。开始测量。光子计数率记录的轻微下降表明GFP发生了光漂白。进行曲线拟合。图中显示了细胞裂解液中GFP-TDP25的代表性结果。上方的图表记录了光子计数率。有箭头的位置出现尖峰，表明存在可溶性寡聚体和聚集体。中间的图表表示传统的相关函数。灰色线条表示低且陈旧的相关函数。品红色线条表示拟合函数。虚线表示拟合的起始和结束时间。下方的表格显示了拟合值。接下来，展示了活细胞中 SOD1-G85R-GFP 的代表性结果。上方的图表表示我们的光子计数率记录。观察到记录的光子计数率逐渐下降，表明在不同测量中GFP存在光漂白现象。这是由于在活细胞中扩散速度较慢所致。中间的图表表示SOD1的旧相关函数。灰色线条显示较低的旧相关函数。品红色线条显示拟合函数。虚线表示拟合的起始和结束时间。下方的表格显示了拟合值。本文向您展示如何利用荧光相关光谱法（FCS）检测细胞裂解液中与每个细胞相关的TDP-25的扩散情况，以及活细胞中SOD1突变体的扩散情况。细胞裂解液中的可溶性寡聚体和聚集现象通常可观察为尖峰或爆发信号。另一方面，在活细胞中，除了一些明显的活体结构外，这类尖峰信号很少被观察到。突变型 SOD1 的缓慢扩散物种会增加单个颗粒的平均亮度，例如 SOD1 在细胞内的同源多聚化。此处展示的实验步骤简单且具有重要价值。FCS 不含辐射；处于直接的休眠状态。它只是你和我们共同的想象与共情。

detection-protein-aggregation-using-fluorescence-correlation

Research

科研

JoVE Journal

Biology

生物学

使用荧光相关光谱检测蛋白质聚合

在本视频中，我们展示了一种基于细胞的蛋白质聚集检测方法，该方法使用蛋白酶体抑制剂来阻断蛋白酶体活性，从而阻止与荧光标签融合的错误折叠突变蛋白发生泛素依赖性的蛋白酶体降解，导致这些蛋白在细胞质中积累。随后通过荧光显微镜对蛋白质聚集体进行可视化和定量分析。...

蛋白质聚集体形成检测：一种在蛋白酶体抑制剂诱导下检测和定量培养细胞中蛋白质聚集的方法

本视频展示了利用荧光涨落光谱法（FFS）研究蛋白质同源寡聚化的技术。在使用FFS研究蛋白质寡聚化时，样品中带有荧光标记的蛋白质会通过某种试剂诱导形成二聚体。利用共聚焦显微镜，当蛋白质分子进出微小的观测体积时，通过分析荧光分子亮度涨落的变化，可确定蛋白质的寡聚状态。...

荧光涨落光谱法研究蛋白质同源寡聚化

在本视频中，我们介绍了利用荧光各向异性技术研究荧光标记的Shwachman-Diamond综合征（SBDS）蛋白与延伸因子样1...

基于荧光各向异性的蛋白质-蛋白质相互作用检测

细胞存活能力依赖于对蛋白质错误折叠的及时且高效管理。本文介绍一种用于观察错误折叠蛋白质不同命运的方法：重折叠、降解或在包涵体中被隔离。我们展示了利用折叠传感器Ubc9ts，结合4D显微镜技术，在活细胞中监测蛋白质稳态及聚集质量控制的过程。...

活细胞中蛋白质聚集的4D成像

结合细胞表面靶受体的抗体可引起构象变化和受体聚集。这些动态变化对于表征靶细胞中药物开发具有重要意义。本方案利用共聚焦显微镜结合ImageJ/FIJI中的图像相关光谱学方法，定量分析细胞表面受体聚集的程度。...

共聚焦显微镜通过图像相关光谱法揭示细胞表面受体聚集现象

本方案描述了一种基于荧光涨落光谱的方法，用于研究介导细胞间相互作用的蛋白质之间的相互作用。 即...

一种用于检测细胞间接触处蛋白质-蛋白质相互作用的荧光涨落光谱分析方法

本文介绍了一种基于FRET的流式细胞术方案，用于定量分析酿酒酵母（S.

通过流式细胞术在体内检测和表征蛋白质自组装

我们描述了红外纳米光谱学和高分辨率原子力显微镜在可视化蛋白质自组装形成寡聚体聚集体和淀粉样纤维过程中的应用，该过程与多种人类神经退行性疾病的发病和发展密切相关。...

利用红外纳米光谱与原子力显微镜表征单个蛋白质聚集体

时间分辨单分子蛋白质诱导荧光增强是一种有用的荧光光谱邻近传感器，可灵敏检测蛋白质局部结构变化。本文展示了该方法可用于揭示α-突触核蛋白中稳定的局部构象，而使用长程FRET标尺测量时，该蛋白通常被认为呈球状无序且不稳定。...

利用时间分辨的蛋白质诱导荧光增强技术逐个识别单个α-突触核蛋白单体的稳定局部构象

我们介绍了一种实验方案和数据分析流程，用于在活细胞中结合现代荧光标记技术，开展活细胞双色荧光互相关光谱（FCCS）与荧光共振能量转移（FRET）联用研究膜受体动力学。...

双色荧光交叉相关光谱法研究活细胞中蛋白质-蛋白质相互作用及蛋白质动力学

本方案描述了一种检测化合物与蛋白质分子结合的独特方法，具有蛋白质样品损耗极小和数据准确性高的优势。...

通过差示扫描荧光法检测CD40蛋白与伞形酮的相互作用

学习使用荧光相关光谱技术检测蛋白质聚合的方法，该方法适用于细胞裂解液和活细胞中的ALS相关蛋白TDP25和突变SOD1。该技术可分析蛋白质扩散特性并区分单体与聚集体，为神经退行性疾病研究提供标准化方案。

使用荧光相关光谱法检测蛋白质聚集

探索更多视频