使用荧光相关光谱检测蛋白质聚合

荧光相关光谱的最佳原理FCS最初是在20世纪70年代发明的。在20世纪90年代，通过与共焦仪器显微镜相结合，对FCS建立了重要和许多改进。自那时以来，FCS 已用于许多化学和病毒治疗应用，如分子相互作用和蛋白质聚合分析。

蛋白质聚集是神经退行性疾病的标志。荧光亮度是分子大小的单粒子，由扩散特性解释。它对于测量蛋白质聚合非常重要，因为它可以确定分子的预计生命周期，还可以区分同质化或异质聚合。

在这里，我们介绍了一个程序，以测量与聚合形式蛋白相关的肌萎缩性侧索硬化症的扩散，使用FCS在细胞裂解剂和活细胞。准备100毫米塑料盘生长神经2a细胞舒适地坐在正常的生长介质。确认细胞的汇流。

删除介质。将 3.5 毫升的 Trypsin-EDTA 溶液添加到第三个墨盒盘中，并在 37 摄氏度下孵育一分钟。将 9.5 毫升的正常生长介质加入菜中并暂停。

细胞悬架与尝试盘蓝色混合，以染色死细胞。将悬架添加到单元计数幻灯片中。使用细胞计数器或手动计算细胞数量。

检查活细胞编号及其生存能力。将计数介质中的细胞稀释为 1.0 倍 10 到每毫升 5 的功率。在 35 毫米塑料盘中加入两毫升细胞悬浮，用于细胞裂解或生长空间盘，用于活细胞测量。

在37摄氏度下孵化这道菜一天。第二天，准备质粒DNA和转染试剂的混合物。将转染混合物添加到细胞计数介质中，并孵育细胞 24 小时。

一天后使用常规显微镜检查 GFP 表达式。你可以看到细胞中非常明亮的TDP25成分体。

细胞裂解应在生化台进行。取出盘中的介质。在 25 摄氏度下加入两毫升 PBS，作为介质清洗。

删除 PBS。将盘子放在碎冰顶部的铝板上。立即将 200 微滑解缓冲器添加到菜中。

用细胞刮刀刮盘子。在新的1.5毫米管中用未溶解的细胞碎片回收溶解物。在摄氏四度的离心解体。

对于活细胞测量，在测量前用新的介质替换介质。使用相位对比显微镜检查细胞附件。此外，使用荧光显微镜检查 GFP 表达式。

使用共焦显微镜组合FCS系统。打开488纳米激光。稳定系统至少30分钟。

设置光学路径。使用 488 纳米激光进行即时照明。使用适当的光束分路器和分光计。

还有荧光保险丝通常，我们将使用盖玻璃室进行校准和溶液测量。小心，拿盖玻璃室。

将玻璃表面放在透镜筛选纸上。倒入FCS校准。在中加入罗达明 6G 解决方案。

在目标上加入超纯水。不要使用油。将腔室设置在显微镜舞台上。

将舞台移动到适当的位置。创建针孔调整并打开针孔调整向导。监控光子计数速率，作为 x 方向针孔的粗移动。

最亮的位置是正确确定的。接下来，将光人计数率监控为精细运动。最亮的位置被成功确定这是 x 方向的针孔位置。

同样，搜索针孔最亮的位置以查找 y 方向。y 方向最亮的位置也成功确定。复合针孔的 x 和 y 位置。

最好在每天测量前调整针孔位置。更改实时路径时，必须再次调整针孔位置。创建计数速率并监控电话计数速率。

更改为 CPM 监控模式。计算您运行的对象的校正环，以便 CPM 值最高。关闭计数速率窗口。

从罗达明 6G 解决方案测量开始。测量完成后，单击适合执行曲线拟合分析。选择一个模型来安装旧的相关函数。

对于罗达明 6G，选择具有三胞胎状态的 1 组件、3 维扩散模型。通过移动红线设置合适的启动时间。单击"适合所有人"，开始安装计算。

检查拟合偏差。确保双方被张贴和负，大约为零。检查合适的值。

确保扩散时间大致在 20-30 微秒之间。此外，结构参数为 4 到 8。打开拟合面板，并选择测量模型。

在拟合面板中输入模型中样本的相同结构参数值。确保类型应设置为固定。GFP-TDP25在细胞测得。

将利萨特放在盖玻璃室中。放置盖子以避免赖酸干涸。将舞台盖放在浅色阴影上。

在采集面板中，设置激光功率、测量时间及其重复性。开始收购。观察到一个尖峰。

再次观察到尖峰。尖峰表示通过检测体的明亮分子。尖峰表示可溶性寡头或聚合物。

创建适合执行曲线拟合分析。选择具有三元状态的 2 组件三维扩散模型。设置合适的开始时间。

单击"适合所有"。检查合适的值。SOD1-G85R 在活细胞中标有 GFP 测量标签。

与溶液测量不同，我建议使用热阶段孵化器。将细胞培养盘设置在显微镜舞台上。使用眼部确认焦点和位置。

选择测量单元。使用快速扫描模式放大和调整单元位置。使用慢速扫描速度模式获取单元格快照。

使用位置工具选择 FCS 测量位置。十字线表示测量位置。开始测量。

光子计数率记录的轻微下降表明GFP的光漂白。执行曲线拟合。显示了细胞糖酸盐中GFP-TDP25的代表性结果。

上图记录了光子计数速率。箭头的位置是尖峰，表示可溶性寡头和聚合物。中间图表示旧的相关函数。

灰色线显示低、旧相关函数。洋红色线显示安装的功能。虚线表示安装的开始和结束时间。

下表显示拟合值。接下来，在活细胞中显示 SOD1-G85R-GFP 的代表性结果。上图表示我们光子计数率的记录。

记录的光子计数率逐渐下降，表明不同测量的GFP增长的光漂白。这是因为活细胞的扩散速度很慢。中间图表示 SOD1 的旧相关函数。

灰色线显示低、旧相关函数。洋红色线显示安装的功能。虚线表示适合的开始和结束时间。

下表显示合适的值。在这里，我们向您展示此程序，以测量来自细胞裂解液中每个细胞相关 TDP-25 的扩散，以及使用 FCS 在活细胞中 SOD1 的一切突变。细胞裂解物中的可溶性寡聚物和聚合通常可观察到尖峰或爆裂。

另一方面，在活细胞中，除了可能明显的活体结构外，很少观察到这种尖峰。变异SAD1的缓慢扩散物种为我们内部的单个粒子（如SAD1均匀化）增加了均值亮度。此处显示的程序简单且值得。

FCS不含辐射，直接处于休眠状态。这只是你和我们的想象力的同理心。